专利名称：通过rna编辑在水稻和其他作物上制备细胞质雄性不育系的方法
技术领域：
本发明涉及细胞质雄性不育(CMS)转基因植物，以及利用RNA编辑作为分子工具制备这种植物的方法。本发明特别涉及利用RNA编辑培育水稻杂交种(CMS)。
背景技术：
CMS是在植物线粒体中通过母体遗传的性状，它能在减数分裂之后，在小孢子发生期间导致花粉粒败育，对CMS的高度兴趣是因为它在杂交种子生产方面在经济上的重要性。通过异花授粉产生的植物保持雄性不育，除非花粉亲本的核基因组具有核雄性可育恢复(MFR)等位基因(1)。生产含有重组线粒体基因组的品系的能力在研究CMS方面具有极高的价值。另一种有价值的遗传资源是被称为Rf的显性核基因，该基因能恢复CMS性状。通过比较被恢复的育性和具有不育性细胞质的不育植物，获得了某些重要信息。在某些场合下，通过由mtDNA序列之间的重组事件所产生的嵌合基因的存在，可以在遗传学水平上将上述现象关联起来(2，3)，并可以根据ATP产量的显著降低从生物化学角度加以验证。
第二次绿色革命取决于将分子生物学应用到作物，特别是水稻上的重大进步。现代分子生物学已经发展了一系列技术，这些技术可以分析作物基因组，并且以适合高产，提高抗病性和提高对极端环境的耐受性的方式对其加以改变。水稻是第二大一年生谷类作物，并且与小麦不同，它是在小块土地上种植，并且以手工方式管理和收获。栽培的水稻是一种一年生作物，在长叶子上长有由小穗组成的花序(圆锥花序)，由花产生种子或谷粒。水稻包括大约25个种，大约在公元前3000年在印度被驯化，随后传入中国、印度支那、印度尼西亚和日本列岛。中国和印度的水稻产量占全球产量的将近60％，大约有2亿吨。水稻产量取决于地理位置、天气条件和栽培方法。水稻构成了世界上农药消费的最大单一市场，每年将近要花费30亿美元，因此，为生物技术提供了大的机遇。在印度，在1930-1980年之间，水稻产量提高了一倍以上。目前，在3亿5千万英亩的栽培面积上的产量为4亿2千万吨。产量的提高是因为使用了改良的品种和农艺措施。
杂交水稻的栽培，间接促进了细胞质的均匀性。在培育新的杂交种时，在培育细胞质雄性不育(CMS)系方面要花费大量时间。需要5-6代回交才能将具有需要的核背景的品系转化成可用于杂交种子生产的雄性不育系。对使用分子工具鉴定并设计一种比较快的方法来制备新的细胞质资源的需要是迫切的。
RNA编辑是一种转录后加工，能在植物线粒体中导致RNA中的C改变成U。RNA编辑将改变RNA分子的核苷酸序列，使它不同于编辑它的DNA模板的序列，从而违背了分子生物学的中心法则(4，5)。这种转录后加工会导致RNA上C向U的转变，并且更少见的是发生T向C的转变(6，7)。对密码子中的关键核苷酸进行编辑，导致氨基酸的改变，在大多数情况下，并且在产生以前不存在的起始密码子和终止密码子时，最终组装成一种有功能的基因。在RNA编辑之后，相应的蛋白序列与未编辑过的基因组推测蛋白的序列不同。对蛋白的修饰涉及到呼吸链的复合体，业已证实这种复合体通常决定着雄性不育表型，因为它们能影响线粒体呼吸链复合体I的功能。编辑事件有时候是物种专一性的(8)，并且在某些场合下是沉默的，在月见草属和小麦、玉米或豌豆中的保守区上部分或完全相同(9)。业已在小麦和月见草属上产生剪接位点时观察到了编辑(10，11)。
微管植物线粒体(mt)基因组的特征是具有多种不同的特征。这些基因组比非植物线粒体的基因组大，并且它们的物理结构由于决定活性DNA重新排列的重复而不一致。对拟南芥线粒体基因组进行的全面测序(Unseld，1997#2562)证实，尽管大部分高等植物线粒体DNA是不编码的，但是在其基因组中仍然存在50个以上的开放读框(orf)，包括存在于动物mt基因组中的正常的基因组，还包括核糖体蛋白基因，类似于细菌基因的与细胞色素c生物发生相关的新的基因(Gonzalesz，1993#1874；Schuster，1994#2194；Bonnard，1995#2331；Gruska，1995#2340)以及诸如orfB和orf25的具有未知功能的基因。业已在多种不同的物种上报导了叶绿体DNA插入片段的存在，用若干种有功能的tRNA基因补充线粒体(Marechel，1987#810)。以上插入片段，以及内含子和经常重复的序列的存在导致了高等植物线粒体基因组具有大的体积。
该基因组的独特性还表现在其表达所需要的机制方面，该机制包括顺式和反式剪接，以及RNA编辑。在大多数场合下，RNA编辑会导致氨基酸改变，包括产生以前不存在的起始和终止密码子。几乎所有蛋白编码基因的所有转录物都是编辑过的，最常见的结果是导致物种之间蛋白序列的相似性。同样在高等植物叶绿体结构RNA，如内含子上发现了类似的从C→U的mRNA编辑活性(Maier，1996#2560)，还在若干物种的线粒体中发现了tRNA的编辑(Wissinger，1992#1608；Marechal-Drouard，1993#1991)。最初是在cox2基因上检测到高等植物线粒体内含子的(Fox，1981#367)，它们属于II型内含子，其特征表现在它的结构(Michel，1983#1764Michel，1989#820)以及除掉它所采用的机制方面(Cech，1990#17645)。在植物线粒体中，某些II型内含子业已通过重组而分离，使外显子分布在不同的基因组位点上。因此，分离的转录物需要通过反式剪接连接在一起。这种现象最初是在核基因上报导的(Borst，1986#1778)，同样是叶绿体rps12(Koller，1987#255)和psaA(Goldschmidt-Clermont，1991#1394)基因表达所需要的。
NADH-泛醌氧化还原酶(复合物I)包括25个以上的蛋白亚基，它是最大的呼吸复合体，并且位于线粒体内膜上(Herz，1994#2080)。这种酶能催化NADH的氧化，并将电子转移到泛醌。迄今为止，业已在高等植物线粒体中鉴定了所述基因，这些基因是9个线粒体编码的亚基。
nad1、nad2、nad3、nad4、nad4L、nad5和nad6基因(Schuster，1994#2195)在哺乳动物线粒体中具有对应体，与此不同的是，nad7(Bonen，1994#2123)和nad9(Lattina，1993#1491)是由哺乳动物核基因组编码的(Walker，1992#1834)。nad基因的表达很好地说明了可能出现在高等植物线粒体基因组中的各种复合体。nad3、nad4L、nad6和nad9是连续的基因，而nad4(Lattina，1991#1080)和nad7(Bonen，1994#2123)由若干顺式剪接内含子间隔开。在各种植物物种中，nad1(Wissinger，1991#1124；Chapdelaine，1991#1097)、nad2(Binder，1992#1416)和nad5的基因(Knoop，1993#1250；Pereira de Souza，1991#1128)是顺式剪接和反式剪接的，由此表现出最复杂的表达形式。
业已研究了小麦nad2的结构和表达，编码NADH泛醌还原酶亚基2的线粒体基因的表达，揭示了微管植物线粒体基因组的某些特征，顺式、反式剪接和mRNA编辑是该基因正确表达所必须的。在小麦线粒体中，编码NADH泛醌氧化还原酶亚基2的基因(nad2)分成5个外显子，位于两个不同的基因组区。该基因的头2个外显子a和b是从同一条DNA链上的外显子c、d和e下游22kb处转录的。nad2的所有内含子都是II型的。推测外显子b和c的反式剪接会使两个独立转录的编码序列结合在一起。发生在结构域IV环中的DNA重排似乎决定着该基因组构，因为所述反式剪接事件涉及到在被中断的结构域IV的茎上的2个前体RNA的碱基配对。编码tRNATyr的基因位于外显子c的上游，并有可能与外显子c-e共同转录。除了剪接加工之外，nad2的正确表达同样需要mRNA编辑。成熟的mRNA在随机分布在其5个外显子上的36个位置上进行编辑，导致了28种密码子修饰。编辑能提高蛋白的疏水性和保守性。
太窄的细胞质基础，会导致作物容易发生病虫害的大爆发，并对环境产生负面影响。大多数现有的杂交种都具有非常窄的细胞质基础，如“WA”细胞质，使得有关作物容易受到病虫害的侵害，并且对环境造成负面影响。
因此，本发明的主要目的是鉴定并开发能产生CMS的细胞质的新资源。
本发明的另一个目的是优化通过遗传工程超量表达未编辑过的形式的应用，以便产生CMS，和用于恢复其核育性的它的反义形式。
本发明的目的还在于将RNA编辑在精确转录加工中的根本重要性与更常用的方法结合在一起，以便在作物上，特别是在水稻上产生CMS系。
本发明的另一个目的是将RNA编辑在精确转录加工中的根本重要性与更常用的方法结合在一起，以便在作物上，特别是在水稻上产生CMS系。
本发明的再一个目的是将未编辑过的形式基因的表达与雄性不育性的出现联系在一起。雄性不育表型是由于能影响正常花粉发育和减少花粉粒形成的线粒体异常造成的。
为了实现上述目的，本发明涉及一种通过RNA编辑制备的细胞质雄性不育(CMS)转基因植物，用于表达未编辑过的nad9基因，使得该植物的线粒体不能产生ATP。
所述细胞质雄性不育性(CMS)转基因植物是从水稻(Oryza sativa)、小麦(Triticum aestivum)、玉米(Zea Mays)、大豆(Glycinemax)等中选择的。
所述细胞质雄性不育性(CMS)转基因植物是水稻。
本发明还提供了一种通过RNA编辑制备细胞质雄性不育性(CMS)转基因植物的方法，用于表达未编辑过的nad9基因，使得该植物的线粒体不能产生ATP。该方法包括以下步骤-通过PCR由拟南芥cDNA(At-mRBP1a)克隆线粒体导向肽，-用SacI和XbaI消化所述PCR产物的SacI和XbaI位点，以便将它克隆到pBSK载体上，获得被称为pNG1的结构，-通过消化所述PCR产物，将从线粒体中获得的未编辑过的nad9基因克隆到来自作物品种的pNG1上，-消化所述具有未编辑过的nad9基因的克隆产物，获得pNG3，-克隆具有未编辑过的nad9和受遍在蛋白启动子和NOS终止子控制的导向序列的作物，以便获得pNG11，-用pNG11和潮霉素基因(pLAU6hph结构)一起共同轰击，以便获得未编辑过的nad9植物。
发明详述本发明的目的是通过利用两种形式的同一个基因，改变线粒体内膜的四种质子泵多蛋白复合体中一种或多种的功能(NADH-还原酶，细胞色素c还原酶、以及细胞色素c氧化酶或ATP合成酶复合体)，导致细胞能量水平的下降。一种形式的基因是天然存在的、功能性编辑过的转录物，而另一种是未编辑过的转录物，导致产生不同的RNA和推测的蛋白，并因此妨碍亚基排列，并使该复合体丧失功能。
复合体I(NADH泛醌氧化还原酶)的亚基(nad9)是呼吸链的第一种复合体，它会导致泛醌-线粒体内膜上电子转运物的减少。复合体I在电子流上占据着战略地位，并且业已证实，能干扰其组装的突变会诱导雄性不育。该亚基(nad9)相当于哺乳动物复合体I的30kDa的蛋白。在复合体I中，nad9位于铁硫亚级份中，朝向线粒体基质。其推测的氨基酸组成表明，它是一种亲水性蛋白。nad9可能是用于本发明目的的最佳候选者，因为它是一种小的转录物，在小麦中在14个位置上进行编辑，导致11种氨基酸修饰，在所有情况下都会产生更保守的蛋白。
具体地讲，以上方法包括步骤1克隆线粒体导向序列(
图1)线粒体导向序列是通过PCR由拟南芥cDNA(At-mRBP1a)克隆的，寡聚物正向引物aagagcTccc ATG GTC TTC TGT AAC AAA CTC G反向引物Aa tct Aga CTT GGT AGA CAT CAA CCG G所述正向引物具有SacI位点，而所述反向引物具有XbaI位点，以便克隆到pBS(SK)上。
用于克隆线粒体导向序列的PCR条件为50纳克具有At-mRBP1a cDNA的载体10微升10倍Pfu克隆缓冲液2微升10mM dNTP’s1微升正向寡聚物(50皮摩尔)1微升反向寡聚物(50皮摩尔)1微升pfu聚合酶加水到最终体积为100微升92℃3分钟92℃45秒40℃1分钟(5轮)72℃1分钟92℃45秒47℃1分钟(30轮)72℃1分钟72℃10分钟用SacI和XbaI消化PCR产物，并克隆到pBS(SK)上。该结构被称为pNG1。
步骤2
克隆水稻编辑过的nad9编辑过的nad9是通过RT-PCR从水稻总RNA中获得的。在黑暗中，在250c下，在潮湿的蛭石上使印度水稻(IR64)种子发芽，并使它生长3周时间，将3周龄的幼苗用于提取总RNA，并且用于分离线粒体。提取总RNA·在液氮中研磨3毫克组织，转移到falcon试管中。
·添加9毫升提取缓冲液，涡旋搅拌·添加0.6毫升pH4.8的3M乙酸钠，3.0毫升水饱和的苯酚和1.8毫升氯仿∶异戊醇(24∶1)，涡旋搅拌·在冰上培养15分钟·在JA25.50转子上，以15000rpm的速度离心30分钟·用苯酚∶氯仿提取，直到两相之间的界面透明·向水相中添加等体积的异丙醇·在-20℃下保存1小时·以15000rpm的速度离心30分钟·用70％的乙醇洗涤·使沉淀干燥·溶解在水中提取缓冲液4M硫氰酸胍25mM柠檬酸钠，pH7.00.5％sarcosyl0.1mM/3-巯基乙醇3M乙酸钠，pH4.8水平衡的苯酚氯仿∶异戊醇(24∶1)异丙醇和70％的乙醇RT-PCR逆转录如果RNA溶解在乙醇中，添加1/10体积的3M乙酸钠，在-20℃下使RNA沉淀1小时，以12000rpm的速度离心30分钟，用70％的乙醇洗涤沉淀，溶解在milli Q水中。
另外添加500纳克随机的六聚体，在65℃下培养5分钟，并放置在冰上，另外添加以下成分-10微升5倍RT缓冲液-5微升DTT(0.1M)-10微升dNTP’s(2mM)-1微升逆转录酶M-MLV(＝200个单位)然后在37℃下再培养2小时添加5微升ATP 10mM1微升T4多核苷酸激酶(10个单位)在37℃下培养15分钟添加2微升T4 DNA连接酶(2个单位)在37℃下培养45分钟寡聚物正向aa Tct aga ATG GAT AAC CAA TTC ATT TTC CAA反向aag gAt cCG GAA TTA TCC GTC GCT ACG正向引物具有XbaI位点，而反向引物具有BamHI位点，以便克隆与线粒体导向序列相邻的、编辑过的nad9基因。按照标准条件实施PCR。用Xba和BamHI消化PCR产物，并且克隆到pNG1上，并称之为pNG2。用Xba和BamHI消化pNG2上的编辑过的nad9基因，并将其克隆到遍在蛋白启动子上，称之为pNG10，如图2所示。
步骤3克隆水稻未编辑过的nad9用标准方法分离线粒体提取缓冲液0.4M蔗糖50.0mM Tris-HCl，pH7.53.0mM EDTA
0.1％BSA4.0mM b-/3-巯基乙醇2mM DTT洗涤缓冲液——不含BSA和DTT的提取缓冲液2倍梯度缓冲液0.5M蔗糖100mM Tris-HCl，pH7.56.0mM EDTA用2倍梯度缓冲液制备的Percoll梯度裂解线粒体以便获得线粒体DNA将大约75微克水稻线粒体重新悬浮在再悬浮缓冲液中。为了重新悬浮线粒体，添加1/4体积的裂解缓冲液。倒转试管，并马上添加苯酚，然后再添加氯仿。然后进行3次苯酚氯仿提取，接着进行氯仿提取。向水相中添加2.5倍体积的乙醇和1/10倍体积的3.0M乙酸钠。在-20℃下保存30分钟，以13000rpm的速度离心20分钟，用70％的乙醇洗涤，干燥，并溶解在水中。
寡聚物正向aa Tct aga ATG GAT AAC CAA TCC ATT TTC CAA反向aag gAt cCG GGA TTA TCC GTC GCT ACG正向引物具有XbaI位点，而反向引物具有BamHI位点，以便克隆与线粒体导向序列相邻的未编辑过的的nad9基因。
PCR取1微升1∶10稀释的线粒体DNA进行PCR10微升10倍Pfu克隆缓冲液2微升10mM dNTP’s1微升正向寡聚物(50皮摩尔)1微升反向寡聚物(50皮摩尔)1微升pfu聚合酶加水到最终体积为100微升
92℃3分钟92℃45秒42℃1分钟(5轮)72℃1分钟92℃45秒49℃1分钟(30轮)72℃1分钟72℃10分钟用XbalI和BamHI消化PCR产物，并克隆到pNG1上，称之为pNG3。
用XbalI和BamHI将未编辑过的nad9基因从pNG3上消化下来，并克隆到遍在蛋白启动子上，称之为pNG11，如图3所示。
步骤4将编辑过的nad9(pNG10)和未编辑过的nad9(pNG11)用于biolistic转化。转化方法是共同轰击，因此，用于biolistic转化的结构，在一种质粒上具有感兴趣的基因(具有遍在蛋白启动子和Nos终止子的pAHC27，以及pLAU6(来自ILTAB，它具有CvMV启动子和NOS终止子))，而选择标记在另一种质粒上。
实施例收集植物材料Basmathi370和swarna的种子是由水稻研究董事会(DRR，Hyderabad，印度)提供的。
培养基MS培养基(Murashige&skoog，1962)含有MS盐(MS-主要成分，MS微量成分)，FeEDTA，0.5毫克/升Pyrodoxine，1.0毫克/升硫胺素，0.5毫克/升烟酸镍，30克/升蔗糖，2.6克/升植物凝胶。
MSO培养基是补充了30克/升甘露糖醇和30克/升山梨醇的MS培养基。
用于第一次选择的RC培养基补充了30毫克/升潮霉素。
用于第二次选择的CC培养基含有50毫克/升潮霉素，300毫克/升酪蛋白水解物，500毫克/升脯氨酸。
预再生培养基含有30克/升麦芽糖，50毫克/升潮霉素，2毫克/升细胞分裂素，1毫克/升萘乙酸，5毫克/升脱落酸。
再生培养基含有30克/升麦芽糖，50毫克/升潮霉素，2.5毫克/升细胞分裂素，0.1毫克/升萘乙酸。
用于长根的1/2MS培养基含有1/2MS盐，1/2维生素B5，10毫克/升蔗糖。
愈伤组织诱导和可再生愈伤组织的选择在70％的乙醇中对去壳的成熟种子进行表面消毒2分钟，然后用50％的商用漂白剂漂白30分钟。然后用无菌水漂洗所述种子。然后，将所述种子放在含有MS培养基的培养皿上，并在25℃下遮光培养14天。去掉由小盾片区诱导的原始愈伤组织，并且在新的MS培养基上，在相同条件下继代培养一周时间。在继代培养之后，在每一个紧凑的原始愈伤组织上部，出现很多疏松结合的小的球形愈伤组织。轻轻取下这些愈伤组织，并且放到新的MS培养基上。将直径为1-3毫米的愈伤组织用于转化。
制备用于轰击的继代培养的愈伤组织将大约60个直径为2-3毫米的胚胎发生愈伤组织放在装有渗透培养基的培养皿中央。在该培养基上培养4小时之后，马上用粒子加速器PDS-1000/He对这些愈伤组织进行微粒轰击。
微粒轰击介导的转化所用的biolistic枪是PDS-1000/He枪(Bio-Rad实验室，美国)。所使用的金颗粒的大小为1.5-3.0μ。破裂碟片压力为1100psi，而氦气压力必须为1200psi。在所述枪膛中形成25mg/Hg的真空度。所使用的DNA浓度为5微克/微升。
制备金悬浮液称出6毫克金颗粒，向其中加入100微升100％的乙醇，然后涡旋搅拌1分钟。以10000rpm的速度离心10秒。用移液管将上清液吸出，并向沉淀中加入100微升无菌蒸馏水。进行涡旋搅拌并离心，并重复相同的过程。将50微升最终的金悬浮液用于轰击。
粒子包衣方法向50微升金悬浮液中添加5微克DNA，并充分混合。添加20微升0.1M亚精胺(Sigma，Aldrich)，并在涡旋搅拌器上低速混合。添加50微升2.5M氯化钙，并充分混合。将该混合物在室温下放置10分钟。以10000rpm的速度离心10秒，并用移液管将上清液移出，将50微升100％的乙醇添加到沉淀中。将10微升样品用于对大型载体进行包衣，使膜干燥，然后用于转化。在转化之后，将愈伤组织保持在相同的培养皿上，并遮光培养16小时。
轰击过的细胞的生长和选择在16小时之后，将所述愈伤组织转移到RC30培养基上进行选择，并且在25℃下遮光培养21天。将抗性愈伤组织转移到CC50培养基上，并遮光培养18天。只将抗性愈伤组织转移到预再生培养基上培养1周。将增殖的愈伤组织保持在再生培养基上，在25℃下，用16小时光照和8小时黑暗的光周期进行培养。在再生出幼苗之后，将其转移到装有1/2 MS培养基的试管中。
可以用多种方法分析转化体1.用合适的探针(cDNA克隆，寡核苷酸)通过Southern杂交检测转基因的存在。通过Northern印迹分析所述基因向RNA的表达，然后通过RT-PCR获得mRNA的序列。
2.用单一专一性的抗nad9的抗血清检测所述蛋白的输出。
3.通过免疫亲合的新技术评估所述蛋白在复合体I中的整合，并且估计由推测的错误组装所导致的损害。
4.用甲苯胺兰通过超结构分析对花粉进行组织学分析。
5对分蘖、种子数量、植物长度进行基础育种研究，以便评估产量。
6.在编辑过的和未编辑过的nad9转化过的水稻植物之间进行杂交，以便评估育性恢复情况。
7.根据花粉在特定培养基上萌发的能力评估花粉的生活力。
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权利要求
1.一种通过RNA编辑制备的细胞质雄性不育(CMS)转基因植物，用于表达未编辑过的nad9基因，使得该植物的线粒体不能产生ATP。
2.如权利要求1的细胞质雄性不育性(CMS)转基因植物，其中，所述植物是从水稻、小麦、玉米、大豆等中选择的。
3.如权利要求1的细胞质雄性不育性(CMS)转基因植物，其中，所述植物是水稻。
4.一种通过RNA编辑制备细胞质雄性不育性(CMS)转基因植物的方法，用于表达未编辑过的nad9基因，使得该植物的线粒体不能产生ATP，该方法包括以下步骤-将来自拟南芥cDNA(At-mRBP1a)的线粒体导向肽克隆到pBSK载体上，以便获得被称为pNG1的结构，-通过消化所述从线粒体DNA中获得的PCR产物，克隆未编辑过的nad9基因，以便获得pNG3，-用具有未编辑过的nad9基因和受遍在蛋白启动子和NOS终止子控制的导向序列克隆作物，以便获得pNG11，-按照本文所披露的方法，用pNG11和潮霉素基因(pLAU6hph结构)一起共同轰击，以便产生含未编辑过的nad9基因的植物，-用具有编辑过的nad9基因pNG10的对照植物分析未编辑过的nad9(pNG11)结构，以便确定nad9基因的存在。
5.如权利要求4的方法，包括以下步骤-将来自拟南芥cDNA(At-mRBPla)的线粒体导向肽克隆到pBSK载体上，以便获得被称为pNG1的结构，-通过消化所述从线粒体DNA中获得的PCR产物，克隆未编辑过的nad9基因，以便获得pNG3，-用具有未编辑过的nad9基因和受遍在蛋白启动子和NOS终止子控制的导向序列克隆水稻，以便获得pNG11，-按照本文所披露的方法，用pNG11和潮霉素基因(pLAU6hph结构)一起共同轰击，以便产生含未编辑过的nad9基因的水稻植物，-用具有编辑过的nad9基因pNG10的对照水稻分析未编辑过的nad9(pNG11)结构，以便确定nad9基因的存在。
全文摘要
本发明涉及通过RNA编辑制备的细胞质雄性不育(CMS)转基因植物，以便表达未编辑过的nad9基因，使得植物的线粒体中不能生产ATP，并且涉及一种制备所述植物的方法。该方法包括通过消化由线粒体DNA获得的PCR产物克隆未编辑过的nad9基因，以便获得具有未编辑过的nad9基因的pNG3克隆作物，使导向序列受遍在蛋白启动子和NOS终止子的控制，以便获得pNG11共轰击pNG11结构，采用本文所披露的具有潮霉素基因的形式(pLAU6hph结构)，以便产生含有未编辑过的nad9基因的植物；分析未编辑过的nad9(pNG11)结构和具有编辑过的nad9基因的植物pNG10，以便确定nad9基因的存在。
文档编号C12N15/09GK1429272SQ01808547
公开日2003年7月9日 申请日期2001年2月26日 优先权日2000年2月25日
发明者维尔卢·摩拉瓦拉·帕特尔, N·拉亚普拉姆, M·文卡塔拉米亚, J·乔伊, S·K·戈斯瓦米 申请人:琼－米歇尔·格林伦伯格, 阿维斯塔金格兰技术有限公司