一种通过用种间核转移技术生产人类克隆胚胎的方法

专利名称：一种通过用种间核转移技术生产人类克隆胚胎的方法
技术领域：
本发明的背景技术发明领域本发明涉及一种用种间核转移技术生产人类克隆胚胎的方法，更具体地说，涉及一种用种间核转移技术生产人类克隆胚胎的方法，该方法把从人类组织得到的体细胞的胞核转移到来源于牛的成熟卵母细胞中。本发明还涉及由上述方法生产的人类克隆胚胎。
背景技术：
人们长期考虑用受精生产动物，这涉及到雌雄配子。然而人们已经进行了巨大的努力产生具有相同的外貌和相同的遗传特征的克隆动物。
由于生物技术和基因工程的发展，最近已经成功地生产出具有所希望的有用作物特征的各种基因重组植物(见Schweizer等，PlantJournal,20541-552,1999)。在动物方面，有许多克隆动物的成功例，包括克隆羊(见Wilmut等，自然，385:810-813,1997)、克隆牛(见Wells等，Reprod.Fertil.And Develop.,10:369-378,1998)和克隆小鼠(见Wakayama等，自然，394:369-374,1998)。因为没有建立在生物技术上的高技术就不可能实现克隆动物的生产，人们把评估该技术在相关领域内的技术发展作为一个标准。
同时因为动物的干细胞有发育成每个器官的潜能，促使人们通过得到和培养它们研究其分化成各种器官的机制。进行这种研究时，重要的是采用具有相同的组织特异性的材料，以减少许多不同的研究中的差异。然而，显然并不是总可以得到具有相同的组织特异性的适宜材料。虽然近来采用体细胞的克隆技术便利了提供具有相同的组织特异性的材料，但是对于人类组织还不令人满意。
在此情况下，有强烈的需要，开发一种得到具有相同的组织特异性的人胚干细胞。
发明概述根据本发明，我们发现可以通过种间核转移技术成功地产生人胚干细胞类，种间核转移技术涉及融合牛的卵母细胞和用人类皮肤细胞，然后在体外把人类克隆胚胎培养到桑椹胚/胚泡阶段。
因此本发明的首要目的是提供一种通过种间核转移技术生产人类克隆胚胎的方法。
本发明的另一个目的是通过所述方法提供人类克隆胚胎。
附图的简要说明由以下描述结合附图会清楚了解本发明的上述目的和其它目的及本发明的特征，图中


图1为供体体细胞的照片。
图2是一张照片，表示用一根持定(细玻璃)管和一根切割(细玻璃)管切割受体卵母细胞的透明带的过程。
图3是一张照片，表示通过从受体卵母细胞取走第一极体和胞核进行去核的过程。
图4是一张照片，表示用一根持定管和一根注射管把体细胞移入去核的卵母细胞的过程。
本发明的详细描述本发明生产人类克隆胚胎的方法包含以下步骤制备从人体采集的供体体细胞系；体外将从牛卵巢采集到的卵母细胞培育成熟；去掉卵母细胞周围的丘细胞，切割成熟的卵母细胞的透明带的一部分并且挤出部分包括第一极体的胞质，以得到去核受体卵母细胞；通过把供体细胞注射进去核卵母细胞而把核移入受体的卵母细胞，然后通过随后的电融合和激活电融合后的细胞得到胚胎；后激活并且在体外培养胚胎。
本发明的生产人类克隆胚胎的方法进一步说明如下。步骤1制备供体细胞把从人体采集的体细胞系制备成供体细胞尽管没有限制从人体采集什么细胞作供体细胞，但优选的细胞系包括皮肤细胞或者从新生儿脐带采集的成纤维细胞。更优选的用作体细胞的细胞系是从皮肤组织分离的皮肤细胞。可使用常规的已知的方法稍加改动后，制备所述细胞系(Mather＆Barnes，细胞生物学方法，第57卷，动物细胞培养方法，Academic Press，1998)。
例如，清洗和粉碎皮肤细胞或者新生儿脐带的成纤维细胞。然后，用胰蛋白酶及Ⅱ型胶原蛋白酶在39℃、5％的CO2的环境下处理这些细胞，然后在补充了非必需氨基酸、10％的胎牛血清(FBS)和1％青霉素-链霉素的Dulbecco’s氏改进的Eagle氏介质(DMEM)中，在与上述相同的环境下培养。
体细胞系由传代培养、血清饥饿培养或者冷冻方法储存。供体细胞系的传代培养定期地通过在胰蛋白酶处理后用新的培养基代替旧的培养基来进行。血清饥饿培养通过施用补充0.5％FBS的DMEM以Wilmut等的方法进行(见Wilmut等，自然，386:810-813,1997)。这样储存的细胞系在后面的步骤中用作供体细胞。步骤2制备受体卵母细胞在体外将从牛卵巢采集的不成熟的卵母细胞培育成熟从含有10mM N-羟乙基哌嗪-N′-[2-乙基磺酸](HEPES)的TCM199清洗介质中的卵巢中选择不成熟的卵母细胞，然后在补充了雌二醇、FSH(促卵泡激素)和FBS的TCM199培养介质(含丙酮酸钠青霉素-链霉素)中在39℃、5％的CO2的环境下培养16至22小时使上述卵母细胞成熟。步骤3受体卵母细胞的去核去掉成熟的受体卵母细胞周围的丘细胞并且切除卵母细胞的部分透明带之后，从卵母细胞中去掉部分包括第一极体的胞质，以得到去核的卵母细胞首先用一个剥脱管从含有透明质酸酶的TCM199清洗介质中物理地去掉成熟的卵母细胞周围的丘细胞。然后用TCM199清洗介质清洗剥脱了的卵母细胞，并且把它们移入细胞松驰素B溶液。为了对剥脱的细胞去核，用一根切割管穿刺剥脱了的卵母细胞的透明区的一部分，以得到一个裂口，从此裂口可以把包括第一极体的10％到15％的胞质从卵母细胞挤出。清洗去核的卵母细胞，并且在TCM199培养介质中培养。所述细胞松驰素B溶液是通过用TCM199培养介质稀释溶解在DMSO(二甲基亚砜)溶液中的细胞松驰素B溶液制备的。步骤4电融合供体细胞和受体卵母细胞并且激活电融合的细胞。
将供体细胞移入到受体卵母细胞中，接着进行电融合并且激活电融合的细胞在把供体细胞注射进受体卵母细胞前，用TCM199培养介质清洗去核的卵母细胞并且把它们移到PHA-P(植物血凝素)溶液中。然后通过把供体细胞注射到PHA-P溶液中的去核的卵母细胞的透明带上造成的裂口中，把供体细胞移到去核的卵母细胞中。
使用电细胞操作器(BTX ECM2001)进行电融合。把在补充以TCM199清洗液的甘露醇溶液中的重建的胚胎放在有两个电极的室中，这两个电极在所述室的每侧各有一个。在将胚胎放在所述室中以其供体细胞对着阴极之前，所述室充以甘露醇溶液。用间隔1秒每次15微秒的0.75到2.00千伏/厘米的两次直流脉冲对胚胎进行电融合后，用甘露醇溶液和TCM199清洗介质清洗电融合的胚胎，在细胞松驰素B中培养，并且激活。如果电融合在含钙离子的甘露醇介质中进行，电融合和激活同时发生。不然，激活在电融合后进行。当电融合在不含钙离子的甘露醇介质中进行时，激活步骤通过在离子霉素溶液中黑暗中保温胚胎进行。然后通过用含有FBS或者BSA的TCM199清洗介质清洗胚胎去除离子霉素。所述离子霉素溶液通过用含有BSA的TCM199清洗介质稀释溶解在DMSO中的离子霉素制备。步骤5胚胎的后激活和体外培养胚胎的后激活和体外培养通过在放线菌酮溶液或者4-二甲氨基嘌呤(DAMP)溶液中保温后激活在含有FBS或者BSA的TCM199清洗介质中保温的激活的胚胎，并且在5％的CO2或在5％CO2、7％O2和88％N2的混合气体环境下进行体外培养。所述的放线菌酮溶液或者4-二甲氨基嘌呤DAMP溶液通过在体外培养的介质中添加溶解在乙醇中的放线菌酮或者DAMP而制备。体外培养的介质包括mTALP(见表1)、mSOF(见表2)和mCR2aa(见表3)介质，它们都含有NaCl、KCl、NaHCO3、NaH2PO4、CaCl2、乳酸钠、葡萄糖、酚红、BSA、卡那霉素、必需氨基酸、非必需氨基酸和L-谷氨酰胺。
可选择地，冷冻保存体外培养的胚胎备以后使用，并且在打算使用时解冻。为了冷冻胚胎，用含有FBS的PBS清洗之，并放入含有青霉素-链霉素、CaCl2、葡萄糖、MgCl2、丙酮酸钠和PBS的冷冻介质中。然后把冷冻介质中的胚胎缓慢冷冻，接着在液氮中快速冷冻。当冷冻的胚胎从液氮中取出并且解冻时，把它们在空气中放置约5秒钟然后在温水中解冻。为了从解冻的胚胎中去掉冷冻介质，把它们依次地放进从含有高浓度甘油到含有低浓度的甘油的系列介质中。
表1mTALP介质
表2mSOF介质
表3mCR2aa介质
基于上述的方法，本发明用人类皮肤细胞作为胞核供体，制备了胚胎SNU6(人类体细胞系)。这种胚胎于2000年6月19日在国际保藏机构KCTC(韩国典型培养物保藏中心，韩国KRIBB#52,OUNDONG,YUSONG-KU,TAEJON,305-33，韩国)保藏，保藏号为KCTC0805BP。
现在以以下各实施例进一步说明本发明，这些实施例不应当认为是对本发明范围的限制。实施例1制备供体细胞和受体卵母细胞为了制备供体细胞，将从人的皮肤采集的组织，用PBS(磷酸盐缓冲的盐水，Gibco氏BRL，美国Life Technology)清洗，然后粉碎到100目。然后在39℃、5％的CO2环境下在含有0.25％的胰蛋白酶、1mM的EDTA和1毫克/毫升的Ⅱ型胶原蛋白酶的PBS中将组织保温1小时，在组织被酶消化后，以1500转/分钟离心两分钟，然后悬浮在补充了10％FBS、1％NEAA(非必需氨基酸)、和1％青霉素-链霉素的DMEM(Dulbecco’s氏改进的Eagle氏介质，Gibco氏BRL，美国LifeTechnology)中。将悬浮液移入细胞培养皿中，在39℃、5％CO2环境下培养以得到体细胞系。此后细胞在含有0.25％的胰蛋白酶和1mM的EDTA的溶液中进行胰蛋白酶处理，然后把细胞数调节到2×104个细胞/毫升以在Eppendorf管中等分细胞。
图1表示分离为单个的胞核供体的体细胞。
另一方面，为得到受体卵母细胞，用带有18G针头的10毫升注射器从韩国牛的卵巢吸取直径为2到6毫米左右的卵泡。然后，把卵泡液移入底部画有格条的(线间宽度为1厘米)的100毫米平皿中，然后筛选有均匀的胞质并且周围有足够数量的丘细胞层的卵母细胞。选出的卵母细胞在35毫米平皿中用2毫升TCM199清洗介质(见表4)清洗三次，接着用TCM199培养介质(见表5)清洗一次。最后在含有0.1％雌二醇溶液(表6)、2.5％促卵泡激素溶液(表7)和10％FBS的TCM199培养介质中培养，以得到受体卵母细胞。
表4TCM199清洗介质
表5TCM199培养介质
表6雌二醇溶液
表7促卵泡激素溶液
实施例2体细胞的核转移实施例1中制备的受体卵母细胞用TCM199清洗介质清洗一次，然后移入通过1毫升的TCM199清洗介质与111微升的透明质酸酶原液(在TCM199清洗介质中每毫升10毫克)混合制备的0.1％透明质酸酶(美国Sigma Chemical Co.)溶液。在0.1％透明质酸酶环境下从卵母细胞去掉丘细胞之后，把剥脱后的卵母细胞清洗三次并且在TCM199清洗介质中培养。然后把移入通过含有10％FBS的1毫升TCM199清洗介质与1微升的细胞松驰素B原液(在DMSO每毫升7.5毫克)混合制备的细胞松驰素B(美国Sigma Chemical Co.)溶液中，并用一种微操作器切割每个卵母细胞的透明带的一部分，以得到一个裂口，从此裂口可以把胞质的10％到15％从卵母细胞挤出，以得到去核的卵母细胞。制备去核的卵母细胞的步骤更具体地说明如下把工作盘放在微操作器台上，在微操作器的左臂上装备有一根持定管，在其右臂上装备有一根切割管。然后分别把持定管和切割管沿9点钟和3点钟的方向放置，并且通过在中间放置一个微管控制器把它们调节得可以沿各方向自由运动。进一步把两个微管调节得不能接触到工作盘，并且通过在微滴管上方上下移动使它们的尖端放在微滴管的中间。然后用一个洗口管(内径大于200微米)把卵母细胞移入细胞松驰素B溶液。首先用其粗调钮和细调钮把微操作器聚焦在卵母细胞上。卵母细胞放置得以其第一极体沿卵母细胞的12点钟方向，然后把持定管沿卵母细胞的9点钟方向放置得紧靠卵母细胞以通过加液压固定卵母细胞。图2表示用持定管和切割管切割卵母细胞的透明带。如图2所示，卵母细胞用切割管(2)从1点钟的方向向11点钟的方向切割，特别小心不要损伤卵母细胞的胞质。此后向持定管(1)施加液压以分开卵母细胞(3)，然后将持定管与靠着第一极体上部刺穿透明带的切割管，以通过磨擦两个管切割部分透明带。上述在卵母细胞上造的裂口既用于去核也用于供体注射。图3表示从卵母细胞去掉第一极体和胞核的过程。如图3所示，把卵母细胞(3)以其裂口竖直取向放置，用持定管(1)持定其下部以防止移动，然后用切割管(2)轻挤其上部以得到去核的卵母细胞。去核的卵母细胞用TCM199清洗介质清洗三次，然后在TCM199培养介质中保温。
此后，用微操作器把事先制备好的供体细胞移入去核的卵母细胞。首先用400微升TCM199清洗液和100微升PHA-P(植物血凝素)原液(在TCM199清洗液中0.5毫克/毫升)混合制备的PHA-P溶液在工作盘的中间做一个4微升的注射微滴。然后，用含有1％FBS的PBS做两个供体细胞的微滴，一个在同一工作盘上的注射微滴之上，一个在其下。在这些微滴上涂复矿物油之后，把工作盘放在微操作器台上。
用一个注射管代替安装在微操作器上的切割管。去核的卵母细胞用TCM199清洗介质清洗三次，然后移入注射微滴。把供体细胞吸入注射管然后移入注射微滴。图4表示把一个体细胞移入去核的卵母细胞的过程。如图4所示，去核的卵母细胞以其裂口取向为1点钟放置，用持定管持定，然后用注射管和液压经此裂口注射进供体细胞，以得到重建的胚胎。把胚胎用TCM199清洗介质清洗三次，然后在TCM199清洗介质中保温。实施例3电融合和激活重建的胚胎使用电细胞操作器(美国，BTX,ECM2001)进行电融合，然后再激活。用一个清洗用口管在含有重建的胚胎的TCM199培养介质中加入15微升含有0.28M甘露醇、0.5mM HEPES(pH7.2)、0.1mM MgSO4和0.05％BSA的甘露醇溶液。在所述介质中保温1分钟之后，把胚胎放在补充以TCM199清洗液的甘露醇溶液中培养1分钟，最后用清洗用口管把胚胎移入甘露醇溶液。电细胞操作器的室(3.2毫米的453号室)中充灌补充以TCM199清洗介质的甘露醇溶液，然后把所述胚胎放在所述室中以其供体细胞对着阴极。用间隔1秒每次15微秒的0.75到2.00千伏/厘米的两次直流脉冲对胚胎进行电融合后，将胚胎借助于甘露醇溶液移入TCM199清洗液，并且用TCM199清洗液清洗三次。
为激活电融合的胚胎，把胚胎在离子霉素(美国Sigma ChemicalCo.)溶液中黑暗中培养4分钟，所述溶液是一种含有5μM离子霉素和1％的BSA的TCM199清洗液。所述离子霉素原液通过在1.34毫升的DMSO中溶解1毫克的离子霉素制备。激活的胚胎在含补充以10％FBS的TCM199清洗介质的35毫米平皿中保温5分钟以从胚胎洗去离子霉素。实施例4后激活和体外培养电融合的胚胎激活的胚胎在25微升的放线菌酮(美国Sigma Chemical Co.)溶液中后激活4个小时，所述的放线菌酮溶液是通过在体外培养介质mTALP中添加放线菌酮原液(10毫克/毫升在乙醇中)，到最终浓度10微克/毫升来制备。然后筛选胚胎，把选出的胚胎在39℃温度，5％的CO2环境下培养7天。在培养过程中按经历时间监视胚胎的发育(见表8)。
表8依种间核转移得到的人类皮肤细胞衍生胚胎的发育。
如表8所示，它清楚地表明种间转移技术使之可由人类克隆胚胎发育到桑/胚泡阶段，它实际上便于由发育的桑/胚泡制造人类胚胎干细胞。
基于以上所述的方法，本发明用人类皮肤细胞作为胞核供体，产生一种胚胎，SNU6(人类体细胞系)。所述胚胎于2000年6月19日在国际保藏机构KCTC(韩国典型培养物保藏中心，韩国KRIBB#52,OUNDONG,YUSONG-KU,TAEJON,305-33，韩国)保藏，保藏号为KCTC0805BP。实施例5胚胎的冷冻和解冻及植入将胚胎冷冻以长期保存。首先在35毫米平皿中分布一种冷冻介质(见表9和10)，调节冰箱维持到-5℃。选作冷冻的胚胎用含有10％FBS的PBS清洗，并放入冷冻介质中保温20分钟。然后，把胚胎吸入到0.25毫升的法式吸管中使含有胚胎的冷冻介质处在吸管的中间，而吸管的两侧是空气。在用一个加热了的钳子密封了吸管的两端后，把它放进冰箱，在-5℃保持5分钟。然后用一把预冷钳子种入液氮中速冻。在种入后，以-0.3℃/分钟的速度冷冻到-30℃，在温度达到-30℃时保持10分钟。最后把胚胎储存在液氮罐中。
表9冷冻PBS
表10冷冻介质
为使冷冻的胚胎解冻，在35毫米平皿中制备含有补充以20％的FBS的PBS的解冻介质，并且加上甘油以得到各有0％、3％和6％甘油的解冻介质(见表9和11)。然后从液氮中取出冷冻的吸管，在空气中保持5秒钟，然后在含有温水(30℃)的容器(直径大于20厘米)中解冻。在解冻后，把吸管在其两端的空气层处切割开，然后收集含有胚胎的介质。在显微镜下检查胚胎。为了从胚胎去掉冷冻介质，把它们相继地在含有6％甘油、3％甘油和0％甘油的解冻介质中各保温5分钟。
表11解冻介质
如以上清楚地表示和说明，本发明提供了一种通过种间核转移技术生产人类克隆胚胎的方法，包含把由人类体细胞衍生的核转移到从牛体得到的卵母细胞中，并且用所述方法生产人类克隆胚胎。根据本发明的方法，生产人类克隆胚胎可以用于得到人类胚胎干细胞，这种人类胚胎干细胞可以广泛地用于各种目的，如疾病治疗和医药学中的其它应用。
阅读以上说明后，本领域内的一般技术人员可以对本文所示和所述进行种种修改。这样的修改也落入本发明权利要求书所述的范围内。
有关微生物及其它生物材料的保藏证明(PCT细则13之二)
PCT/RO/134表
权利要求
1．一种生产人类克隆胚胎的方法，该方法包含以下步骤(Ⅰ)制备从人体采集的供体体细胞系；(Ⅱ)在体外将从牛卵巢采集的卵母细胞培育成熟；(Ⅲ)去掉卵母细胞周围的丘细胞，切割成熟的卵母细胞透明带的一部分以产生裂口并且通过该裂口挤出部分包括第一极体的胞质，以得到去核受体卵母细胞；(Ⅳ)通过把供体细胞注射进去核受体卵母细胞而将一个核移入受体卵母细胞，并通过随后的电融合和激活电融合后的细胞得到胚胎；(Ⅴ)后激活并且体外培养胚胎。
2．根据权利要求1的生产人类克隆胚胎的方法，其中步骤(Ⅰ)中制备的体细胞系包括人类皮肤细胞或者采自新生儿脐带的成纤维细胞。
3．根据权利要求1的生产人类克隆胚胎的方法，其中所述体细胞系通过传代培养、血清饥饿培养或者冷冻来保存。
4．根据权利要求1的生产人类克隆胚胎的方法，其中步骤(Ⅲ)中，在透明质酸酶处理后，用剥脱管物理地去掉卵母细胞周围的丘细胞。
5．根据权利要求1的生产人类克隆胚胎的方法，其中步骤(Ⅲ)中，卵母细胞的去核是通过用微操作器切割卵母细胞而在卵母细胞上造成一个裂口；将卵母细胞以其裂口竖直取向并且用一根持定管持定卵母细胞的下部以防止它移动；用一根切割管经此裂口把包括第一极体的10％到15％胞质从卵母细胞中挤出。
6．根据权利要求1的生产人类克隆胚胎的方法，其中步骤(Ⅳ)中的胞核转移是通过经在卵母细胞的透明带上造成的裂口，把供体细胞注射进入去核的受体卵母细胞进行的。
7．根据权利要求1的生产人类克隆胚胎的方法，其中步骤(Ⅳ)中电融合是通过间隔1秒每次15微秒施加的0.75到2.00千伏/厘米的两次直流脉冲进行的。
8．根据权利要求1的生产人类克隆胚胎的方法，其中步骤(Ⅳ)中，如果电融合在含钙离子的介质中进行，激活步骤和电融合同时发生。
9．根据权利要求1的生产人类克隆胚胎的方法，其中步骤(Ⅳ)中，如果电融合在不含钙离子的介质中进行，激活步骤在离子霉素溶液中黑暗中进行。
10．根据权利要求1的生产人类克隆胚胎的方法，其中步骤(Ⅴ)中的后激活是通过在放线菌酮溶液或者DAMP(4-二甲氨基嘌呤)溶液中培养胚胎而进行。
11．根据权利要求1的生产人类克隆胚胎的方法，其中步骤(Ⅴ)中的体外培养是通过在mTALP、mSOF或者mCR2aa介质中培养后激活的胚胎进行的。
12．根据权利要求1的生产人类克隆胚胎的方法，其中进一步包括储存在步骤(Ⅴ)中体外培养的胚胎以备后用的步骤，此步骤是在含有青霉素-链霉素、CaCl2、葡萄糖、MgCl2、丙酮酸钠和磷酸缓冲的盐水的冷冻介质中冷冻后进行的。
13．一种胚胎，SNU6(人类体细胞系，KCTC 0805BP)，它是通过权利要求1的方法，分别用人类皮肤细胞作胞核供体，韩国牛的卵母细胞作为受体卵母细胞生产的。
全文摘要
本发明提供了一种应用种间胞核转移技术生产人类克隆胚胎的方法。本发明的生产人类克隆胚胎的方法包含以下步骤:制备从人体采集的供体体细胞系;体外将从牛卵巢采集的卵母细胞培育成熟;去掉卵母细胞周围的丘细胞,切割成熟的卵母细胞透明带的一部分造成一个裂口并且通过该裂口挤出部分包括第一极体的胞质,以得到去核受体卵母细胞;通过把供体细胞注射进去核卵母细胞而将核移入受体卵母细胞,然后通过随后的电融合和激活电融合后的细胞得到胚胎;后激活并且体外培养胚胎。使用本发明的人类克隆胚胎可以得到人类胚胎干细胞,人类胚胎干细胞可以广泛地用于生物医学领域。
文档编号C12R1/91GK1304444SQ00800632
公开日2001年7月18日 申请日期2000年6月30日 优先权日1999年6月30日
发明者李炳千, 申泰英, 卢湘镐, 林正默, 朴钟任, 赵钟基, 金琪渊, 李殷松, 申秀晶, 金晟基, 宋吉永, 韩在容, 龙焕律, 崔伦僖, 高凤卿, 黄禹锡 申请人:黄禹锡