BPI－Fc重组蛋白的高效生产方法及其应用的制作方法

专利名称：BPI－Fc重组蛋白的高效生产方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域重组蛋白的高效生产方法及其应用。
细菌耐药是临床抗感染治疗中遇到的最为严重和棘手的问题，迄今尚未获得有效的解决办法。来自临床的研究报导指出，感染患者中约半数以上为革兰氏阴性(G-)菌感染，其中发展为G-菌败血症(GNS)引起休克死亡的比率也相对较高[Dahlberg PS,Acton RD and Battafarano RJ.J Surg Res.63:44-8(1996)]。目前传统抗菌素治疗[Verhoef J,Hustinx WM,Frase H and Hoepelman AI.J AntimicrobChemother.38(2):167-82(1996)]和采用抗脂多糖类脂A/内核心单克隆抗体或抗IL-1/TNF单克隆抗体进行免疫治疗[Mccloskey RU,Straube RC,Sander C et al.Ann Intern Med.121:1(1994)]，效果均不理想。
杀菌/渗透增强蛋白(Bactericidal/Permeability Increasing Protein,BPI)是在多形核白细胞中发现的一种56kd的阳离子抗菌糖蛋白[Weiss J,Elsbach P and OlsonI et al.J Biol Chem.253:2664-72(1978)]，随后重组BPI及其N端功能片段相继研制成功[Gazzano-Santoro et al,Infect.Immun.60:4754-4761(1992)]。研究表明，上述重组蛋白与天然BPI具有完全相同的生物功能，即对细菌脂多糖和类脂A有很高的亲合力，它们不仅能非特异性杀伤G-菌，并可中和其内毒素，具有广阔的临床应用前景[Liu Y,Ammons WS and Leach WJ et al.Shock.2:324-31(1994)]。但初步应用结果表明，重组BPI及其N端功能片段作为抗感染生物制剂，易被蛋白酶降解而不稳定，在体内血清半衰期短(小于60分钟)，因而影响其临床疗效[Robert JB,Kenneth D and Nneka OI et al.Pharm-Res.14(2):224-9(1997)]。
Ig样重组蛋白是应用基因工程技术产生的由某种蛋白或功能多肽片段与免疫球蛋白(Ig)或其重链恒定区(Fc)片段嵌合组成的杂合蛋白，它不仅不易被蛋白酶降解、稳定性好、在血清中半衰期长，而且具有该种蛋白或功能多肽所特有的生物功能，并具有免疫球蛋白的激活补体和调理作用等特性[Hodges TL.et al.Antimicro-Agonts-Chemother.35:2580-2586.(1991)]。由BPI或其N端功能片段与免疫球蛋白Fc片段或其等位体嵌合组成的Ig样重组蛋白(称为BPI-Fc)，在具备较好稳定性和较长血清半衰期的同时，具有BPI广谱杀伤G-菌和中和内毒素作用，并可通过Fc激活补体和调理作用增强BPI的杀菌作用，是一种理想的新型非抗生素类抗感染生物制剂。
Ig样重组蛋白具有分子较大、二硫键多、结构和功能复杂等特点，一般均采用真核表达系统表达，以便通过糖基化修饰和自然折叠，产生具有天然蛋白或其功能片段生物功能的糖基化重组蛋白；但真核表达系统存在表达量低、成本高等问题，因而影响其实际应用。BPI或其功能片段和Fc片段上均有糖基化位点[Gray PW.et al.J Biol Chem.264:9505-9509.(1989)]，而原核宿主细胞不对表达的蛋白进行糖基化修饰，迄今未见采用原核表达系统生产BPI-Fc重组蛋白的报导。但原核表达系统具有表达量高、成本低等优势。
本发明的目的是提供一种采用原核表达系统表达BPI-Fc重组蛋白的高效生产方法。
本发明的技术方案为一种BPI-Fc重组蛋白的高效生产方法，包括以下步骤(1)、构建BPI-Fc嵌合基因表达载体；(2)、BPI-Fc重组蛋白在原核宿主细胞中表达。
所述表达载体是包含由BPI或其功能片段基因和免疫球蛋白重链恒定区Fc或其等位体基因嵌合组成的BPI-Fc嵌合基因，并能在原核宿主细胞中表达BPI-Fc重组蛋白的DNA。
所述BPI-Fc嵌合基因为BPI-Fcγ1嵌合基因，由BPI1-199功能片段基因和人IgG1重链恒定区Fcγ1基因嵌合组成，其中连接5’端BPI1-199功能片段基因与3’端Fcγ1基因的铰链区核苷酸序列描述为5’…GAAGCTTCTAC…3’；在5’端BPI1-199功能片段基因前加入含EcoRⅠ位点和起始密码ATG的核苷酸序列为5’GAATTCATG 3’；在3’端Fcγ1基因后采用TAA作为终止密码。
所述的在原核宿主细胞中表达是将表达载体转化原核宿主细胞并诱导表达BPI-Fc重组蛋白。
所述原核宿主细胞为大肠杆菌。
所述大肠杆菌为E.coli DH5α。
BPI-Fc重组蛋白在原核宿主细胞中表达后，用亲和层析方法提纯BPI-Fc重组蛋白。
本发明的另一个目的是提供一种高效生产BPI-Fc重组蛋白的表达载体。
本发明的这一目的是这样实现的一种高效生产BPI-Fc重组蛋白的表达载体，它是包含由BPI或其功能片段基因和免疫球蛋白重链恒定区Fc或其等位体基因嵌合组成的BPI-Fc嵌合基因，并能在原核宿主细胞中表达BPI-Fc重组蛋白的DNA。
所述的BPI-Fc嵌合基因为BPI-Fcγ1嵌合基因；所述的BPI-Fcγ1嵌合基因由BPI1-199功能片段基因和人IgG1重链恒定区Fcγ1基因嵌合组成，其中连接5’端BPI1-199功能片段基因与3’端Fcγ1基因的铰链区核苷酸序列描述为5’…GAAGCTTCTAC…3’。
所述BPI-Fcγ1嵌合基因编码的BPI-Fcγ1重组蛋白N端BPI1-199功能片段与C端Fcγ1片段的铰链区氨基酸序列描述为…:EAS:TCPPCPAPELL…。
所述BPI-Fcγ1嵌合基因中在5’端BPI1-199功能片段基因前加入含EcoRⅠ位点和起始密码ATG的核苷酸序列为5’GAATTCATG3’。
所述BPI-Fcγ1嵌合基因在3’端Fcγ1基因后采用TAA作为终止密码。
本发明应用基因工程技术在原核宿主细胞中高效表达了BPI-Fc重组蛋白，表达产生的重组蛋白是非糖基化重组蛋白，经实验验证，首次发现原核表达系统表达产生的非糖基化BPI-Fc重组蛋白具有BPI的生物功能和Fc的生物功能，可通过激活补体和调理作用极大增强杀伤G-菌的作用。因此本发明对研制新型高效抗感染生物制剂具有重要价值，在制药行业具有广阔的应用前景。
下面结合附图对本发明作进一步说明。


图1为Sepharose CL-4B Protein A亲和层析提纯BPI-Fcγ1的单一洗脱峰图2为亲和层析纯化的BPI-Fcγ1的SDS-PAGE电泳分析图3表示补体对BPI-Fcγ1重组蛋白杀伤G-菌的增强作用图4表示白细胞对BPI-Fcγ1重组蛋白杀伤G-菌的增强作用实施例一、BPI功能片段基因和Fcγ1片段基因的克隆1．BPI功能片段基因的克隆从早幼粒细胞白血病HL-6细胞系(ATCCCCL240)中提取mRNA，用设计合成的人BPI基因引物(P1 5’CAGAATTCATGGTCAACCCTGGCGTCGTG3’和P2 5’GCAAGCTTCTATTTTGGTCATTACTGGCAG3’)进行RT-PCR扩增(48℃逆转录45分钟后进行35个循环PCR扩增，循环参数为94℃变性30秒、53.5℃复性40秒、72℃延伸45秒)，得到约620bp的BPI基因片段BPI620；用EcoRⅠ/Hind Ⅲ双酶切BPI620得到约200bp的BPI基因片段BPI200(EcoRⅠ/EcoRⅠ粘性末端)和约420bp的BPI基因片段BPI420(EcoRⅠ/HindⅢ粘性末端)；按照分子克隆操作方法[Sambrook J.et al.Molecular cloning:alaboratory manual,second edition,1989,Cold Spring Harbor Laboratory,NewYork.]，将BPI200和BPI420分别克隆到PUC18质粒的EcoRⅠ位点和EcoRⅠ/HindⅢ双酶切位点上得到PUC18-BPI200和PUC18-BPI420。
2．Fcγ1片段基因的克隆从正常人外周血白细胞中提取mRNA，用设计合成的人IgG1的Fcγ1片段基因引物(P3 5’GTAAGCTTCTACATGCCCACCGTGCCCAG3’和P4 5’TCGGATCCTTATTTACCCGGAGACAGGGAG3’)进行RT-PCR扩增(48℃逆转录45分钟后进行35个循环PCR扩增，循环参数为94℃变性30秒、56℃复性40秒、72℃延伸45秒)，得到约700bp的Fcγ1基因片段Fcγ1700；Fcγ1700经HindⅢ/BamHⅠ双酶切后克隆到PUC18的HindⅢ/BamHⅠ双酶切位点上得到PUC18-Fcγ1700。
二、pBV-BPI-Fcγ1表达载体的构建按照分子克隆操作方法，把PUC18-BPI420上的EcoRⅠ/HindⅢ双酶切片段BPI420和PUC18-Fcγ1700上的HindⅢ/BamHⅠ双酶切片段Fcγ1700共连接到pBV220表达载体[张智清等.病毒学报，6:111,(1990)]的EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切位点上，得到表达载体中间体pBV-BPI420-Fcγ1；再把PUC18-BPI200上的EcoRⅠ酶切片段BPI200连接插入到pBV-BPI420-Fcγ1的EcoRⅠ位点上，筛选得到正向插入BPI-Fcγ1嵌合基因的表达载体pBV-BPI-Fcγ1。经过双脱氧核苷酸末端终止法测序，构建于pBV-BPI-Fcγ1上的BPI-Fcγ1嵌合基因的读码框架准确无误；其中连接5’端BPI1-199功能片段基因与3’端Fcγ1基因的铰链区(hinge)核苷酸序列描述为5’…GAAGCTTCTAC…3’，对应位置的BPI-Fcγ1重组蛋白铰链区(hinge)的氨基酸序列描述为…:EAS:TCPPCPAPELL…；在5’端BPI1-199功能片段基因前加入含EcoRⅠ位点和起始密码ATG的核苷酸序列为5’GAATTCATG3’；在3端’Fcγ1基因后含采用的TAA终止密码和加入的BamHⅠ位点的序列为5’TAAGGATCC3’。
三、BPI-Fcγ1重组蛋白在E.coli中高效表达把表达载体pBV-BPI-Fcγ1转化原核宿主细胞E.coli DH5α[基因型supE44*lacU169(Ф801acⅠ M15)hsdR17 recA1 end A1 gyrA96 thi-1 relA1](保藏号CGMCC No.0450)，在30℃ LB培养基中培养至OD值约0.4-0.6时，立即转入42℃中温控诱导表达，6小时后离心收集细菌；细菌经裂解后进行SDS-PAGE电泳分析，经薄层扫描凝胶分析，BPI-Fcγ1的表达量达菌体总蛋白的25％。所用的大肠杆菌宿主细胞也可以是其它的大肠杆菌品种(如E.coli HB101、JM109等)。
四、BPI-Fcγ1重组蛋白的提纯超声破碎诱导表达后离心收集的菌体，经洗涤、离心收集包涵体沉淀；把包涵体溶于含8M尿素的裂解液中，进行Sephadex G-100凝胶层析初步提取，收集BPI-Fcγ1重组蛋白洗脱峰；将洗脱峰分步稀释并在含5mM还原型谷胱甘肽/2mM氧化型谷胱甘肽复性液中复性；用Sepharose CL-4B Protein A亲和层析提纯复性的BPI-Fcγ1重组蛋白，如
图1所示，得到并收集重组蛋白单一洗脱峰1；经SDS-PAGE电泳分析，如图2所示，纯化的非糖基化BPI-Fcγ1重组蛋白在还原条件下为单-48kd谱带2。同时，还可以利用Fc片段亲和结合特性，应用其它亲和层析介质的亲和层析方法提纯BPI-Fc重组蛋白。
五、BPI-Fcγ1重组蛋白的ELISA分析1．抗BPI抗体对BPI-Fcγ1重组蛋白的鉴定取100μl不同稀释度的BPI-Fcγ1包被聚苯乙烯板，4℃过夜；洗涤，各孔加入100μl免抗人BPI抗体，37℃作用30分钟；洗涤，各孔加入100μl HRP标记的羊抗兔IgG抗体，37℃作用30分钟；洗涤，加入100μlTMB底物，37℃作用10分钟后，加入50μl终止液终止反应，测OD值(450nm)。试验用Anti-BPI EIA Kit(Lot:030361,THE BINDING SITE,Birmingham,UK)中的BPI COATED WELLS(Code:EA141)作为阳性对照。结果表明抗BPI抗体可特异性结合BPI-Fcγ1重组蛋白(表1)，证实该重组蛋白具有BPI结构。
表1
2．抗Fcγ1抗体对BPI-Fcγ1重组蛋白的鉴定用100μl兔抗人BPI抗体包被聚苯乙烯板，4℃过夜；洗涤，各孔加入100μl不同稀释度的BPI-Fcγ1,37℃作用30分钟；洗涤，各孔加入100μlHRP标记的羊抗人IgG抗体，37℃作用30分钟；洗涤，加入100μlTMB底物，37℃作用10分钟后，加入50μl终止液终止反应，测OD值(450nm)。试验用稀释人血清作为阳性对照。结果表明抗Fcγ1抗体可特异性结合BPI-Fcγ1重组蛋白(表2)，证实该重组蛋白具有Fcγ1结构。
表2
六、BPI-Fcγ1重组蛋白对LPS的中和作用用50μl不同稀释度的BPI-Fcγ1与50μl(1 Eu/ml)纯化LPS混匀，37℃水浴60分钟；加入50μl鲎试剂混匀，37℃水浴25分钟；加入50μl显色基质鲎三肽混匀，37℃水浴3分钟；再加入偶氮试剂混匀显色，测OD值(545nm)。同时设阳性对照(只含LPS，不含BPI-Fcγ1)和阴性对照(只含BPI-Fcγ1，不含LPS)。结果表明OD值与BPI-Fcγ1含量呈负相关(表3)，证实该重组蛋白具有中和内毒素的作用。
表3
七、补体对BPI-Fcγ1重组蛋白杀伤G-菌的增强作用本试验用E.coli(CMCC No.44101)作为杀伤靶细菌，按104/ml配成菌液。本试验分为四组，即细菌对照组、补体对照组、重组蛋白对照组和重组蛋白加补体试验组。细菌对照组取100μl菌液加100μl生理盐水混匀，37℃水浴1小时，菌液均匀涂布四块平板(50μl/平板)，37℃16小时，菌落计数。补体对照组取100μl菌液与100μl豚鼠新鲜血清混匀，37℃水浴1小时，菌液均匀涂布四块平板(50μl/平板)，37℃16小时，菌落计数。重组蛋白对照组取100μl菌液分别与100μl不同稀释度BPI-Fcγ1混匀，37℃水浴16小时，每管菌液均匀涂布四块平板(50μl/平板)，37℃16小时，菌落计数。重组蛋白加补体试验组取100μl菌液分别与100μl不同稀释度BPI-Fcγ1混匀，37℃水浴16小时，每管各加100μl豚鼠新鲜血清混匀，37℃水浴1小时，每管菌液均匀涂布四块平板(50μl/平板)，37℃16小时，菌落计数。结果表明在补体参与下，可极大增强BPI-Fcγ1重组蛋白对细菌的杀伤作用。如图3所示，横坐标为重组蛋白浓度(μg/ml)，纵坐标为菌落数，3为细菌对照组，4为补体对照组，5、7、9、11为重组蛋白对照组，6、8、10、12为重组蛋白加补体试验组。
八、白细胞对BPI-Fcγ1重组蛋白杀伤G-菌的增强作用本试验用E.coli(CMCC No.44101)作为杀伤靶细菌，按104/ml配成菌液。试验分为四组，即细菌对照组、白细胞对照组、重组蛋白对照组和重组蛋白加白细胞试验组。细菌对照组取100μl菌液加100μl生理盐水混匀，37℃水浴1小时，菌液均匀涂布四块平板(50μl/平板)，37℃16小时，菌落计数。白细胞对照组取100μl菌液与100μl白细胞(105/ml)混匀，37℃水浴1小时，菌液均匀涂布四块平板(50μl/平板)，37℃16小时，菌落计数。重组蛋白对照组取100μl菌液分别与100μl不同稀释度BPI-Fcγ1混匀，37℃水浴3小时，每管菌液均匀涂布四块平板(50μl/平板)，37℃16小时，菌落计数。重组蛋白加白细胞试验组取100μl菌液分别与100μl不同稀释度BPI-Fcγ1混匀，37℃水浴3小时，每管各加100μl白细胞(105/ml)混匀，37℃水浴1小时，每管菌液均匀涂布四块平板(50μl/平板)，37℃16小时，菌落计数。结果表明在白细胞参与下，可极大增强BPI-Fcγ1重组蛋白对细菌的杀伤作用。如图4所示，横坐标为重组蛋白浓度(μg/ml)，纵坐标为菌落数，13为细菌对照组，14为自细胞对照组，15、17、19为重组蛋白对照组，16、18、20为重组蛋白加白细胞试验组。
本发明表明，非糖基化BPI-Fcγ1重组蛋白具有BPI和Fc的结构和生物功能。采用原核表达系统表达产生由BPI或其N端功能片段(包含BPI N端功能片段中的糖基化位点)与各种免疫球蛋白(如IgG其它亚型，IgA,IgM等)Fc片段或其等位体嵌合组成的BPI-Fc重组蛋白时，同样可以产生具有BPI的结构和生物功能并具备Ig样重组蛋白不易被蛋白酶降解、稳定性好、在血清中半衰期长等特性的非糖基化BPI-Fc重组蛋白，对研制新型高效的BPI抗感染生物制剂、改善BPI作为抗感染生物制剂的临床疗效具有重要价值；因此，嵌合组成BPI-Fc重组蛋白的BPI或其N端功能片段和各种免疫球蛋白Fc片段或其等位体适用于本发明。再者，原核宿主细胞不对表达的蛋白进行糖基化修饰，同理，应用各种原核宿主细胞(如枯草杆菌、格氏链球菌等)均可表达产生有生物功能的非糖基化BPI-Fc重组蛋白；因此，各种原核表达系统的原核宿主细胞和对应的可稳定转化并表达BPI-Fc重组蛋白的表达载体及其构建方法也适用于本发明。
权利要求
1.一种BPI-Fc重组蛋白的高效生产方法，包括以下步骤(1)、构建BPI-Fc嵌合基因表达载体；(2)、BPI-Fc重组蛋白在原核宿主细胞中表达。
2.根据权利要求1所述的一种BPI-Fc重组蛋白的高效生产方法，其特征在于所述表达载体是包含由BPI或其功能片段基因和免疫球蛋白重链恒定区Fc或其等位体基因嵌合组成的BPI-Fc嵌合基因，并能在原核宿主细胞中表达BPI-Fc重组蛋白的DNA。
3.根据权利要求2所述的一种BPI-Fc重组蛋白的高效生产方法，其特征在于所述BPI-Fc嵌合基因为BPI-Fcγ1嵌合基因，由BPI1-199功能片段基因和人IgG1重链恒定区Fcγ1基因嵌合组成，其中连接5’端BPI1-199功能片段基因与3’端Fcγ1基因的铰链区核苷酸序列描述为5’…GAAGCTTCTAC…3’；在5’端BPI1-199功能片段基因前加入含EcoRⅠ位点和起始密码ATG的核苷酸序列为5’GAATTCATG3’；在3’端Fcγ1基因后采用TAA作为终止密码。
4.根据权利要求1所述的一种BPI-Fc重组蛋白的高效生产方法，其特征在于所述的在原核宿主细胞中表达是将表达载体转化原核宿主细胞并诱导表达BPI-Fc重组蛋白。
5.根据权利要求4所述的一种BPI-Fc重组蛋白的高效生产方法，其特征在于所述原核宿主细胞为大肠杆菌。
6.根据权利要求5所述的一种BPI-Fc重组蛋白的高效生产方法，其特征在于所述大肠杆菌为E.coli DH5α。
7.根据权利要求1所述的一种BPI-Fc重组蛋白的高效生产方法，其特征在于BPI-Fc重组蛋白在原核宿主细胞中表达后，用亲和层析方法提纯BPI-Fc重组蛋白。
8.一种高效生产BPI-Fc重组蛋白的表达载体，其特征在于它是包含由BPI或其功能片段基因和免疫球蛋白重链恒定区Fc或其等位体基因嵌合组成的BPI-Fc嵌合基因，并能在原核宿主细胞中表达BPI-Fc重组蛋白的DNA。
9.根据权利要求8所述的一种高效生产BPI-Fc重组蛋白的表达载体，其特征在于所述的BPI-Fc嵌合基因为BPI-Fcγ1嵌合基因；所述的BPI-Fcγ1嵌合基因由BPI1-199功能片段基因和人IgG1重链恒定区Fcγ1基因嵌合组成，其中连接5’端BPI1-199功能片段基因与3’端Fcγ1基因的铰链区核苷酸序列描述为5’…GAAGCTTCTAC…3’。
10.根据权利要求9所述的一种高效生产BPI-Fc重组蛋白中的表达载体，其特征在于所述BPI-Fcγ1嵌合基因编码的BPI-Fcγ1重组蛋白N端BPI1-199功能片段与C端Fcγ1片段的铰链区氨基酸序列描述为…:EAS:TCPPCPAPELL…。
11.根据权利要求9所述的一种高效生产BPI-Fe重组蛋白的表达载体，其特征在于所述BPI-Fcγ1嵌合基因中在5’端BPI1-199功能片段基因前加入含EcoRⅠ位点和起始密码ATG的核苷酸序列为5’GAATTCATG3’。
12.根据权利要求9或11所述的一种高效生产BPI-Fc重组蛋白的表达载体，其特征在于所述BPI-Fcγ1嵌合基因在3’端Fcγ1基因后采用TAA作为终止密码。
13.权利要求1所述的方法在制药中的应用。
14.权利要求8所述的表达载体在制药中的应用。
全文摘要
本发明公开了采用原核表达系统表达由杀菌/渗透性增强蛋白(BPI)与免疫球蛋白重链恒定区(Fc)嵌合组成的BPI－Fc重组蛋白的高效生产方法,包括(1)、构建BPI－Fc嵌合基因表达载体;(2)、BPI－Fc重组蛋白在原核宿主细胞中表达;本发明还公开了在原核表达系统表达BPI－Fcγ1重组蛋白过程中的特异表达载体;本发明对研制新型高效抗感染生物制剂具有重要价值,在制药行业具有广阔的应用前景。
文档编号C12N15/62GK1324803SQ00107590
公开日2001年12月5日 申请日期2000年5月22日 优先权日2000年5月22日
发明者安云庆, 陈金栋 申请人:首都医科大学, 陈金栋