一种生产克隆牛的方法

专利名称：一种生产克隆牛的方法
技术领域：
本发明的
背景技术：
30年来，已知只可能在两栖动物中克隆受精卵，但目前已成功地在小鼠中通过置换单细胞受精卵的前核生产出克隆的子代(见McGrath和Solter，科学，220:1300-1302,1983)。虽然在克隆动物上有了这个首例成功，畜牧业上的同样成功(见Wakayama等，自然，394:369-374,1998)却报告得相当晚，因为用2-细胞期后的成熟卵母细胞和受精卵裂球生产克隆小鼠有几个问题，例如重编程序的减少等。
有关通过核转移生产克隆牲畜，首例报告是通过用8-到16-细胞受精卵的裂球作供体细胞生产绵羊的子代(见Wiladsen，自然，320:63-65,1986)。此后，据认为通过核转移只能克隆具有全能性的受精卵，籍此细胞可分化成每一个单细胞。然而，经过持续的研究工作，首例克隆绵羊是通过导入体细胞核生产的(见wilmut等，自然，385:810-813,1997)，从而纠正了在先的发育理论，并使得在生产克隆牛(见Welk，等，Reprod.Fertil.And Develop.,10:369-378,1998)和猪方面出现了成功例的报告。
但是现有技术的方法被证实通过核转移生产胚胎的产出量低下，在这个意义上是不太令人满意的，其结果是克隆动物的生产率低下。
在此情况下，有强烈的理由探索和开发一种改进的方法，按照通过核转移生产胚胎的思想生产体细胞衍生的胚胎。
因此本发明的首要目的是提供一种通过体细胞的核转移生产克隆牛的方法。
本发明的另一个目的是提供通过所述方法生产的克隆牛胚胎。
本发明的又一个目的是提供通过所述方法生产的体细胞衍生的克隆牛。
图2是一张照片，表示用一根持定(细玻璃)管和一根切割(细玻璃)管切割受体卵母细胞由透明带的过程。
图3是一张照片，表示通过从受体卵母细胞取走第一极体和胞核进行去核的过程。
图4是一张照片，表示用一根持定管和一根注射管把体细胞移入去核的卵母细胞的过程。
本发明的详细描述本发明生产克隆牛的方法包含以下步骤制备从牛身上采集的供体体细胞系；在体外将从卵巢采集到的卵母细胞培育成熟；去掉卵母细胞周围的丘(cumulus)细胞，切割成熟的卵母细胞透明带的一部分并且挤出部分包括第一极体的胞质，以得到去核受体卵母细胞；通过把供体细胞注射进去核卵母细胞把核移入受体的卵母细胞，然后通过随后的电融合和激活电融合后的细胞得到胚胎；后激活并且在体外培养胚胎；然后把培养的胚胎移入代孕母牛以生产克隆牛犊。
本发明的生产克隆牛的方法进一步说明如下。步骤1制备供体细胞把从牛身上采集的体细胞系制备成供体细胞。尽管没有限制供体细胞的牛的品种，但优选用韩国牡牛(Bos taurus coreane)和荷兰牛(Bostaurus)制备供体细胞。从牛身上采集的细胞系包括从子宫冲洗液、子宫内膜、输卵管、耳或者肌肉、丘细胞或者胎儿成纤维细胞采集的细胞，可使用常规的公知方法稍加改动后，制备这些细胞系(Mather&Barnes，细胞生物学方法，第57卷，动物细胞培养方法，Academic Press,1998)。
例如，通过在子宫冲洗液中加入含1％青霉素-链霉素(Gibco；每毫升10000单位青霉素，每毫升10毫克链霉素)磷酸盐缓冲的盐水(PBS)然后离心采集细胞。从子宫冲洗液中采集的细胞在补充了非必需氨基酸、10％的胎牛血清(FBS)和1％青霉素-链霉素的Dulbecco改进的Eagle氏培养基(DMEM)中，在39℃、5％的CO2的环境下培养。
从子宫内膜或者输卵管采集的子宫上皮细胞用所述的PBS清洗、胰蛋白酶处理、然后在与上述相同的条件下培养。
对于丘细胞，用透明质酸酶溶液处理丘细胞-卵母细胞复合体以分离卵母细胞周围的丘细胞。在39℃、5％的CO2的环境下用胰蛋白酶处理丘细胞30到60分钟以后再以与上述相似的方式培养。
有关耳成纤维细胞和胎牛成纤维细胞，它们分别从包在软骨组织上的皮层的内侧和胎牛肢和体收集的组织得到在无菌条件下清洗和破碎这些组织，然后用胰蛋白酶及Ⅱ型胶原蛋白酶在39℃、5％的CO2的环境下处理。这些细胞也以类似于上述的供体体细胞系的方式培养。
体细胞系由传代培养、血清饥饿培养或者冷冻方法储存。供体细胞系的传代培养定期地通过在胰蛋白酶处理后用新的培养基代替旧的培养基来进行。血清饥饿培养通过施用补充0.5％FBS的DMEM以Wilmut等的方法进行(见Wilmut等，自然385:810-813.1997)。这样储存的细胞系在后面的步骤中用作供体细胞。步骤2制备受体卵母细胞在体外将从卵巢采集的不成熟的卵母细胞培育成熟从含有10mM N-羟乙基哌嗪-N｀-［2-乙基磺酸](HEPES)的TCM199清洗介质中的卵巢中选择不成熟的卵母细胞，然后在补充了雌二醇、FSH(促卵泡激素)和FBS的TCM199培养基(含丙酮酸钠青霉素-链霉素)中在39℃、5％的CO2的环境下培养16至22小时使上述卵母细胞成熟。步骤3受体卵母细胞的去核去掉成熟的受体卵母细胞周围的丘细胞并且切除卵母细胞的部分透明带之后，从卵母细胞中去掉部分包括第一极体的胞质，以得到去核的卵母细胞首先用一个剥脱管从含有透明质酸酶的TCM199清洗介质中物理去除成熟的卵母细胞周围的丘细胞。然后用TCM199清洗介质清洗剥脱了的卵母细胞，并且把它们移入细胞松驰素B溶液。为了对剥脱的细胞去核，用一根切割管穿刺剥脱了的卵母细胞的透明带的一部分，以得到一个裂隙，从此裂隙可以把包括第一极体的10％到15％胞质从卵母细胞挤出。清洗去核的卵母细胞，并且在TCM199培养基介质中培养。所述细胞松驰素B溶液是通过用TCM199培养基介质稀释溶解在DMSO(二甲基亚砜)溶液中的细胞松驰素B溶液制备的。步骤4电融合供体细胞和受体卵母细胞并且激活电融合的细胞将供体细胞移入到受体卵母细胞中，接着进行电融合并且激活电融合的细胞在把供体细胞注射进受体卵母细胞前，用TCM199培养基介质清洗去核的卵母细胞并且把它们移到PHA-P(植物血凝素)溶液中。然后通过把供体细胞注射到PHA-P溶液中的去核的卵母细胞的透明带上造成的裂口中，把供体细胞移到去核的卵母细胞中。
使用电细胞操作器(BTX ECM2001)进行电融合。把放在补充以TCM199清洗液的甘露醇溶液中的重建的胚胎放在有两个电极的室中，这两个电极在此室的每侧各有一个。在将胚胎放在所述室中以其供体细胞对着阴极之前，在所述室充以甘露醇溶液。用间隔1秒每次15微秒的0.75到2.00千伏/厘米的两次直流脉冲对胚胎进行电融合后，用甘露醇溶液和TCM199清洗液清洗电融合的胚胎，在细胞松驰素B溶液中保温，并且激活。如果电融合在含钙离子的甘露醇介质中进行，电融合和激活同时发生。不然，激活在电融合后进行。当电融合在不含钙离子的甘露醇介质中进行时，激活步骤通过在离子霉素溶液中黑暗中保温胚胎进行。然后通过用含有FBS或者BSA的TCM199清洗介质清洗胚胎去除其中的离子霉素。所述离子霉素溶液通过用含有BSA的TCM199清洗介质稀释溶解在DMSO中的离子霉来制备。步骤5胚胎的后激活和体外培养胚胎后激活和体外培养通过在放线菌酮溶液或者4-二甲氨基嘌呤(DAMP)溶液中保温后激活在含有FBS或者BSA的TCM199清洗介质中保温的激活的胚胎，并且在5％的CO2或在5％CO2、7％O2和88％N2的混合气体环境下进行体外培养。所述的放线菌酮溶液或者DAMP溶液通过在体外培养的培养基中添加溶解在乙醇中的放线菌酮或者DAMP制备。体外培养的介质包括mTALP(见表1)、mSOF(见表2)和mCR2aa(见表3)介质，它们都含有NaCl、KCl、NaHCO3、NaH2PO4、CaCl2、乳酸钠、葡萄糖、酚红、BSA、卡那霉素、必需氨基酸、非必需氨基酸和L-谷氨酰胺。
可选择地，冷冻保存体外培养的胚胎备以后使用，并且在打算使用时解冻。为了冷冻胚胎，用含有FBS的PBS清洗之，放入含有青霉素-链霉素、CaCl2、葡萄糖、MgCl2、丙酮酸钠和PBS的冷冻培养基中。然后将冷冻培养基中的胚胎缓慢冷冻，接着在液氮中快速冷冻。当冷冻的胚胎从液氮中取出并且解冻时，将它们在空气中放置约5秒钟然后在温水中解冻。为了从解冻的胚胎中去掉冷冻介质，将它们依次地放进从含有高浓度甘油到含有低浓度的甘油的系列介质中。
表1mTALP介质


表2mSOF介质

见表3mCR2aa介质

步骤6生产克隆牛将体外培养的胚胎移入代孕母牛将在含有FBS的PBS中的胚胎植入代孕母牛的子宫。
基于上述的方法，本发明通过分别用韩国牡牛和荷兰牛的耳细胞作为胞核供体，制备了胚胎，即韩国牡牛胚胎/TcEar和SNU2(牛NT胚胎)。这两种胚胎分别于1999年12月31日和2000年3月10日在国际保藏机构KCTC(韩国典型培养物保藏中心，韩国KRIBB#52,OUNDONG,YUSONG-KU,TAEJON,305-33)保藏，保藏号分别为KCTC0719BP和KCTC0753BP。本发明还涉及通过把这些胚胎移入代孕母牛得到正常的克隆子代。
现在以以下各实施例进一步说明本发明，这些实施例并不用于限定本发明的范围。实施例1制备供体细胞和受体卵母细胞为了制备供体细胞，从韩国牡牛的耳朵皮肤内侧的采集组织，用PBS(磷酸盐缓冲的盐水，Gibco氏BRL，美国Life Technology)洗涤，然后粉碎到100目。然后在39℃、5％CO2的环境下在含有0.25％的胰蛋白酶、1mM的EDTA和1毫克/毫升的Ⅱ型胶原蛋白酶的PBS中将组织保温1小时，在组织被酶消化后，以1500转/分钟离心两分钟，然后悬浮在补充了10％FBS、1％NEAA(非必要氨基酸)、和1％青霉素-链霉素的DMEM(Dulbecco氏改进的Eagle氏培养基，Gibco氏BRL，美国Life Technology)中。悬浮液移入细胞培养皿中，在39℃、5％CO2环境下保温以得到体细胞系。此后细胞在含有0.25％的胰蛋白酶和1mM的EDTA的溶液中进行胰蛋白酶处理，然后把细胞数调节到2×104个细胞/毫升以在Eppendorf管中等分细胞。


图1表示分离为单个细胞以用作胞核供体的体细胞。
另一方面，为得到受体卵母细胞，用带有18G针头的10毫升注射器从韩国牡牛的卵巢吸取直径约2到6毫米左右的卵泡。然后，把卵泡液移入底部画有格条的(线间宽度为1厘米)的100毫米平皿中，然后筛选有均匀胞质并且周围有足够数量的丘细胞层的卵母细胞。选出的卵母细胞在35毫米平皿中用2毫升TCM199清洗培养基(表4)清洗三次，接着用TCM199培养基(表5)清洗一次。最后在含有0.1％雌二醇溶液(表6)、2.5％促卵泡激素溶液(表7)和10％FBS的TCM199培养基中培养卵母细胞，以得到受体卵母细胞。
表4TCM199清洗介质

表5TCM199介质

表6雌二醇溶液

表7促卵泡激素溶液

实施例2体细胞的核转移实施例1中制备的受体卵母细胞用TCM199清洗介质清洗，然后移入通过1毫升的TCM199清洗介质与111微升的透明质酸酶原液(在TCM199清洗介质中每毫升10毫克)混合制备的0.1％透明质酸酶(美国Sigma Chemical Co.)溶液。在0.1％透明质酸酶环境下从卵母细胞去掉丘细胞之后，把剥脱后的卵母细胞清洗三次并且在TCM199清洗介质中培养。然后把移入通过含有10％FBS的1毫升TCM199清洗介质与1微升的细胞松驰素B(在DMSO每毫升7.5毫克)混合制备的细胞松驰素B(美国Sigma Chemical Co.)溶液，用一根切割管刺开每个卵母细胞的透明带的一部分，以得到一个裂隙，从此裂隙可以把胞质的10％到15％从卵母细胞挤出，以得到去核的卵母细胞。制备去核的卵母细胞的步骤更具体地说明如下把工作盘放在微型操作器上，在微操作器的左臂上装备有一根持定管，在其右臂上装备有一根切割管。然后分别把持定管和切割管沿9点钟和3点钟的方向放置，并且通过在中间放置一个微管控制器把它们调节得可以沿各方向自由运动。进一步把两个微管调节得不能接触到工作盘，并且通过在微滴管上方上下移动使它们的尖端放在微滴管的中间。然后用一个洗口管(内径大于200微米)把卵母细胞移入细胞松驰素B溶液。首先用其粗调钮和细调钮把微操作器聚焦在卵母细胞上。卵母细胞放置得以其第一极体沿卵母细胞的12点钟方向，然后把持定管沿卵母细胞的9点钟方向放置得紧靠卵母细胞以通过加液压固定卵母细胞。图2表示用持定管和切割管切割卵母细胞的透明带。如图2所示，卵母细胞用切割管(2)从1点钟的方向向11点钟的方向切割，特别小心不要损伤卵母细胞的胞质。此后向持定管(1)施加液压以分开卵母细胞(3)，然后将持定管与靠着第一极体上部刺穿透明带的切割管接触，以通过磨擦两个管切割部分透明带。上述在卵母细胞上造的裂口既用于去核也用于供体注射。图3表示从卵母细胞去掉第一极体和胞核的过程。如图3所示，使卵母细胞(3)以其裂口竖直取向放置，用持定管(1)持定其下部以防止移动，然后用切割管(2)轻挤其上部以得到去核的卵母细胞。去核的卵母细胞用TCM199清洗介质清洗三次，然后在TCM199培养基介质中保温。
此后，用微操作器把事先制备好的供体细胞移入去核的卵母细胞。首先用400微升TCM199清洗液和100微升PHA-P(植物血凝素)原液(在TCM199清洗液中0.5毫克/毫升)混合制备的PHA-P溶液在大工作盘的中间做一个4微升的注射微滴。然后，用含有1％FBS的PBS做两个供体细胞的微滴，一个在同一工作盘上的注射微滴之上，一个在其下。在这些微滴上涂复矿物油之后，把工作盘放在微操作器台上。
用一个注射管代替安装在微操作器上的切割管。去核的卵母细胞用TCM199清洗介质清洗三次，然后移入注射微滴。把供体细胞吸入注射管然后移入注射微滴。图4表示把一个体细胞移入去核的卵母细胞的过程。如图4所示，去核的卵母细胞以其裂口取向为1点钟放置，用持定管持定，然后用注射管和液压经此裂口注射进供体细胞，以得到重建的胚胎。把胚胎用TCM199清洗介质清洗三次，然后在TCM199清洗介质中保温。实施例3电融合和激活电融合和激活重建的胚胎使用电细胞操作器(美国，BTX,ECM2001)进行电融合，然后再激活。用一个洗口管在含有重建的胚胎的TCM199培养基介质中加入15微升含有0.28M甘露醇、0.5Mmhepes(pH7.2)、0.1mMMgSO4和0.05％BSA的甘露醇溶液。在所述介质中保温1分钟之后，将胚胎放在补充以TCM199清洗液的甘露醇溶液中培养1分钟，最后用洗口管将胚胎移入甘露醇溶液。ElectroCeil Manipulator的室(3.2毫米的453号室)中充灌补充以TCM199清洗液的甘露醇溶液，然后将所述胚胎放在所述室中以使其供体细胞对着阴极。用间隔1秒每次15微秒的0.75到2.00千伏/厘米的两次直流脉冲对胚胎进行电融合后，借助于甘露醇溶液将胚胎移入TCM199清洗液，并且用TCM199清洗液清洗三次。
为进行激活，把胚胎在离子霉素(美国Sigma Chemical Co.)溶液中黑暗中培养4分钟，这是一种含有5μM离子霉素和1％的BSA的TCM199清洗液。所述离子霉素原液通过在1.34毫升的DMSO溶解1毫克的离子霉素制备。激活的胚胎在含补充以10％FBS的TCM199清洗介质的35毫米平皿中保温5分钟以从胚胎洗去离子霉素。实施例4后激活和体外培养电融合的胚胎激活的胚胎在25微升的放线菌酮(美国Sigma Chemical Co.)溶液中后激活4个小时，所述的放线菌酮溶液是通过在体外培养的培养基介质mTALP中添加放线菌酮原液(10毫克/毫升在乙醇中)中，稀释到10微克/毫升来制备。然后筛选胚胎，将选出的胚胎在39℃温度，5％的CO2环境下培养7天。
在应用实施例1至4所述的方法时，本发明人通过使用韩国牡牛的耳朵的细胞作为核供体，生产一种韩国牡牛胚胎，并且于1999年12月31日在国际保藏机构KCTC(韩国典型培养物保藏中心，韩国KRIBB#52,OUNDONG,YUSONG-KU,TAEJON,305-333)保藏，保藏号为KCTC0719BP。实施例5利用荷兰牛的耳细胞生产胚胎本发明人用实施例1至4所述的同样方法生产另一种胚胎SNU2(牛NT胚胎)，不同是的分别用荷兰牛的耳细胞和卵母细胞作为胞核供体和受体卵母细胞。并且于2000年3月10日在国际保藏机构KCTC(韩国典型培养物保藏中心，韩国KRIBB#52,OUNDONG,YUSONG-KU,TAEJON,305-333)保藏，保藏号为KCTC0753BP。实施例6胚胎的冷冻和解冻及植入冷冻胚胎以长期保存。首先在35毫米平皿中分布一种冷冻介质(见表8和9)，调节冰箱维持到-5℃。选作冷冻的胚胎用含有10％FBS的PBS清洗，放入冷冻介质中保温20分钟。然后，把胚胎吸入到0.25毫升的法式吸管中使含有胚胎的冷冻介质处在吸管的中间，而吸管的两侧是空气。在用一个加热了的钳子密封了吸管的两端后，把它放进冰箱，在-5℃保持5分钟。然后用一把预冷钳子种入液氮中速冻。在种入后，以-0.3℃/分钟的速度冷冻到-30℃，在温度达到-30℃时保持10分钟。最后把胚胎储存在液氮罐中。
表8冷冻PBS

表9冷冻介质

为使冷冻的胚胎解冻，在35毫米平皿中制备含有补充以20％的FBS的PBS解冻介质，并且加上甘油以得到各有0％、3％和6％甘油的解冻介质(见表8和10)。然后从液氮中取出冷冻的吸管，在空气中保持5秒钟，然后在含有温水(30℃)的容器(直径大于20厘米)中解冻。在解冻后，把吸管在其两端的空气层处切割开，然后收集含有胚胎的介质。在显微镜下检查胚胎。为了从胚胎去掉冷冻介质，把它们相继地在含有6％甘油、3％甘油和0％甘油的解冻介质中各保温5分钟。
表10解冻介质

把解冻的胚胎放入含有20％的FBS的PBS中，然后吸入0.25ml吸管。然后把它移入代孕母牛的子宫。实施例7比较应用不同胞核供体的胚胎为了比较应用不同胞核供体制造的胚胎的区别，将分别在实施例4和实施例5中产生的韩国牡牛胚胎/TcEar(KCTC0719BP)和SNU2(KCTC0753BP)移入代孕母牛的子宫，然后就以下各项进行比较电融合的卵母细胞数、电融合率(％)、分裂率(％)、桑椹胚/胚泡发育数(％)、转移胚胎数和子代率(％)(见表11)。桑椹/胚泡发育数(％)代表刚好在植入前阶段的由核转移生产的总胚胎数中由体外培养发育的胚胎数的比率。
表11胚胎的比较

如表11所示就两个方面在胚胎的生产和培养方面的比较而言，在用作核供体的韩国牡牛和荷兰牛牛的耳细胞之间没有显著的区别。这个结果表明，本发明的生产克隆牛的方法可以没有任何特殊性地用于其它的牛种。除了可以广泛地应用核供体之外，本发明的方法可以显著地提高重建胚胎的产量，因为桑椹胚/胚泡发育数(％)和本发明的传递率远高于现有技术(见Goto等，Anim.Sci.Journal,70:243-245,1999；Zakhartchenko等，J.Reprod.Fertil.,115:325-331,1999；Hill等，Biol.Reprod.,62:1135-1140,2000；Kubota等，Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,94:990-995,2000)。实施例8用韩国牡牛的子宫细胞作胞核供体以生产胚胎用与实施例1至4所述的过程生产胚胎，不同的是供体细胞从韩国牡牛的子宫分离。实施例9比较采用不同的供体组织的胚胎为了比较采用不同的供体组织的胚胎，分别地把实施例4和8中生产的胚胎植入代孕母牛，如实施例6所述，并且以与实施例7相同的方法检查(见表12)。
表12取决于胞核供体来源的胚胎发育率

如表12所示就两个方面在胚胎的生产和培养方面的比较而言，在用作供体细胞之间不同的组织没有显著的区别。这个结果表明，本发明的生产克隆牛的方法可以用于许多细胞类型而不是只用于特定的体细胞。
如以上清楚地表示和说明，本发明提供了一种生产克隆牛的方法，其包含以下步骤在体外将供体卵母细胞培育成熟；制备供体体细胞和去核卵母细胞；核转移；电融合和续后激活；后激活并且在体外培养胚胎；然后把培养的胚胎移入代孕母牛。根据本发明的生产克隆牛的方法，可以通过应用经高度改进的胞核转移技术得到的重建胚胎生产由体细胞衍生克隆牛，使之可能大批量生产医学和畜牧业的药品和器官，并且方便其在许多其它相关领域中的应用。
阅读以上说明后，本领域内的一般技术人员可以对本文所示和所述进行种种修改。这样的修改也落入本发明权利要求书所限定的范围内。有关微生物及其它生物材料的保藏证明(PCT细则13之二)


PCT/RO/134表有关微生物及其它生物材料的保藏证明(PCT细则13之二)


PCT/RO/134表
权利要求
1．一种生产克隆牛的方法，该方法包括以下步骤(Ⅰ)制备从牛身上采集的供体体细胞系；(Ⅱ)在体外将从卵巢采集的卵母细胞培育成熟；(Ⅲ)去掉卵母细胞周围的丘细胞，切割成熟的卵母细胞透明带的一部分以产生裂口并且通过该裂口挤出部分包括第一极体的胞质，以得到去核受体卵母细胞；(Ⅳ)通过把供体细胞注射进去核受体卵母细胞而将一个核移入受体的卵母细胞，并通过随后的电融合和激活电融合后的细胞得到胚胎；(Ⅴ)后激活并且在体外培养胚胎；(Ⅵ)然后把培养的胚胎移入代孕母牛以生产克隆牛犊。
2．根据权利要求1的生产克隆牛的方法，其中所述制备体细胞系的步骤(Ⅰ)包括从子宫冲洗液、子宫内膜、输卵管、耳或者肌肉、丘细胞或者胎儿成纤维细胞采集的细胞。
3．根据权利要求1的生产克隆牛的方法，其中所述体细胞系通过传代培养、血清饥饿培养或者冷冻来保存。
4．根据权利要求1的生产克隆牛的方法，其中所述步骤(Ⅲ)中，在透明质酸酶处理后用剥脱管物理去掉卵母细胞周围的丘细胞。
5．根据权利要求1的生产克隆牛的方法，其中所述步骤(Ⅲ)中，卵母细胞去核是通过用微操作器切割卵母细胞以在卵母细胞上造成一个裂口；将卵母细胞以其裂口竖直取向并且用一根持定管持定卵母细胞的下部以防止它移动；用一根切割管经此裂口把包括第一极体的10％到15％胞质从卵母细胞中挤出。
6．根据权利要求1的生产克隆牛的方法，其中所述步骤(Ⅳ)中的胞核转移是通过经在卵母细胞的透明带上造成的裂口，将供体细胞注射进入去核的受体卵母细胞进行的。
7．根据权利要求1的生产克隆牛的方法，其中所述步骤(Ⅳ)中电融合是通过间隔1秒每次15微秒施加的0.75到2.00千伏/厘米的两次直流脉冲进行的。
8．根据权利要求1的生产克隆牛的方法，其中所述步骤(Ⅳ)中，如果电融合在含钙离子的介质中进行，激活步骤和电融合同时发生。
9．根据权利要求1的生产克隆牛的方法，其中所述步骤(Ⅳ)中，如果电融合在不含钙离子的介质中进行，激活步骤在离子霉素溶液中在黑暗中进行。
10．根据权利要求1的生产克隆牛的方法，其中所述步骤(Ⅴ)中的后激活通过在放线菌酮溶液或者DAMP(4-二甲氨基嘌呤)溶液中培养胚胎而进行。
11．根据权利要求1的生产克隆牛的方法，其中所述步骤(Ⅴ)中的体外培养是通过在mTALP、mSOF或者mCR2aa介质中培养后激活的胚胎进行的。
12．根据权利要求1的生产克隆牛的方法，其进一步包括储存在步骤(Ｖ)中经体外培养的胚胎以备后用的步骤，此步骤是在含有青霉素-链霉素、CaCl2、葡萄糖、MgCl2、丙酮酸钠和磷酸盐缓冲的盐水的冷冻介质中冷冻后进行的。
13．一种胚胎，韩国牡牛胚胎/TcEar(KCTC 0719BP)，它是通过权利要求1的步骤(Ⅰ)到(Ⅴ)，分别用韩国牡牛的耳细胞和卵母细胞作为胞核供体和受体卵母细胞生产的。
14．一种胚胎，SNU2(牛NT胚胎，KCTC 07531BP)，它是通过权利要求1的步骤(Ⅰ)到(Ⅴ)，分别用荷兰牛的耳细胞和卵母细胞作为胞核供体和受体卵母细胞生产的。
15．一种克隆牛，它是通过用权利要求13所述的韩国牡牛胚胎/TcEar(KCTC 0719BP)作为胚胎，经权利要求1的步骤(Ⅵ)生产的。
16．一种克隆牛，它是通过用权利要求14所述的SNU2(牛NT胚胎，KCTC 07531BP)作为胚胎，经权利要求1的步骤(Ⅵ)生产的。
全文摘要
本发明提供了一种应用体外培育成熟卵母细胞和胞核转移技术生产克隆牛的方法。本发明的生产克隆牛的方法包含以下步骤:制备从牛身上采集的供体体细胞系;在体外将从卵巢采集的卵母细胞培育成熟;去掉卵母细胞周围的丘细胞,切割成熟的卵母细胞透明带的一部分并且挤出部分包括第一极体的胞质,以得到去核受体卵母细胞,通过把供体细胞注射进去核卵母细胞而把核移入受体的卵母细胞,然后通过随后的电融合和激活电融合后的细胞得到胚胎;后激活并且体外培养胚胎;然后把培养的胚胎移入代孕母牛以生产克隆牛犊。所述克隆牛可用于大批量生产医学和畜牧业的药品和器官,并且方便其在医学和畜牧业,以及科学研究等方面的普遍应用。
文档编号C12N5/10GK1304443SQ00800602
公开日2001年7月18日 申请日期2000年6月30日 优先权日1999年6月30日
发明者李炳千, 申泰英, 卢湘镐, 林正默, 朴钟任, 赵钟基, 金琪渊, 李殷松, 申秀晶, 金晟基, 宋吉永, 黄禹锡 申请人:黄禹锡