专利名称：类固醇的微生物9α－羟基化的制作方法
技术领域：
本发明涉及制备对类固醇核降解有抑制作用的经遗传工程修饰的微生物的方法，这种微生物在类固醇积累中的应用以及这种经修饰的微生物。
降解植物甾醇的能力广泛存在于诺卡菌形放线菌中，这一能力需要一组能降解侧链和类固醇核结构的酶。
3-酮类固醇Δ1-脱氢酶(KSTD)[4-烯-3-氧代类固醇(受体)-1-烯-氧化还原酶，EC 1.3.99.4]通过在C1-C2位置引入一个双键而参与类固醇核的B环的裂解。更特别地，该酶参与4-雄烯-3，17-二酮至1，4-雄二烯-3，17-二酮的转化，以及9α-羟基-4-雄烯-3，17-二酮至9α-羟基-1，4-雄二烯-3，17-二酮的转化(见
图1)。在几种细菌中鉴定了该酶简单节杆菌(Arthrobacter simplex)(Penasse and Peyre，1968Rhodococcus.Crit Rev Biotech 1429-73)，假单胞菌属(Pseudomonas)(Levy and Talalay，1959 J Biol Chem 2342009-20013；1959 J Biol Chem 2342014-2021)，局限诺卡氏菌(Nocardiarestrictus)(Sih and Bennet，1962 Biochem Biophys Acta56587-592)，珊瑚诺卡氏菌(Nocardia corallina)(Itagaki等人.，1990 Biochim Biophys Acta 103860-67)，不透明诺卡氏菌(Nocardiaopaca)(Drobnic等人.，1993 Biochim Biophys Res Comm190509-515)，偶发节杆菌(Mycobacterium fortuitum)(Wovcha等人.，1979 Biochim Biophys Acta 574471-479)和红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)IMET7030(Kaufmann等人.，1992 JSteroid Biochem Molec Biol 43297-301)。不透明诺卡氏菌的KSTD被鉴定为一种黄素蛋白质(Lestrovaja等人.，1978 Z Allg Mikrobiol18189-196)。只有简单节杆菌、睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonasrestosteroni)和紫红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)中编码KSTD的基因(kstD3-酮类固醇Δ1-脱氢酶)的性质得到充分地鉴定(Plesiat等人.，1991 J Bacteriol 1737219-7227；Molnar等人.，1995 Mol Microbiol 15895-905；Morii等人.，1998 J Biochem1241026-1032)。
类固醇1，2-脱氢酶专有的抑制作用引起9α-羟基-4-雄烯-3，17-二酮的积累，后者是肾上腺皮质素合成的极好的起始物(Kieslich K，1985 J Basic Microbil 25461-474)。9α-羟基雄激素作为抗雄激素、抗雌激素和抗受精物质在工业上具有重要意义。9α-羟基很容易脱水形成9(11)-脱氢系统，从而为9α-卤代肾上腺皮质素生成提供起始结构。
众所周知，红球菌(Rhodococcus)菌种有巨大的分解代谢潜力(Warhurst and Fewson，1994 Rhodococcus.Crit Rev Biotech1429-73；Bell等人.，1998 J Appl Microbiol 85195-210)。几种红球菌能降解天然植物甾醇，后者是生成有生物活性的类固醇的便宜起始物(Kieslich K，1986 Drug Res 36888-892)。红球菌和节杆菌属菌株在经诱变剂处理和/或与酶抑制剂孵育后，能将固醇转化成4-雄烯-3，17-二酮和1，4-雄二烯-3，17-二酮(Martin，1977 Adv ApplMicrobiol 2229-58)。
尽管kstD的克隆和红串红球菌IMET7030的无活性KSTD蛋白质在大肠杆菌(Escherichia coli)中的表达已有描述(Wagner等人.，1992J Basic Microbiol 3265-71；1992 J Basic Microbiol 32269-277)，并且不透明诺卡氏菌(Drobnic等人.，1993 Biochem Biophys Res Comm190509-515)的一段核苷酸序列可以获得(DDBJ/EMBL/GenBankU59422)，但是该基因分子鉴定方面没有报道。KSTD活性对类固醇核降解是必要的，并且kstD基因的失活对积累类固醇中间体是必需的。根据本发明的一个方面，提供了红串红球菌的kstD基因的核苷酸序列。KSTD蛋白质由SEQ ID NO1的核苷酸820-2329编码。
使基因失活是分析基因功能和引入代谢阻碍的有力工具。用带有选择标记的非复制性载体破坏基因是使基因失活的一种常用方法。然而，用代谢途径工程方法构建具有所需特征的菌株可能需要分步骤使数个基因失活或取代。只有具有合适的策略，可用于引入未被标记的基因缺失或基因取代，能够进行无限轮代谢加工而不依赖于多个标记的使用，才能使之可行。根据本发明的另一个方面，提供了分步失活参与类固醇降解的基因，优选脱氢酶基因的方法。特别地，本发明可应用于对参与了通过在4-雄烯-3，17-二酮上培养微生物而积累9α-羟基-4-雄烯-3，17-二酮的过程的基因进行灭活。优选地，至少使基因kstD1失活。
意外地发现，破坏红串红球菌SQ1中编码3-酮类固醇Δ1-脱氢酶的基因kstD1，并没有导致类固醇核降解的失活。保留的活性似乎是基于另一个酶的存在。现已发现，超过一个基因的失活对获得完全阻断类固醇核降解的菌株是必需的。优选第二个酶是脱氢酶，更优选的是KSTD同工酶。为了有可能破坏或缺失某些基因，一个优选的方法是定点诱变。对于分步骤失活KSTD基因而言，优选引入未标记的基因缺失的方法。所产生的遗传上被改造的菌株应是不含外源DNA的。
根据本发明的另一个优选方案，至少使基因kstD2失活。最优选地，至少使基因kstD1和kstD2都失活。本发明的另一个方面是红串红球菌的kstD2基因的核苷酸序列。KSTD2蛋白质是由SEQ ID NO5的核苷酸1-1678编码。
在红球菌属中引入未被标记的基因缺失的方法还没有报道。然而，在放线菌目的另一些成员中，即链霉菌属(Streptomyces)(Hillemann等人.，1991 Nucleic Acid Res 19727-731；Hosted和Baltz，1997J.Bacteriol 179180-186)，棒杆菌属(Corynebacterium)(Schafer等人，1994 Gene 14569-73)和节杆菌属(Marklund等人，1995 JBacteriol 1776100-6105；Morman等人，1995 Mol Microbiol16755-760；Sander等人，1995 Mol Micorbiol 16991-1000；Pelicic等人，1996 Mol Microbiol 20919-125；Kinpfer等人，1997Plasmid 37129-140)中，基因缺失或基因取代的方法已有描述。反选择标记可用于筛选产生基因缺失或基因取代的稀少的第二次重组事件。在这方面，sacB和rpsL被证明是有用的报道基因(Hosted和Baltz，1997 J Bacteriol 179180-186；Schafer等人，1994 J Bacteriol1721663-1666；Sander等人，1995 Mol Microbiol 16991-1000；Pelicic等人，1996 Mol Microbiol 20919-925；Jager等人，1992 JBacteriol 1745462-5465)，但也有其它合适的标记可用。还没有在红球菌属中应用rpsL的报道，但在该属，sacB(编码枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis )果聚糖蔗糖酶)可提供有力的正选择标记(Jager等人，1995 FEMS Microbiol Lett 1261-6；Denis-Larose等人，1998 Appl Environ Microbiol 644363-4367)。
SacB基因编码的枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶催化糖水解和果聚糖(高分子量果糖多聚体)合成。当蔗糖存在时，sacB在红球菌属中的表达是致死的。果聚糖蔗糖酶作用于蔗糖产生毒性的生物化学基础仍然不知道。因此，sacB基因的条件致死(即，有或没有蔗糖)可用作反选择标记。本文中的反选择是指标记的表达是致死的，而不是可提高抗性，例如在可选择标记(例如，抗性标记)的情况下即是如此。
需要通过反选择来选择那些经历了第二次重组事件，从而丢失了sacB标记并引入了期望突变的突变体。该系统的优点在于，在选择过程中，仅仅潜在的好突变体能经选择而存活下来。与只有一个选择标记的系统相比较，反选择避免了在一个选择标记系统中必需的长时间选择抗性标记丢失的过程。
未标记突变的优点在于，它允许在同一菌株中反复引入突变。在引入突变过程中，外源DNA(载体DNA)被去除。这样，为引入第二个突变而新引入的载体DNA就不能整合在前一次突变(通过载体DNA之间的同源重组)所在的位置。若载体DNA仍在染色体上，那么整合一定会发生，并且将大大提高假阳性整合体的数量。该系统能保证只使用单个抗生素基因用于引入无限数量的突变。未标记突变也很容易应用到工业中，因为没有异源DNA的存在，从而能够简单处理发酵培养液。
通过基因缺失进行基因失活能构建出稳定的，不发生回复的突变体。相比于通过单一的重组整合进行基因破坏，特别小的基因(＜500bp)更容易通过基因缺失而失活。基因缺失诱变策略也能用于基因取代(例如，改变野生型，形成突变基因)。
诱变分解代谢类固醇脱氢酶基因的优选菌株是红串红球菌。然而，如果分子组成与红串红球菌SQ1相同(或相似)，则也包括在通过接合遗传上可进入的其它菌种中进行的kstD1和/或kstD2的未标记基因缺失。优选地，这些菌种属于红球菌属，但也可以使用相关菌种，例如诺卡氏菌属，节杆菌属和节杆菌属。
红球菌中的基因失活能被异常重组事件所阻碍。这些异常重组事件导致诱变载体随机整合入基因组(Desomer等人，1991 MolMicrobiol 52115-2124；Barnes等人，1997 J Bacteriol1796145-6153)，这是我们试图破坏红串红球菌SQ1的kstD1基因时遇到的现象。异常重组也是某些生长缓慢的节杆菌菌种中为人熟知的现象(McFadden，1996 Mol Microbiol 121205-211)。结合质粒从大肠杆菌S17-1转移到红球菌显示可使随机整合最小化(Powell和Archer。1998 Antinie van Leeuwenhoek 74175-188)。质粒从大肠杆菌菌株S17-1接合转移到许多不同的棒状细菌的菌株，以及转移到成束红球菌(Rhodococcus fascians)DSM20131已被证明是有可能的(Schafer等人，1990 J.Bacteriol 1721663-1666；Jager等人，1995FEMS Microbiol Lett 1261-6)。根据本发明，采用带有sacB基因作为反选择标记的诱变载体的接合转移，在红串红球菌SQ1的类固醇分解代谢中引入未标记基因缺失。
作为本发明的另外一个实施方案，可以用与实施例中关于kstD2显示的相同方法来实现引入另一个基因失活事件。对于更进一步的基因失活，可以再次用同样的方法，或作为替代，也可用紫外线辐射或化学方法，例如亚硝基胍或双环氧乙烷(diepoxyethaan)。在本领域，以这种方法引入基因突变的方法是众所周知的。
同样的，构建用于诱变方案的载体的方法是众所周知的(Sambrook等人，分子克隆实验室手册(Molecular Cloninga LaboratoryManual)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，最新版)。而且，至今为止，定点诱变、附加序列的连接、PCR、DNA测序和合适表达系统的构建的技术在本领域是众所周知的。编码所需蛋白质的部分或全部DNA可用标准的固相技术合成，优选地包括限制性位点以便于连接。
从前面对本发明的详细描述中，本领域技术人员对引入基因破坏的突变或未标记基因的缺失以及转化和接合方法的修改和变更是清晰明白的。这些修改和变更包括在本申请的范围内。
根据本发明的另一个方面，可利用有多基因失活的微生物积累类固醇中间体。优选地，积累的产物是9α-羟基-4-雄烯-3，17-二酮。起始物可能取决于被灭活的酶基因。例如，合适的起始物是植物甾醇或4-雄烯-3，17-二酮。优选的起始物是4-雄烯-3，17-二酮。
本方法的一个优点是可获得从起始类固醇到积累产物的高转化产率。产率可以超过80％，优选地可超过90％，并常常几乎可达到100％。
当然，本发明另一个方面涉及遗传上修饰的微生物，这些微生物中多个参与类固醇降解的基因被失活。特别的，这些基因是脱氢酶。优选地，至少kstD1或kstD2基因被失活。尤其优选的是基因kstD1和kstD2都被失活。优选是属于红球菌属的微生物。最优选的是菌株红串红球菌RG1-UV29。
微生物菌株红串红球菌RG1-UV29和红串红球菌RG1已被保藏在Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und ZellkulturenGmbH(DSMZ)，Mascheroder Weg Ib，D-38124 Braunschweig，Germany，编号分别为DSM13157和DSM13156。它们是按照Budapest条约保藏的。
本领域技术人员了解怎样使用本文所描述和提到的方法和材料，来构建缺乏降解类固醇核的能力的微生物。多个编码其它几种类固醇核降解酶的基因可类似地被失活。
以下是本发明的解说性实施例，而不应理解为是对本发明范围的限制。
图例
图1红串红球菌SQ1中类固醇核降解的示意图。3-酮类固醇Δ1-脱氢酶(KSTD)同工酶的位置用KSTD1和KSTD3显示。
图2带有反选择标sacB的诱变载体pSDH422的示意图。该载体用于构建含一段1062bp未标记的kstD1基因缺失的菌株RG1。ORF2和ORF3是红串红球菌SQ1中kstD1的侧翼基因。
图3野生型红串红球菌SQ1和经单次交换事件分别在kstD1的靶基因座下游(菌株SDH422-3)和上游(菌株SDH422-4)整合了pSDH422后的kstD1的分子结构示意图。插入窗口用kstD1作探针，对经BamHI消化的红串红球菌染色体DNA进行Southern分析。野生型(泳道1)，菌株SDH422-3(泳道2)，SDH422-4(泳道3)和两个独立的kstD1缺失突变体(泳道4和5)。
图4在红串红球菌SQ1 UV-29的6升培养物中，4-雄烯-3，17-二酮向9α-羟基-4-雄烯-3，17-二酮的生物转化。10克/升AD(-O-)和20克/升AD(-△-，-◆-，-×-)图5在红串红球菌RG8的6升培养物中，4-雄烯-3，17-二酮向9α-羟基-4-雄烯-3，17-二酮的生物转化。10克/升AD(-△-，-×-)实施例实施例1 kstD1的鉴定从简单节杆菌、睾丸酮丛毛单胞菌和不透明诺卡氏菌的已知KSTD蛋白质序列N末端部分的比对，获得一条简并kstD寡核苷酸探针[5’ttcgg(c/g)gg(c/g)ac(c/g)tc(c/g)gc(c/g)tactc(c/g)gg(c/g)gc(c/g)tc(c/g)atctgg](SEQ ID NO2)。将经BglII消化的红串红球菌SQ1总DNA经蔗糖梯度离心测定大小。得到的各组分在68℃下进行DNA印迹分析(按以下方式严格清洗2×SSC清洗2×15分钟和0.1×SSC清洗2×10分钟)，获得与地高辛标记的kstD寡核苷酸探针杂交的6kbDNA片段。将该片段连接到红球菌大肠杆菌穿梭载体pDA71(Dabs等人，1995改良的红球菌质粒载体的发展和它们在克隆基因的潜在商业和医用重要性，p.129-135.在第九次放线菌讨论会会议录，莫斯科，俄罗斯)的BglII位点，并亚克隆到经BamHI消化的pBluescriptII KS(Stratagene)(pSDH200)上。
从限制性图谱分析，我们断定该6kb片段只存在一个EcoRV位点，该位点将其平分成两个大小相等，约3kb的片段。DNA印迹分析显示，pSDH200的一个大约2.9kb的EcoRV片段含有与kstD寡核苷酸同源的序列。核苷酸测序分析表明有一段1533个核苷酸的开放阅读框(kstD1，见SEQ ID NO1)编码KSTD1，该序列通过在大肠杆菌中异源表达被证实。进一步的核苷酸测序分析表明有两个开放阅读框，即1533个核苷酸(开放阅读框1)和627个核苷酸(开放阅读框2)，分别编码推测的含510个氨基酸的蛋白质和含208个氨基酸的蛋白质。
实施例2 KstD1缺失菌株构建含有一段带有kstD1缺失的红串红球菌SQ1染色体DNA片段的诱变载体。缺失pSDH200中一段编码KSTD1一个大的内部部分的1062bp BsmI片段，构建成pSDH200)BsmI。为构建这样的诱变载体，将pSDH200)BsmI的一段2724bp的SamI/EcoRI片段克隆到pK18mobsacB(pSDH422，见图2)的SmaI/EcoRI位点，该片段包含剩余468bp的kstD1和它的侧翼区域。将载体pSDH422(编码卡那霉素抗性用于选择该诱变载体在染色体上的整合，包含枯草芽孢杆菌的sacB基因用于反选择)引入大肠杆菌S17-1，并通过以下描述的接合作用转移到红串红球菌SQ1中。将红串红球菌SQ1受体菌株细胞铺展在加有30微克/毫升的萘啶酮酸的LBP琼脂上，生长5天。通过转化作用，将诱变载体pSDH422首先引入大肠杆菌S17-1。
将在选择培养基(卡那霉素25微克/毫升)上过夜生长的转化体(大约每个平板1000个)，在室温下再孵育24小时。将红球菌和大肠杆菌菌株的菌落重新悬浮在最终体积为1.5毫升的LBP(1％细菌蛋白胨(Dif)，0.5％酵母提取物(BBL)和1％NaCl)中。将每种菌株的750微升等分试样混合，并温和地离心使其沉淀。将沉淀重新悬浮在1毫升LBP中，并将细胞以250微升等分铺展在非选择LBP琼脂上。经30℃过夜生长后，将铺满生长的物质重新悬浮在2毫升LBP培养基，并以100微升等分试样铺展在加有卡那霉素(200微克/毫升)和萘啶酮酸(30微克/毫升)的LBP琼脂上。3天后，红串红球菌SQ1转接合子出现。所有产生的卡那霉素抗性(kanr)红球菌转接合子对蔗糖敏感(sucs)；经复制铺板在加有200微克/毫升卡那霉素的LBPS(1％细菌蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl和10％蔗糖)琼脂上，没有生长出现。
对野生型(泳道1约4500bp的单一条带)和两种转接合子，SDH422-3(泳道2大约2900bp和10100bp的两条带)和SDH422-4(泳道3大约4000bp和9000bp的两条带)的Southern印迹分析(图3)显示，这两者都保持有pSDH422的一个拷贝，通过一次重组事件整合在靶位置。经非选择条件下过夜生长后，红串红球菌SDH422-3菌株中的kstD1基因缺失。通过在选择培养基即LBPS琼脂板上连续铺平板观察到该基因缺失。
经非选择条件下的过夜生长和在选择培养基即LBPS琼脂板上连续铺平板，达到了kstD1的基因缺失。对9个sucr/kans菌落进行菌落PCR，用kstD1引物(正向引物[5’gcgcatatgcaggactggaccagcgagtgc](SEQ ID NO3)；反向引物[5’gcgggatccgcgttacttcgccatgtcctg](SEQID NO4))，得到6个片段长度为468bp的PCR产物，其中包括缺失的kstD1基因。在60℃(按以下方式严格清洗2×SSC清洗2×5分钟，0.1×SSC清洗2×5分钟)以地高辛随机标记的kstD1基因为探针进行的Southern印迹分析证实了基因缺失。染色体DNA经BamHI酶切消化后，在野生型中得到的是4.5kb的kstD1 DNA片段，在基因缺失突变体中，该片段减少成为3.4kb，这表明预期的1062bp kstD1 DNA片段被缺失了。将得到的菌株命名为红串红球菌RG1。
实施例3 由紫外线诱变对类固醇Δ1-脱氢作用进行失活将培养在10mM葡萄糖矿物培养基(K2HPO44.65克/升，NaH2PO4·H2O1.5克/升，NH4Cl 3克/升，MgSO4·7H2O 1克/升，Vishniac微量元素，pH7.2)、处于晚指数生长期的红串红球菌RG1细胞(2×108CFU/毫升)经短时间超声处理得到单个细胞。将经稀释的样品(104)涂布在葡萄糖矿物琼脂培养基上，用紫外灯(飞利浦TAW 15瓦)在距离27厘米处照射15-20秒，平均使95％细胞死亡。经过4天培养，将菌落复制铺板在4-雄烯-3，17-二酮(0.5克/升，溶解在50毫克/毫升的DMSO中)矿物琼脂培养基。3-4天后，将得到的类固醇生长缺陷突变体筛选出来做进一步鉴定。为筛选出Δ1-脱氢作用被阻断的菌株，对突变种群筛选能在1，4-雄二烯-3，17-二酮(0.25克/升)矿物琼脂培养基生长的4-雄烯-3，17-二酮生长缺陷突变体。可以断定该基因失活了。该基因被称为kstD3(见
图1)实施例4 紫外线突变体红串红球菌UV-29对4-雄烯-3，17-二酮的微生物9α-羟基化作用红串红球菌SQ1 UV-29是一种紫外线突变体，能将浓度为10-20克/升的4-雄烯-3，17-二酮(AD)转化成9α-羟基-4-雄烯-3，17-二酮(9αOH-AD)。
按以下方法进行该转化将红串红球菌SQ1 UV-29在250毫升三角瓶的75毫升无菌培养基(1.5％酵母提取物，1.5％葡萄糖；pH7.0)中，在旋转振荡器(180转/分)上28℃培养24小时(预培养物)。向含6升原位灭菌的发酵液体培养基(1.5％酵母提取物，1.5％葡萄糖，0.01％消泡剂聚丙二醇；pH7.5)的10升发酵罐中接种预培养物(1％)，在喷射无菌空气的情况下28℃培养16小时，搅动培养基以诱导深层生长。然后加入含60克4-雄烯-3，17-二酮的300毫升多聚山梨酸酯(0.1％)的悬浮液。在搅动的情况下28℃继续进行有氧培养24小时。在HPLC测定类固醇组成之前，培养物样品用甲醇(70％)抽提，以及死端0.45微米滤器过滤。按同样的程序进行三次，其中通过加入120克而不是60克AD，使AD浓度为以前的2倍，即20克/升。
如图4所示，在24小时内，10-20克/升的4-雄烯-3，17-二酮几乎全部转化成9α-羟基-4-雄烯-3，17-二酮(约占全部4-雄烯-3，17-二酮的93％)。
实施例5 kstD2鉴定通过电转化，将红串红球菌RG1基因文库引入感受态红串红球菌菌株RG1-UV29。将得到的菌落复制铺板到以4-雄烯-3，17-二酮(0.5克/升)为唯一的碳源和能量来源的矿物琼脂培养基平板上。经过3天30℃培养，对菌株RG1-UV29表型的互补进行评分。将生长在4-雄烯-3，17-二酮矿物琼脂培养基上的菌落在LBP培养基中培养，以分离质粒DNA，随后将质粒DNA重新引入菌株RG1-UV29以检测真正的互补。将显示在4-雄烯-3，17-二酮矿物培养基中恢复生长的转化体中分离得到的质粒pKSD101引入大肠杆菌DH5α，以做进一步分析。在pKSD101中鉴定到有一个大约6.5kb的红球菌DNA插入片段，对其进行限制性图谱分析、亚克隆以及后续的互补实验。pKSD101的一个3.6kb EcoRIDNA片段仍能恢复菌株RG1-UV29的表型，因此将它亚克隆到pBluescrip(II)KS(pKSD105)，以测定核苷酸序列。对核苷酸序列分析表明存在-个大的1698个核苷酸的开放阅读框(ORF)，编码565个氨基酸的推测蛋白质，其计算分子量为60.2kDa。将该ORF命名为kstD2(SEQ ID NO5)(它与前面提到的kstD3相同，见实施例3)。推测的kstD2氨基酸序列表现出与已知的3-酮类固酮Δ1-脱氢酶(KSTD)有很高的相似性，这表明在红串红球菌RG1中，kstD2编码另一个KSTD酶。
实施例6 kstD2缺失菌株红串红球菌菌株RG7是突变菌株，从野生型红串红球菌菌株SQ1得到，含有一个kstD2基因缺失。红串红球菌菌株RG8是通过将野生型红串红球菌菌株SQ1两个编码3-酮类固醇Δ1-脱氢酶活性的基因(即kstD1和kstD2)连续缺失而得到。通过由kstD1缺失突变体红串红球菌菌株RG1的基因组中缺失kstD2基因得到菌株RG8。除了所用的诱变载体(pKSD201对pSDH422)不同之外，缺失kstD2基因的方法与实施例2中提到的缺失kstD1基因的方法相似。
诱变载体pKSD201按以下方法构建。通过MluI消化将kstD2基因的一个1093bp的内部DNA片段缺失，随后pKSD105自连接，构建出pKSD200。将pKSD200的一个含有突变kstD2基因的2.4kb EcoRI片段连接到经EcoRI酶切的pK18mobsacB，构建出pKSD201。将质粒pKSD201引入大肠杆菌S17-1，通过接合转移到红串红球菌菌株SQ1(以构建菌株RG7)或菌株RG1(以构建菌株RG8)。因pKSD201靶向整合到基因组产生的转接合子(sucskanr)在30℃培养3天后出现。将筛选到的一个转接合子(sucskanr)在非选择条件下(即LBP培养基)过夜培养，随后铺平板在选择LBPS琼脂培养基，得到kstD2的缺失。对15个sucs/kanr菌落进行菌落PCR，用kstD2引物(正向引物[5’gcgcatatggctaagaatcaggcaccc](SEQ ID NO6))，反向引物[5’gcgggatccctacttctctgctgcgtgatg](SEQ ID NO7))，得到4个片段大小为0.6kb的PCR产物，其中包含kstD2基因剩余的部分。用地高辛标记的kstD2基因做探针对经Asp718消化的野生型染色体DNA和获得的4个突变体的染色体DNA进行Southern印迹分析，证实了kstD2的缺失野生型的2.4kb Asp718 DNA片段在突变菌株中减少成1.3kb。
实施例7 红串红球菌菌株RG8对4-雄烯-3，17-二酮的微生物9α-羟基化作用红串红球菌RG8是kstD1和kstD2的双重缺失突变体，能将浓度为10克/升的4-雄烯-3，17-二酮(AD)转化成9α-羟基-4-雄烯-3，17-二酮(9αOH-AD)。
按以下方法进行转化将红串红球菌RG8生长在250毫升三角瓶的75毫升无菌培养基(1.5％酵母提取物，1.5％葡萄糖；pH7.0)中，在旋转振荡器(180转/分)上28℃培养24小时(预培养物)。向含6升原位灭菌发酵液体培养基(1.5％酵母提取物，1.5％葡萄糖，0.01％消泡剂聚丙二醇；pH7.5)的10升发酵罐中接种预培养物(1％)，在喷射无菌空气的情况下28℃培养16小时，搅动培养基以诱导深层生长。然后加入含60克4-雄烯-3，17-二酮的300毫升多聚山梨酸酯(0.1％)的悬浮液。在搅动的情况下28℃继续进行有氧培养24小时。在这个过程中取样品。在HPLC测定类固醇组成之前，这些样品用甲醇(70％)抽提，以及死端0.45微米滤器过滤。这个过程进行两次。
如图5所示，在15小时内，10克/升的4-雄烯-3，17-二酮几乎全部转化成9α-羟基-4-雄烯-3，17-二酮(约占全部4-雄烯-3，17-二酮的92-96％)。序列表<110>AKZO NOBEL N.V.<120>类固醇的微生物9α-羟基化<130><140><141><160>7<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>2398<212>DNA<213>红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)<400>1ggacatgacg aacccacccc gagaaggggc gaggtcacgt cagtgtcgtg agagattcac 60cagaagcagg tcgcacccct tgcggatgtc gtactccgca tccgggatgg aaattcgacc 120gttgaggcac gattggatga ccccgaacca cagctgcatc agcagacgca acccggtgtt 180gtcttcctcg gtcgggttct cgatcccggc cgcatcgagg atgatctgcc ggaagccgcg 240atcgatcttg cccacgtccg gcaccgtcgc gacgttggcg gtactggacg actgcagcat 300cgcagtcgaa agggccggcc gacgcagtaa cccgcgagtc gcgcgcacca ggacctcgta 360cacggcgtcc tgcggattgg ccgactgcac ctgatgcttg gcgaaactgt cgccgatctg 420atcgatctgc tcgaccatca cagcgacgaa gaggtgcgtc ttcgaaggga aatagcggta 480gagagtgccg atggccacgc ctgcccgctt ggcaacttcg tgcatctgaa cccgtgagag 540ttctttctcg gtccccaatt cggcggccgc ttccagcatc cgcacatggc gcgcccgctg 600ctcgtccgaa ctgggctcag cagcgtccct gacctcggca attctcggca acgtcgcccc 660catcatcgat tatgtgtccc ggccgcgaac gaccgcgcta attctctcac ctggaccacc 720catctcggca tattgcccgc tcagtgggac ctggcatggc cttccagtgc cgtgcggtat 780tccgtggaca ccccaccctc ttggagtaag gacgcaatga tgcaggactg gaccagcgag 840tgcgacgtgt tggtagtcgg ctccggcggc ggagcgctga ccggcgcata taccgccgct 900gctcagggat tgacgacgat cgtcctcgag aaaaccgatc gtttcggcgg gacctccgcc 960tactcgggcg cctcgatctg gctcccaggt acccaggtgc aggaacgcgc cggacttccc 1020gactcgaccg agaatgcccg cacctatctg cgcgcgttgc tcggtgacgc cgagtccgag 1080cgccaggacg cctacgtcga gaccgctccc gctgtcgtcg ctctactcga gcagaacccg 1140aacatcgaat tcgagttccg tgcgttcccc gactactaca aagccgaagg ccggatggac 1200acgggacgct ccatcaaccc tctcgatctc gatcccgccg acatcggtga cctcgccggc 1260aaggtgcgtc cggaactgga ccaagaccgc accggtcagg atcatgctcc cggcccgatg 1320atcggtgggc gcgcactgat cggccgtctg ctggccgcag ttcagagcac cggtaaggca 1380gaacttcgca ccgaatccgt cctcacctcc ctgatcgtgg aagacggccg tgttgtcggc 1440gccgaggtcg aatccggcgg cgaaacccag cgaatcaagg cgaaccgcgg tgtcctgatg 1500gcagcaggcg gcatcgaagg caacgccgag atgcgtgagc aggcaggcac ccccggcaag 1560gcgatctgga gtatgggtcc cttcggcgcc aacaccggcg acgcgatctc tgccggtatt 1620gctgtcggcg gcgcaacagc cttgctcgat caggcgtggt tctgccccgg cgtcgagcag 1680cccgacggca gcgccgcctt catggtcggc gttcgcggtg ggctcgtcgt cgacagcgcc 1740ggtgagcgct acctcaacga gtcgcttccg tacgaccagt tcggacgagc catggatgct 1800cacgacgaca acggttctgc cgtgccgtcg ttcatgatct tcgactcgcg cgagggtggc 1860ggactgcccg ccatctgcat cccgaacacg gcgcccgcca agcacctcga agccggaacg 1920tgggtcggtg ccgacactct cgaagaactc gctgccaaga ccggactacc ggccgacgca 1980ttgcgcagca ctgtcgaaaa gttcaacgat gccgcaaaac tgggcgtcga cgaagagttc 2040catcgcggcg aagacccgta cgacgcgttc ttctgcccac ccaacggcgg tgcgaatgcg 2100gcactgacgg ccatcgagaa cggaccgttc tacgcggccc gcatcgtcct cagtgacctc 2160ggcaccaagg gcggattggt caccgacgtc aacggccgag tcctgcgtgc tgacggcagc 2220gccatcgacg gcctgtacgc cgccggcaac acgagcgcgt cactgagcgg ccgcttctac 2280cccggccccg gagttccact cggcacggct atggtcttct cgtaccgagc agctcaggac 2340atggcgaagt aacgcagttc aatcacactc cgtggaaaca gatcgtgggg cagccgat 2398<210>2<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述简并探针<400>2ttcggsggsa cstcsgcsta ctcsggsgcs tcsatctgg39<210>3<211>30<212>DNA<213>红串红球菌<400>3gcgcatatgc aggactggac cagcgagtgc 30<210>4<211>30<212>DNA<213>红串红球菌<400>4gcgggatccg cgttacttcg ccatgtcctg 30<210>5<211>1698<212>DNA<213>红串红球菌<400>5atggctaaga atcaggcacc ccccgcgaca caagccaagg acatcgttgt cgatctattg 60gtgatcgggt ccggtaccgg catggctgcc gctctcaccg cgaacgaact cggcttgtcc 120acgctgatcg tggagaagac gcagtacgtc ggcggttcga cggcgcggtc cggtggggcg 180ttctggatgc ctgccaaccc gatcttggcg aaagccggtg cgggcgacac cgttgagcga 240gcgaagacat acgtgcgttc ggtggtcggt gatactgccc ctgcccaacg aggagaagca 300ttcgtcgaca acggtgcggc cactgtcgac atgctctacc gcacgacgcc catgaagttc 360ttctgggcca aggaatactc cgattaccac cccgaactgc cgggcggtag cgccgccgga 420cgtacctgcg agtgcctgcc gttcgacgcg tcggtactgg gagcggaacg cggtcgcctg 480cgcccaggtt tgatggaagc cggactgccg atgccggtga cgggtgcgga ttacaagtgg 540atgaacctga tggtgaagaa gccgagcaag gcttttcccc gcatcatccg ccgcctggcg 600caaggcgttt acggcaagta cgtcctcaag cgtgaataca tcgcgggcgg tcaggcgctc 660gccgccggac tgttcgccgg tgtggtccag gccggtatcc cggtgtggac ggaaacgtcg 720ttggttcggc tcatcaccga agatggccgc gtaacgggtg cagttgtggt gcaagacgga 780cgtgaagtga cggtgaccgc tcggcgcggt gtcgtcctgg cagccggcgg gttcgaccac 840aacatggagt ggcgccacaa gtaccagtcg gagagcctcg gtgagcatga gagcctgggc 900gcagagggca acaccggcga agcgatcgag gcagcacaag agctcggtgc aggtatcgga 960tcgatggatc agtcctggtg gttccccgcg gtggcaagca tcaagggccg cccgccgatg 1020gtgatgctcg cagagcgtgc gctgcccggc tctttcatcg tcgaccagac cggtcgtcga 1080ttcgtgaacg aggcgacgga ctacatgtcg ttcggccagc gcgtgctcga acgggaaaag 1140gctggcgatc cggccgagtc gatgtggttt gttttcgacc aggagtaccg caacagctac 1200gtgttcgcag gcggtatctt cccccgtcag ccccttccgc aggcattctt cgagtccggc 1260atcgcgcacc aggcgagcag tccggccgaa ctcgcccgca aggtcggtct ccccgaggat 1320gcgtttgccg agtccttcca gaagttcaac gaggccgctg ctgcaggtag cgatgcggag 1380ttcggtcgcg gcggcagcgc atacgatcgg tactacggcg acccgacagt gtctccgaac 1440ccgaatctgc gccagctcga caagagcgcc ctctatgcgg tgaagatgac gctcagcgac 1500ctgggcacct gcggcggtgt gcaggcggac gagaatgcac gcgtgcttcg tgaggacggc 1560agcgtcatcg acggcctgta cgcgatcggc aataccgcgg ccaacgcatt cggtcacacc 1620tacccaggcg ccggcgcgac gatcggccag gggctggttt acggatacat cgcggcccat 1680cacgcagcag agaagtag 1698<210>6<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述正向引物<400>6gcgcatatgg ctaagaatca ggcaccc27<210>7<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述反向引物<400>7gcgggatccc tacttctctg ctgcgtgatg 30
权利要求
1.构建类固醇降解微生物缺乏降解类固醇核的能力的经遗传修饰菌株的方法，包括使多个参与类固醇核降解的基因失活。
2.根据权利要求1的方法，其中该方法包括使多个类固醇脱氢酶基因失活。
3.根据权利要求2的方法，其中首先失活的基因是kstD1或kstD2。
4.根据权利要求3的方法，其中第-个失活的基因是被破坏或缺失。
5.根据权利要求3的方法，其中是通过未标记基因缺失将第-个基因缺失。
6.根据权利要求3-5的方法，其中任何后续基因是通过紫外线辐射失活的。
7.根据权利要求3-6的方法，其中任何后续基因是通过未标记基因缺失的。
8.根据权利要求5的方法，其中第二个基因是通过未标记基因缺失缺失的。
9.根据权利要求1-8的方法，其中所述微生物是红球菌属(Rhodococcus)，优选红串红球菌(R.erythopolis)。
10.根据权利要求1-9的方法制备的微生物。
11.根据权利要求10的微生物，其中至少kstD1和kstD2二者都被失活。
12.经遗传修饰的菌株红串红球菌RG1-UV29。
13.根据权利要求10-12的微生物用于通过所述微生物在含有4-雄烯-3，17-二酮的培养基上的生长制备9α-羟基-4-雄烯-3，17-二酮的用途。
14.编码由SEQ ID NO1的核苷酸820-2329所编码的KSTD蛋白的核苷酸序列。
15.编码由SEQ ID NO5的核苷酸1-1678所编码的KSTD2蛋白的核苷酸序列。
全文摘要
描述了一种构建类固醇降解微生物的遗传修饰菌株的方法，其中参与类固醇核降解的多个基因，例如类固醇脱氢酶基因被失活。这些基因的例子是kstD1和kstD2。有多个失活的类固醇降解酶基因的菌株能用于高产率积累类固醇中间体，一种优选的积累产物是9α－羟基－4－雄烯－3，17－二酮。
文档编号C12N9/02GK1413260SQ00817567
公开日2003年4月23日 申请日期2000年10月17日 优先权日1999年10月22日
发明者R·范德盖兹, G·赫塞尔斯, L·迪杰奎兹恩 申请人:阿克佐诺贝尔公司