制备芳香醛和/或羧酸的微生物方法

专利名称：制备芳香醛和/或羧酸的微生物方法
技术领域：
本发明涉及一种使用表达二甲苯单加氧酶或链烷单加氧酶的重组微生物制备芳香醛和/或羧酸衍生物的氧化微生物方法。
二甲苯单加氧酶(XMO)，例如通过恶臭假单胞菌mt-2的TOL质粒pWWO编码的，是在分解甲苯和二甲苯中起关键作用的一种酶体系。XMO属于烷基羟化酶族并选择性地羟化芳香环上的甲基。这是代谢途径的第一步(参见


图1(A))，它导致形成羧酸衍生物，然后羧酸衍生物通过分支分解代谢途径(meta-Abbauweg)转变成三羧酸循环的底物。
XMO是由基因xylM和xylA(xylMA基因库登记号M37480)编码的两个多肽亚单元XylM和XylA组成的。XylA是一种NADH受体还原酶，即一种从NADH向XylM转移还原当量的电子传递蛋白，一种位于膜中的羟化酶。
XylM活性依赖于磷脂类和Fe(II)离子的存在并且pH最佳值为7。XylM的氨基酸系列显示与食油假单胞菌GPol链烷羟化酶的羟化酶组分AlkB的氨基酸系列有25％相同。
链烷羟化酶是中度链长链烷的分解代谢途径中的第一种酶，在该途径中有一系列酶参与，它们是在分解代谢OCT质粒上由两个alk基因簇编码的。
图1(A)所示代谢途径中的第二种酶是苯甲醇脱氢酶(BADH)，它是含锌脱氢酶族中的一种同源二聚体成员，其底物是长链醇。这种酶由xylB基因编码。
图1(A)所示代谢途径中的第三种酶是苯甲醛脱氢酶(BZDH)，又是一种同源二聚体，并且是由xylC基因编码的。
上述基因和酶的功能和性能的更详细的信息可以在参考文献(1)-(18)中找到。
以它们表达XMO的方式遗传工程的大肠杆菌证实不仅能够氧化甲苯和二甲苯，而且能够氧化间-和对-乙基-、甲氧基-、硝基-和氯-取代的甲苯和间-溴-取代的甲苯，从而得到相应的苯甲醇衍生物(19，20)。将苯乙烯氧化为氧化苯乙烯(ee 95％)。此外，还猜测XMO催化
图1(A)所示代谢途径中的第二步，即体内氧化(即在试验中在完全活的细胞上)苯甲醇得到相应的醛(2，21)。也已经观察到在
图1(A)所示的代谢途径第三步之后苯甲醛转变成苯甲酸，但是将其归于大肠杆菌中的非特异性脱氢酶(2)。与之相反，用部分纯化的XylMA(也同含义地用于XMO的本说明书中，即用于由两个多肽亚单元，即XylM和XylA组成的功能酶)在体外进行的进一步试验，已显示这种酶相对于苯甲醇没有活性(9)。这种不符合的原因还不清楚。
由于二甲苯单加氧酶和链烷单加氧酶之间的优异同源性(AMO，也称之为链烷羟化酶；基因库登记号AJ245436)，因此本领域技术人员希望就催化反应的性质和程度而言的两个体系具有相似的限制。
现有技术中关于制备芳香醛或羧酸的生物催化方法，由于似乎需要大量酶才能进行这些方法，因此一直不令人满意。同样地，由于需要区域选择性和化学选择性，因此证实难以化学合成。
本发明的目的是提供一种简单地制备芳香醛和/或羧酸的方法。
已发现根据本发明，出人意料地，通过简单的微生物制备方法就实现了该目的。具体地说，本发明基于出人意料地发现XMO和AMO分别能够催化
图1(A)和1(B)中所示反应途径的每一步，即将烷基取代的芳香化合物经过相应的醇衍生物和相应的醛衍生物作为中间产物氧化得到其羧酸衍生物。还出人意料地发现，使用XMO基因的特定表达体系，即xylM和xylA，可以获得在表达XMO的重组大肠杆菌上比早期研究高10-20倍的活性(20，21)。
因此本发明的第一个主题是一种制备通式I的芳香醛和/或羧酸的方法Ar-(CH2)n-R1(I)其中Ar是任选地单取代或多取代的单核芳香环，R1是含氧基团-CHO或-COOH，和n是0-15的整数，例如0-12，1-6或6-12，所述方法包括a)培养，具体地说在含有通式II的芳香底物的培养基中需氧培养表达选自以下酶的微生物二甲苯单加氧酶(XMO)和链烷单加氧酶(AMO)，Ar-R2(II)其中
Ar定义如上，并且R2是-CH＝CH2或-(CH2)n+1R3，其中n定义如上，并且R3是H或OH；或者，如果R1是-COOH时，R2也可以是-(CH2)nR4，其中n定义如上，并且R4是-CHO，和b)将通式I的化合物与培养基分离。
因此，本发明的反应可以使用相同酶以一步或多步进行。可以使用的底物是烷化芳香化合物、相应的醇或相应的醛。所用底物的氧化程度可以以如上所述的简单方式加以控制。
无需受理论的约束，根据质谱法获得的碎片化模式的18O加入试验显示XMO催化的醇氧化的最可能的机理是通过形成作为中间产物的偕二醇(geminalen Diols)，然后将其脱氢，可能以非立体专一性方式，得到其醛进行的(参见图6)。
本发明制备或者用作底物的通式I和II的化合物中的芳环体系可以经过单取代或多取代。该环取代基的位置可以按所需进行选择。然而，优选待氧化的侧链的间位和/或对位。
可以根据本发明的方法通过XMO氧化的通式II的底物的特定非限制性实例是甲苯、二甲苯、苯乙烯、间-和/或对-甲基-、乙基-、甲氧基-、硝基-和氯-取代的甲苯、和间-溴-取代的甲苯和假枯烯(即三甲基苯)；和这些化合物的相应的醇和醛。根据本发明的方法可以被AMO氧化的通式II的底物的特定非限制性实例是甲苯、乙基苯、正-和异-丙基苯、正丁基苯和这些化合物的间-和/或对-甲基-、乙基-、甲氧基-、硝基-和氯-取代的类似物；和这些化合物的相应的醇和醛。
优选使用以下酶进行本发明的方法XMO，根据xylMA基因库登记号M37480的基因xylA和xylB编码，以及相应的同工酶。XMO优选得自假单胞菌属，具体地说是恶臭假单胞菌，优选菌株mt-2(ATCC 33015)。
AMO，根据基因库登记号AJ245436的基因alkB、alkG和alkT编码的，以及相应的同工酶(例如alkB的同工酶)。AMO优选得自假单胞菌属，具体地说是食油假单胞菌，优选菌株GPol(ATCC 29347)。
本发明还包括已具体公开的XMO和AMO的“功能等价物”的用途。
已具体公开的单加氧酶的“功能等价物”或类似物就本发明目的而言是彼此不同、连续显示所需反应并且可用于制备上面通式I的醛和/或羧酸的酶。
根据本发明，“功能等价物”应理解为，特别是，在至少一个系列位置具有除最初氨基酸之外的氨基酸的酶突变体，尽管如此，但是它催化上述氧化反应中的一种。因此，“功能等价物”包括能够通过添加、置换、缺失和/或翻转一个或多个氨基酸获得的突变体，可以在任意系列位置发生所述修饰，只要它们使得突变体具有本发明的催化活性。功能等价物尤其还存在于当突变体和未修饰酶之间的反应性图谱(Reaktivit_tsmuster)在量方面相同时，即例如当相同的底物以不同速度转化时。
自然，“功能等价物”还包括可以由其它生物体，例如由本文具体提及的那些之外的细菌获得，并且天然存在变体或同工酶的单加氧酶。例如，同源系列区域的区域可以通过系列对比的方式确定，并且可以参照本发明的特定说明测定等价酶。
本发明还包括除了特定提及的那些(单链和双链DNA和RNA系列)之外编码上述单加氧酶及其功能等价物之一的核酸系列的用途。可用于本发明的其它核酸系列因此与通过添加、置换、插入或缺失一个或多个核苷酸特异性使用的系列不同，但是连续编码具有所需性能图谱的单加氧酶。
与具体提及的系列相比，含有所谓的沉默突变或者通过使用特定来源的微生物或宿主微生物的密码子经过修饰的这些核酸系列的用途也包括在本发明内，如天然存在的变体，例如其剪接变体。另一主题是能够通过保守核苷酸置换获得的系列(即，所讨论的氨基酸被相同电荷、大小、极性和/或溶解度的氨基酸替换)。
而且本发明的主题还有表达构建体，含有在调节核酸系列的遗传控制下，编码用于本发明的单加氧酶的核酸系列；以及含有至少一种这些表达构建体的载体。本发明的这些构建体优选包括所讨论的编码系列的5′-上游、启动子和3′-下游、终止子系列和，如果适宜的话，其它常规调节成分，在每种情况下与编码系列可操纵地相连。“操纵相连”应理解为启动子、编码序列、终止子和，如果适宜的话，其它调节成分以表达其编码序列时每个调节成分可以实现其所需的功能的序列排列。能够可操纵地相连的序列的例子是靶序列和翻译增强子、其它增强子、多腺苷酸化信号等。其它调节成分包括可选择性标记、扩增信号、复制源等。
除了人工调节序列之外，在实际构建基因之前也可以存在天然调节序列。该天然调节可以(如果合适的话)通过遗传修饰来关掉，并且可以增加或减少基因的表达。然而，所述基因构建体也可以具有较简单的结构，也就是说在构建基因之前没有插入其它调节信号，并且没有除去具有其调节作用的天然启动子。相反，天然调节序列以不再进行调节并且使基因表达增加或减少的方式突变。核酸序列的一个或多个拷贝可以存在于所述基因构建体中。
有用的启动子的例子是cos、tac、trp、tet、trp-tet、lpp、lac、lpp-lac、lacIq、T7、T5、T3、gal、trc、ara、SP6、1-PR或1-PL启动子(它们都有益地用于革兰氏阴性菌中)、和革兰氏阳性启动子amy和SPO2、酵母启动子ADC1、MFa、AC、P-60、CYC1、GAPDH或植物启动子CaMV/35S、SSU、OCS、lib4、usp、STLS1、B33、not、或遍在蛋白或菜豆球蛋白启动子。特别优选使用可诱导性启动子，例如光-或温度-可诱导性启动子，例如PrPl启动子。
原则上，可以使用所有具有其调节序列的天然启动子。此外，也可以有益地使用合成启动子。
希望上述调节序列能够靶表达核酸序列和蛋白质表达。例如，根据宿主生物体，这可以意思是该基因仅在诱导之后表达或超表达，或者它立即表达和/或超表达。
调节序列或因子可以优选对表达具有正效果，因此使其增加或降低。因此，可以使用强转录信号，如启动子和/或增强子以转录水平使调节成分有益地增强。然而，也可以增强翻译，例如通过提高mRNA稳定性。
本发明的表达试剂盒可以通过将合适的启动子与合适的单加氧酶核苷酸序列和终止子信号或多腺苷酸化信号融合来产生。为此可以使用常规重组和克隆技术，如T.Maniatis等(24)、以及T.J.Silhavy等(32)和Ausubel，F.M.等(33)中所述的。
就合适宿主生物体中的表达而言，有益地将重组核酸构建体或基因构建体插入宿主特异性载体中，所述载体能够在宿主中最佳地表达所述基因。载体对本领域技术人员为公知并且可以在例如“CloningVectors”(Pouwels P.H.等(34))中找到。
除了质粒之外，载体也可以理解为本领域技术人员已知的所有载体，例如噬菌体、病毒，如SV40、CMV、杆状病毒和腺病毒、转座子、插入序列、质粒、粘粒和线性或环DNA。
这些载体可以在宿主生物体中自动或染色地复制。
借助本发明的这些载体，可以产生重组微生物，所述微生物例如用本发明的至少一个载体转化并且可以用于本发明的方法中。将本发明的上述重组构建体有益地加入合适宿主体系中并在其中表达。为此，优选使用本领域技术人员已知的常规克隆转染法，例如共沉淀、原生质体融合、电穿孔、逆转录病毒转染等，以便在讨论的表达体系中表达上述核酸。合适的体系例如描述在Current Protocols inMolecular Biology，F.Ausubel等(35)。
合适的宿主生物体原则上是能够表达本发明核酸、其等位变体、其功能等价物或其衍生物、并且能够用于本发明的微生物氧化反应的所有生物体。宿主生物体应理解为例如细菌、真菌、酵母、植物细胞或动物细胞。优选的生物体是细菌。
然而，使用的优选的表达XMO的微生物是基本上没有苯甲醇脱氢酶(BADH)和/或苯甲醛脱氢酶(BZDH)活性的那种。
进一步优选使用那些基本上没有链烷醇脱氢酶(AODH)和/或链烷醛脱氢酶(AADH)活性并且分别由基因alkJ和alkH编码的表达AMO的微生物。例如，可以使用的微生物是埃希氏杆菌属，例如大肠杆菌如菌株W3110、以及K12菌株之一，如JM101和DH5α、或者恶臭假单胞菌菌株之一，如菌株KT 2440。一些优选的大肠杆菌菌株的特性示于表I。
根据本发明使用建立的标准技术(24)来用载体转化微生物，因此省去其详细说明。
可以通过标记基因对成功转化的生物体进行选择，这些基因也存在于载体或表达试剂盒中。这些标记基因的例子是抗抗生素的基因和催化着色反应以使转化的细胞染色的酶的基因。然后可以通过自动细胞分选对这些细胞进行选择。用载体成功转化且载有抗抗生素(例如G418或潮霉素)的合适基因的微生物可以通过含有抗生素的合适固体或液体培养基来选择。存在于细胞表面的标记蛋白可用于通过亲和力色谱法选择。
将宿主生物体和载体匹配性生物体，例如质粒、病毒或噬菌体，例如具有RNA聚合酶/启动子体系的质粒、噬菌体λ或μ或其它温和噬菌体或转座子和/或其它有益调节序列结合构成表达体系。
在特别优选的实施方式中，使用用表达载体转化过的重组微生物，所述表达载体含有编码XMO的基因xylM和xylA或者编码AMO的基因alkB、alkG和alkT，它们可操纵地和例如在遗传控制食油假单胞菌GPol的alk调节体系下相连。
特别优选微生物用编码xylMA的表达质粒pSPZ3转化。
食油假单胞菌GPol的alk调节体系本身已知。上述两个alk基因簇中第一个的表达是在控制alkBp、alk启动子下并在有功能性调节蛋白alkS的情况下开始的，所述alkS是通过第二个alk基因簇并在有诱导体如链烷，例如正辛烷、或者与其显示相关性小的化合物，如二环丙基酮(DCPK)的情况下编码的(8，22，23)。在大肠杆菌中使用alk调节体系的优点是不发生分解代谢物阻抑。
在本发明的方法中优选将正辛烷和DCPK用作诱导体，为正辛烷时特别优选其量为0.001-0.5％(V/V)，为DCPK时特别优选其量为0.005-0.05％(V/V)。当然，也可以使用正辛烷和DCPK的混合物。如果使用这些浓度范围，那么可以获得诱导最大值。
本发明还涉及一种使用上面刚描述的重组微生物氧化上述类型的有机化合物的微生物方法。本发明所用的重组微生物可以通过已知方法培养和发酵。例如，细菌可以在TB或LB培养基中在20-40℃的温度和6-9的pH下繁殖。特别适合的培养条件描述在例如T.Maniatis等，loc.cit。
在使用上述重组维生素的本发明微生物氧化中，优选首先在有氧的情况下并在复合培养基，例如TB或LB培养基中在约20-40℃的培养温度或更高的温度和约6-9的pH下将所述微生物培养，直到达到足够的细胞密度。为了更好地控制氧化反应，优选使用可诱导性启动子。诱导生产单加氧酶之后，在有氧的情况下将该培养连续例如1小时-3天。然后将形成的氧化产物或氧产物混合物从培养基中分离出来并以常规方式纯化，例如通过萃取或色谱法。
本发明的反应也可以有利地在例如以固定化形式含有本发明的重组微生物的生物反应器中进行。
可以简单方式控制本发明所用物质的氧化度。例如，从培养基中规则地取出样品，并通过气相色谱法、使用联合的气相色谱和质谱系统(GC-MS)或高压液相色谱法测定其相应的醇衍生物、醛衍生物和/或羧酸衍生物的含量。根据所需的氧化衍生物、或者如果获得所需的混合比，那么停止培养。这可以例如通过从培养基中除去微生物或者将它们破坏，例如通过离心和倾析和/或通过用酸，如三氯乙酸处理、或者通过热处理来进行。也可以通过在氧化底物(例如甲苯或假枯烯)中计量来抑制酸形成。
然后可以借助常规分离方法，例如通过简单的蒸馏、分馏、精馏、如果合适的话在真空中、或者通过使用合适的色谱法，优选通过蒸馏将氧化的芳香物从培养基中分离出来。在这些产品分离之前方便地将微生物细胞从培养基中分离出来。
本发明优选的表达载体pSPZ3的构建描述在(31)Panke等，Applied and Environmental Microbiology(1999)2324-2332中，将其解释明确地引入本文作为参考。
为了本发明研究的目的，另一用于转化微生物的载体是除XMO基因xylM和xylA之外另外也以可表达的形式含有恶臭假单胞菌mt-2的苯甲醇脱氢酶(BADH)基因xylB的那种。为了将所述苯甲醇脱氢酶基因xylB在相对xylA基因的下游直接引入上述质粒pSPZ3，首先将质粒pCK04的含有xylB基因的2.3kb XhoI/FspI片段(25)引入XhoI和SmaI消化过的载体pGEM-7Zf(+)(Promega，Zurich，Switzerland)以产生pGEMAB。所述2.3kb片段从该构建体用XhoI和BamHI切除并连接至XhoI-和BamHI-消化过的质粒pSPZ3中。所得质粒命名为pRMAB(图2)。
然而，对pRMAB试验显示，如果除了XMO之外存在BADH，不仅苯甲醇较低活性地氧化成苯甲醛，而且的确发生逆反应并形成苯甲醇。
为了本发明研究的目的，质粒pRS(不含xyl基因)，构建成负对照。将pRMAB用BamHI和SmaI消化并用Klenow酶处理。将较大的片段分离并且然后将载体归类。
在下文中，参照具体非显著性实施例和图描述本发明的方法。
图1显示(A)通过上TOL代谢途径的酶逐步将甲苯氧化成苯甲醇、苯甲醛和苯甲酸，并将上TOL操纵子的xyl基因组织化。BADH和BZDH分别代表苯甲醇脱氢酶和苯甲醛脱氢酶。Pu代表上TOL操纵子启动子，xylW是具有未知功能的基因，xylC是编码BZDH的基因，xylM是编码XMO的末端羟化酶组分的基因，xylA是编码NADHXMO的受体还原酶组分的基因，xylB是编码BADH的基因并且xylN是具有未知功能的基因；(B)显示了将芳基取代的链烷通过链烷羟化酶(AMO)、链烷醇脱氢酶(AODH)和链烷醛脱氢酶(AADH)催化经相应的链烷醇和链烷醛逐步氧化得到链烷羧酸。
图2显示了在alk调节体系的控制下构建具有基因xylMA和xylMAB的表达质粒pSPZ3和pRMAB的示意图。alkBp代表alk操纵子的启动子，alkS是正调节物AlkS的基因。基因xylM*和xylA编码二甲苯单加氧酶(*意思是在xylM基因中已去掉NdEI位置。xylB基因编码BADH。Km代表抗卡那霉素的基因，并且T4t是T4噬菌体的转录终止子。
图3显示了通过大肠杆菌JM101(pSPZ3)(A)和大肠杆菌JM101(pRMAB)(B)氧化甲苯。将甲苯(1.37mM)加入到静息大肠杆菌JMIOI(pSPZ3/pBRMAB)细胞(2.07-2.14g*l-1CDW)的磷酸钾缓冲液(50mM)pH 7.4，1％(w/v)葡萄糖的悬液中。圆圈甲苯，方块苯甲醇、三角形苯甲醛，菱形苯甲酸，叉四种浓度的总和。
图4显示了通过大肠杆菌JM101(pSPZ3)(A、C、E)和大肠杆菌JM101(pRMAB)(B、D)氧化假枯烯、相应的醇和相应的醛。将所述底物(0.46mM)加入到静息大肠杆菌JM101(pSPZ3/pBRMAB)细胞(0.86-0.92g*l-1CDW)的磷酸钾缓冲液(50mM)pH 7.4，1％(w/v)葡萄糖的悬液中。图(A)和(B)显示假枯烯的氧化，图(C)和(D)显示3，4-二甲基苯甲醇的氧化，图(E)显示3，4-二甲基苯甲醛的氧化。圆圈假枯烯，方块3，4-二甲基苯甲醇，三角形3，4-二甲基苯甲醛，菱形3，4-二甲基苯甲酸，叉所有浓度的总和。
图5显示了XMO在大肠杆菌JM101(pSPZ3)中的生长和诱导动力学。图(A)显示了通过正辛烷诱导之后不同时间点下的二甲苯单加氧酶活性和细胞干重(CDW)，而图(B)和(C)代表了分别用不同量的正辛烷和二环丙基酮(DCPK)诱导3.5小时之后的相同值。对独立的培养物上进行各自的活性测定。将假枯烯(1.37mM)加入到静息大肠杆菌JM101(pSPZ3)细胞(2.04-2.44g*l-1CDW)的磷酸钾缓冲液(50mM)pH 7.4，1％(w/v)葡萄糖的悬液中。比活性以反应头5分钟时产物形成为基础。图(A)的箭头代表定时加入0.1％(v/v)正辛烷以便诱导XylMA合成。实心圆未诱导的培养物的CDW，空心圆诱导过的培养物的CDW，叉诱导过的培养物的比活性。
图6显示了苯甲醇经XMO催化形成苯甲醛的可能的机理解释。
常规方法，所用材料a)细菌和质粒表I细菌菌株和质粒
A*质粒仅含部分xylA基因。b)化学物质和酶所用的所有化学物质和酶都可商购获得，例如从Boehringer，Mannheim(Rotkreuz，Switzerland)、NEB(Schwalbach，Germany)、Gibco(Basel，Switzerland)、AGS(Heidelberg，Germany)、Promega(Zurich，Switzerland)、Fluka(Buchs，Switzerland)、Aldrich(Buchs，Switzerland)和Lancaster(Muhlheim，Germany)。根据厂商说明将得自Qiagen(Basel，Switzerland)的QIAprep-Spin-Miniprep-Kit用于质粒DNA的小规模制备。
c)重组方法为了构建所用的载体/质粒，并转染和转化细菌，使用例如Sambrook、Fritsch和Maniatis的教科书(24)中详细描述的标准重组方法。而且，优选参考节中所列的开始几页中的材料和方法。因此进一步的讨论可以省去。
d)细菌培养物将细菌在Luria-Bertani(LB)肉汤(Difco，Detroit，Mich.)或者在M9最小培养基(24)中培养，所述M9最小培养基含有3倍浓度的磷酸盐(M9*)和0.5％(w/v)葡萄糖作为唯一碳源。如果合适的话，向培养物中补充卡那霉素(最终浓度50mg/L)、氨苄青霉素(100mg/L)、氯霉素(30mg/L)、维生素B1(10-3％，w/v)、1mM吲哚和0.5mM IPTG(异丙基-β-D-l-硫代吡喃半乳糖苷)。固体培养基含有1.5％(w/v)琼脂。将液体培养物于30或37℃下在水平摇动器上以200rpm常规地生长。
e)测定酶活性为了简单起见，使用完整细胞测定酶活性。
1单位(U)定义为每分钟获得1μmol总产物的活性。比活性在这里以活性/g细胞干重(CDW)(Ug-1CDW)表示，本文下面将其简称为活性。平均活性是以转化开始5分钟内每g CDW形成的产物量为基础计算的。将试验各自独立地重复至少3次。
如下进行测定。将与讨论的载体重组过的大肠杆菌JM101在40或100ml培养基中在有卡那霉素的情况下培养。当450nm下的光密度为约0.3时，将这些细胞通过加入0.05％(v/v)DCPK或0.1％(v/v)正辛烷诱导，并连续培养3-3.5小时直到OD450通常升高至0.8-0.9。然后将这些细胞收获并在含1％(w/v)葡萄糖的50mM磷酸钾缓冲液pH7.4中再次悬浮至细胞干重为2.5g/l。将1或2ml份引入用塞子密封的Pyrex管中并在轨道摇动器上于30℃和250rpm下水平培养。5分钟之后，将正在讨论的底物以20倍浓原料乙醇液的形式加入至最终浓度为1.5mM。在测定3，4-二甲基苯甲酸形成的这些试验中，细胞干重降低至1g/l，并且讨论的底物由于微溶于水因此将其加入至最终浓度0.5mM。在摇动器上转化5分钟，然后将样品放置于冰中将其终止并立即用40或80μl高氯酸储备溶液(10％V/V)处理以便该悬液的pH为2。
f)测定作为时间函数的产物形成为了测定作为时间函数的产物形成，用讨论的底物将细胞生长、诱导、收集、再悬浮和培养不同的时间，即5，10，20，30，40和80分钟。然后，如上所述将转化终止，离心取出细胞(7800g，8min)，并分析上清液。
使用高效液相色谱法(HPLC)分离苯甲醇、苯甲醛和苯甲酸。所用柱是Nucleosil C18(孔径100_，粒径5μm，长度25cm，内径4mm)(Macherey-Nagel，Oensingen，Switzerland)，并且流动相为69.9％H2O/30％乙腈/0.1％ H3PO4，流速为0.7ml/min。使用具有相同流速但是具有64.9％ H2O/35％乙腈/0.1％ H3PO4的相同柱分离3，4-二甲基苯甲醇、3，4-二甲基苯甲醛和3，4-二甲基苯甲酸。检测是于210nm下通过紫外线吸收进行的。分离的化合物通过将其保留时间与商购获得的标准的化合物比较进行检测。
当为甲苯/假枯烯以及相应的醇、醛和酸时，通过气相色谱法进行分离。所述气相色谱仪(Fisons Instruments，England)配备有Macherey-Nagel(Oensingen，Switzerland)的OPTIMA-5型毛细管柱(长度25m，内径0.32mm，膜厚0.25μm)。所用载气体是氢，并在没有分开的情况下进行注射。使用以下温度曲线40℃-70℃以15℃/min、70℃-105℃以5℃/min和105℃-240℃以20℃/min。通过火焰离子化检测器检测这些化合物。分离的化合物通过将其保留时间和商购获得的标准的化合物比较进行检测。或者，也可以使用质谱仪(联合GC-MS系统)进行检测。后者的优点是不仅其特定色谱保留时间、而且单个峰的碎片化模式和强度分布可用于定量和定性测定反应产物。
联合的GC-MS系统由Fisons MD-800型质谱仪和配备有CP-Sil-5CB柱(Chrompack，Netherlands)的气相色谱仪(FisonsInstruments，England)组成。所用载气体是氦。注入是分开的(20∶1)。温度程序与上述气相色谱法分离中的相同。
将相同体积的含有0.1mM十二碳烷作为内标的冰冷醚加入到气相色谱法和联合的GC-MS系统中的样品中。然后，加入氯化钠至饱和并在30℃下通过剧烈振动5分钟来萃取水相，其中，相通过离心分离。将有机相在无水硫酸钠上干燥然后分析。
实施例1用二甲苯单加氧酶氧化甲苯及其衍生物在下面的试验中，所有的细胞都生长至细胞密度为0.09g CDW/l并用0.1％(V/V)正辛烷进行常规诱导。然后，将培养物培养另外3-3.5小时并生长至细胞密度为0.23-0.27g CDW/l。
表II显示了XMO将甲苯氧化为苯甲醇、苯甲醇氧化成苯甲醛以及苯甲醛氧化为苯甲酸。在最先的两个氧化反应中发现活性高达95-100U/g CDW，而苯甲醛仅以较低的活性10U/g CDW氧化。
用假枯烯获得相似的结果。假枯烯氧化成3，4-二甲基苯甲醇、3，4-二甲基苯甲醇氧化为3，4-二甲基本甲醛，3，4-二甲基苯甲醛氧化为3，4-二甲基苯甲酸。氧化假枯烯时发现活性为100U/g CDW，而以50U/gCDW的活性较缓慢地形成3，4-二甲基苯甲醛，并以比苯甲醛显著高的活性(55U/g CDW)氧化成3，4-二甲基苯甲酸。
当加入酸作为底物时，既没有检测出反应产物也没有检测出酸降低。
未诱导的大肠杆菌JM101，含有质粒pSPZ3和诱导的大肠杆菌JM101，不含任何起对照作用的质粒。为了排除alk调节体系对大肠杆菌的任何影响，将含有质粒pRS的大肠杆菌JM101用作附加对照。质粒pRS仍然含有alkS基因，但是不含xyl基因。表II证实当使用甲苯、假枯烯和相应的醇作为底物时在对照试验中没有检测出转化产物。
然而，下表III显示了在该试验中加入作为底物的醛以恒定活性还原成其醇。也鉴定出形成了3，4-二甲基苯甲酸，但是活性非常低，为2-2.5U/g CDW。这样得出结论通过诱导的大肠杆菌JM101(pSPZ3)(其缩写在本文中意思是微生物含有所述的质粒)形成的大多数酸可以归因于XMO的存在。
这里，应提到的是，在常规使用的诱导体0.1％(V/V)正辛烷和作为另一种选择的诱导体0.05％(V/V)DCPK之间，在形成的产物和活性、或形成速度方面没有发现显著差异。
表II通过XMO氧化甲苯和衍生物
a 如上所述进行活性测定试验。单位(U)如上面定义的，并且如上所述计算比活性。b 细胞通过加入0.1％(v/v)正辛烷进行诱导。c 参见下面(表III)表III在对照试验中转化醛
a、b参见表II在使用未诱导的大肠杆菌JM101(pSPZ3)和诱导过的大肠杆菌JM101(pRS)的这些对照试验中发现醛还原为醇，这可以解释为大肠杆菌醇脱氢酶催化其平衡由于热力学缘故而在醇这边的反应的作用。在通过大肠杆菌JM101(pSPZ3)生物转化甲苯结束时再形成苯甲醇(参见图5A)也可以归因于这些大肠杆菌脱氢酶，其活性因XMO活性在整个时间内降低而变得显著。
实施例2测定整个时间内各种底物的氧化过程甲苯、假枯烯、3，4-二甲基苯甲醇和3，4-二甲基苯甲醛在整个时间内的氧化过程示于图3和4。如上所述进行试验。在每种情况下将讨论的底物加入到各自静息细胞的含1％(w/v)葡萄糖的50mM磷酸钾缓冲液pH 7.4的悬液中。
当甲苯或假枯烯作为底物加入时，开始顺序形成相应的醇、醛和酸(图3A和4A)。同样开始活性试验，形成苯甲醇、3，4-二甲基苯甲醇和苯甲醛的活性高。形成3，4-二甲基苯甲醛和3，4-二甲基苯甲酸的活性适中，并且以低活性形成苯甲酸。在开始5分钟内，两个底物假枯烯和甲苯的产物以100U/g CDW的比活性形成(还参见表II)。在5分钟至10分钟之间的间隔中，以80U/g CDW的比活性形成苯甲醛，而形成3，4-二甲基苯甲醛更慢(37U/g CDW)。当甲苯或假枯烯完全消耗时开始形成酸，当为苯甲酸和3，4-二甲基苯甲酸时在10分钟至30分钟之间的间隔中其活性分别为3.2U/g和21U/g CDW。总是保持低苯甲醇浓度。40-80分钟之间，苯甲醇浓度再次升高，而苯甲醛浓度降低(图3A)。假枯烯、3，4-二甲基苯甲醇和3，4-二甲基苯甲醛完全消耗掉，同时形成3，4-二甲基苯甲酸(图4A)。
当加入3，4-二甲基苯甲醇作为底物时，在10-30分钟的整个时间内，形成3，4-二甲基苯甲醛的活性是50U/g CDW(表II)，而形成3，4-二甲基苯甲酸的活性是23U/g CDW(图4C)。当使用苯甲醇作为底物时，形成苯甲醛的活性是95U/g CDW并且形成苯甲酸的活性是常数2.9U/g CDW(结果未显示)。在该试验过程中，所有3，4-二甲基苯甲醇完全转变成其酸，这与苯甲醇正好相反。
当加入3，4-二甲基苯甲醛作为底物(图4E)时，3，4-二甲基苯甲酸以活性55U/g CDW形成并且在短至20分钟之后成为主要物质。当使用苯甲醛作为底物时，慢且恒定地形成苯甲酸(3U/g CDW)(结果未显示)。这里，开始5分钟内的最初活性为10U/g CDW(表II)。
实施例3通过大肠杆菌JM101(pRMAB)转化甲苯和假枯烯这些试验打算弄清楚由甲苯和假枯烯形成醛的活性是否因同时存在BADH和XMO而增加或降低。由于一些醇脱氢酶催化在生理pH下平衡偏向醇的反应，因此后面提及的可能性可能的确存在并且BADH因此降低了形成醛的速度。
事实上，与大肠杆菌JM101(pSPZ3)比较观察到生物转化活性的明显差异。甲苯以最初比活性87U/g CDW转化成其相应的氧化产物。苯甲醇、假枯烯和3，4-二甲基苯甲醇的相应活性为66、73和42U/gCDW。BADH的存在似乎还使作为生物催化剂的重组大肠杆菌MJ101的生物转化活性降低。
加入甲苯使得连续地形成苯甲醇、苯甲醛和苯甲酸(图3B)。在5-10分钟之间，苯甲醇以活性34U/g CDW形成，并且在10-40分钟之间其酸以1U/g CDW形成。约20分钟之后，苯甲醇浓度再次开始升高(可能由于逆反应开始了)。在80分钟之后几乎没有留下苯甲醛，并且仅形成很少量的苯甲酸。
当加入苯甲醇作为底物时，结果非常相似(未显示)。再次，在形成醇的过程中在约20分钟之后醛浓度降低。因此，加入xylB基因使得醛大量还原为醇，这暗示醛的形成不会因加入BADH而增加。
当加入假枯烯作为底物时，同样，连续形成3，4-二甲基苯甲醇、3，4-二甲基苯甲醛和3，4-二甲基苯甲酸(图4B)。在5-10分钟之间，3，4-二甲基苯甲醛形成的活性是15U/g CDW。在30-40分钟之间，约以相同活性形成酸(13U/g CDW)。快速形成醇之后，醛浓度相对高地保持20分钟。然而，在反应结束时所有醇和醛都转化成酸。
当加入3，4-二甲基苯甲醇作为底物时，形成3，4-二甲基苯甲醛和3，4-二甲基苯甲酸(图5B)。在20-30分钟之间，酸以比活性8U/g CDW形成。醛浓度从未超过过醇浓度。3，4-二甲基苯甲醇存在的时间更长说明，除了氧化之外，醛再次还原为醇，其原因似乎归因于BADH。
实施例4大肠杆菌JM101(pSPZ3)的生长和诱导动力学对每个活性点使单个培养物生长。如上所述进行活性测定。在图5A中，将假枯烯(1.37mM)加入到静息大肠杆菌JM101(pSPZ3)(2.04-2.26gl-1CDW)于含1％(w/v)葡萄糖的50mM磷酸钾缓冲液pH 7.4的悬液中。比活性是借助转化开始5分钟内形成的量计算的，它是通过气相色谱法测定的。箭头代表加入0.1％(V/V)正辛烷以诱导xylMA合成时的点。实心圆代表未诱导的培养物的细胞干重(CDW)，而空心圆代表诱导的培养物的细胞干重，叉代表诱导过的培养物的比活性。
图5(B)和(C)是如图5(A)所述获得的，只是细胞密度为2.26-2.44gl-1CDW。图5(B)显示了不同量的正辛烷的影响，并且图5(C)是DCPK的影响。圆圈代表诱导3.5小时之后的细胞干重，并且叉代表诱导过的培养物的比活性。
在用0.1％(V/V)正辛烷(图5(A))或0.05％(V/V)DCPK诱导之后监控XMO活性。在正辛烷和DCPK的情况下，XMO活性被这两种化合物快速诱导并在3-3.5小时之后分别达到恒定值约115和105U/g CDW。诱导过的细胞的生长速度明显低于未诱导的细胞的速度。
通过将大肠杆菌JM101(pSPZ3)生长至最高浓度0.09g CDW/L并用不同量的正辛烷和DCPK诱导细胞来测定XMO活性对诱导体浓度[范围0.00001-1％(V/V)]的依赖性。进一步培养3.5小时之后，针对每个诱导体浓度测定细胞干重和XMO活性(图5(B)和(C))。当将低于0.0001％(V/V)的正辛烷或0.001％(V/V)的DCPK加入培养基时，所得XMO活性非常低。发现诱导最大值时DCPK浓度为0.005-0.01％(V/V)，正辛烷浓度为0.001-0.004％(V/V)。XMO活性在较高诱导体浓度下保持恒定。由于正辛烷的高蒸汽压，使用密封的摇动瓶，但是即使这样也仅有一部分正辛烷溶于含水培养基中。正辛烷在蒸馏水中的溶解度非常低，其量为0.7mg/l或0.0001％(V/V)。
在酶活性增加至其最大值的诱导体浓度范围内细胞密度降低。酶活性在较高正辛烷浓度下保持恒定。相反，较高DCPK浓度使得细胞密度进一步降低(图5(B)和(C))。此外，测定没有质粒的情况下不同诱导体浓度对大肠杆菌JM101的生长的直接影响。高正辛烷浓度对细胞生长没有影响。相反，DCPK浓度高于0.01％(V/V)使得生长速度降低。在0.5％(V/V)的DCPK浓度下，诱导3.5小时之后测定细胞干重仅为0.073g/l。显而易见，高DCPK浓度对细胞有毒。因此，正辛烷是较好的诱导体。
总结如下。在逐步氧化甲苯和假枯烯时存在两个明显的差异。3，4-二甲基苯甲醇比苯甲醇氧化更慢，并且3，4-二甲基苯甲酸形成时的活性明显比苯甲酸的高。这说明取代基不同对氧化底物(醇、醛)的XMO比活性与未氧化的底物如甲苯和假枯烯的比活性的影响不同，对这些底物XMO显示了非常相似的活性。另一重要结果是只要或多或少所有的甲苯或假枯烯消耗掉就不形成酸。如果这是常规事实的话，XMO显然对甲苯和假枯烯比对相应的醛具有更高的亲和力。BADH的存在使得产物形成的活性降低，并且甚至是在再次形成苯甲醇中。含有BADH的细胞显然更慢地聚集醛。BADH似乎大大增加了大肠杆菌脱氢酶的影响，并且似乎该脱氢酶反应的平衡偏向醇一侧。这通过现有技术中已知的方法(26-29)以及对酶动力学的研究(16-18)经热动力学计算得以证实。
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权利要求
1.一种制备通式I的芳香醛和/或羧酸的方法，Ar-(CH2)n-R1(I)其中Ar是任选地单取代或多取代的单核芳香环，R1是含氧基团-CHO或-COOH，和n是0-15的整数，所述方法包括a)在含有通式II的芳香底物的培养基中培养表达选自以下酶的微生物二甲苯单加氧酶(XMO)和链烷单加氧酶(AMO)，Ar-R2(II)其中Ar定义如上，并且R2是-CH＝CH2或-(CH2)n+1R3，其中n定义如上，并且R3是H或OH；或者，如果R1是-COOH时，R2也可以是-(CH2)nR4，其中n定义如上，并且R4是-CHO，和b)将通式I的化合物与培养基分离。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述表达XMO的微生物基本上没有苯甲醇脱氢酶(BADH)和/或苯甲醛脱氢酶(BZDH)活性。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述表达AMO的微生物基本上没有链烷醇脱氢酶和/或链烷醛脱氢酶(AADH)活性。
4.如前面权利要求任意一项所述的方法，其中使用用表达载体转化过的重组微生物，所述表达载体含有编码XMO的基因xylM和xylA或者编码AMO的基因alkB、alkG和alkT，它们可操纵地和在遗传控制食油假单胞菌GPol的alk调节体系下相连。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述微生物已用表达质粒pSPZ3转化。
6.如前面权利要求任意一项所述的方法，其中所述微生物是大肠杆菌属的细菌。
7.如权利要求4-6任意一项所述的方法，其中所述酶表达是通过向培养基中加入诱导体开始的。
8.如前面权利要求任意一项所述的方法，其中将R2是-CH＝CH2、-CH3或-CH2OH的通式II的化合物用表达XMO活性的微生物转化。
9.如权利要求1-7任意一项所述的方法，其中将R2是-(CH2)m-R3，R3定义如上且m是6-13的整数的通式II的化合物用表达AMO活性的微生物转化。
10.如权利要求4所述的方法，其中表达恶臭假单胞菌mt-2的二甲苯单加氧酶。
11.具有表达载体的重组微生物，所述表达载体含有编码XMO的基因xylM和xylA或者编码AMO的基因alkB、alkG和alkT，它们可操纵地和在遗传控制食油假单胞菌GPol的alk调节体系下相连。
12.如权利要求11所述的微生物，选自大肠杆菌属和假单胞菌属的细菌。
13.如权利要求11或12所述的微生物，已用质粒pSPZ3转化。
14.一种表达构建体，含有编码XMO的基因xylM和xylA或者编码AMO的基因alkB、alkG和alkT，它们可操纵地和在遗传控制食油假单胞菌GPol的alk调节体系下相连。
15.如权利要求11-13所述的微生物或者权利要求14所述的表达构建体用于微生物生产通式I的芳香化合物的用途。
全文摘要
本发明涉及一种使用表达二甲苯单加氧酶或链烷单加氧酶的基因工程重组微生物逐步氧化芳香化合物得到相应的醛和/或羧酸衍生物的方法。
文档编号C12R1/38GK1415018SQ00817866
公开日2003年4月30日 申请日期2000年10月26日 优先权日1999年10月27日
发明者A·施密德, B·维托尔特, B·豪尔, B·比勒 申请人:Basf公司