专利名称：：通过农杆菌属和biolistic转化制备遗传修饰过的珍珠稗的方法
技术领域：
：本发明涉及biolistic转化和再生珍珠稗的方法，特别是转化珍珠稗品种843B的方法，它能产生抗逆性。背景有多种环境胁迫(冷害、臭氧、强光、干旱等)都能损伤作物，导致很大的产量损失。在所有这些不相关的逆境条件下的、被称为氧化胁迫的共同事件是增加了活化氧(AOS)的产生，这种对活细胞有很高毒性的活化氧，是作为很多生物学反应的副产品产生的。业已证实，活性氧与对植物细胞的损伤有关，这种损伤是由诸如空气污染、高温、低含水量的环境胁迫所导致的。在胁迫条件下，氧自由基的产生量很大，这种高活性的氧自由基(O*)与以下对植物的损伤有关-脂类降解-蛋白变性-核酸分解。叶绿体是植物组织中毒性氧衍生物的潜在的主要来源。它能在高剂量光照和任何其他胁迫条件下产生单线态氧。活性氧的积累是光合作用的无法避免的后果，即使是在最有利的条件下也是如此。为了应付它的毒性，植物业已形成了一种高效的抗氧化剂防御系统，该系统包括酶促和非酶促成分。在植物中，有多种与自由基清除相关的酶，通常都是由多种氧化刺激诱导的。不过，在长时间的胁迫条件下，会不可避免地造成损伤，因为脱毒系统已经饱和。主要起作用的是超氧化物歧化酶(SOD)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)和过氧化氢酶。通过提高所述蛋白在转基因植物中的水平，有可能改善对氧化胁迫的抗性。叶绿体是NOS产生的主要部位之一，为了有效清除叶绿体中的NOS，需要增强保护和导向叶绿体的MnSOD。在真核生物中，MnSOD是一种核编码的蛋白。它能清除线粒体基质中的超氧化物自由基。超氧化物自由基是在细胞所有区室中的很多生物学氧化中普遍产生的。超氧化物自由基产量的增加与植物的多种生理学失调相关。通过将MnSOD酶导向叶绿体(在胁迫条件下，这里的超氧化物自由基的产生量较大)，可以提高清除可能产生的任何自由基的能力。业已将Rubisco小亚基的叶绿体转运肽(ssTP)成功地用于单子叶植物和双子叶植物上，用来对不同转基因非质体蛋白进行导向(Cashmoreetal，1983)。业已证实在胁迫条件下，可以明显诱导MnSOD。另外业已证实，超氧化物自由基能在每一个亚细胞区室中诱导一种特殊的分子，该分子可以作为一种信号诱导编码与该区室相关的特定超氧化物歧化酶的细胞核基因(BowlerCetal，1989)。本发明的目的是提高所述蛋白在转基因植物中的水平，并且改善对氧化胁迫的抗性。为了实现上述目的，本发明提供了一种biolistic转化和再生珍珠稗(Pennisetumglaucum)的方法，包括(a)在含有5毫克/升2，4-D的MS培养基上启动由珍珠稗种子开始的胚胎愈伤组织形成；(b)在黑暗中培养所述愈伤组织一段预定的时间；(c)在含有3毫克/升2，4-D的MS培养基上继代培养所述愈伤组织；(d)在光照条件下培养所述继代培养的愈伤组织一段预定的时间；(e)利用biolistic装置用含有预先确定的基因的质粒DNA对所述胚胎愈伤组织进行biolistic轰击；(f)让所述增殖的愈伤组织生长，并分化成幼苗；(g)用已知方法分析所述预先确定的基因在再生的幼苗中的表达。所使用的珍珠稗品种是珍珠稗843B品种。所述预先确定的基因是选自GUS编码基因、潮霉素抗性基因或MnSOD基因的标记基因。在步骤(e)中用于转化基因的质粒选自pGV4结构。所述pIG121Hm质粒被用于提供GUS和潮霉素抗性基因，并且含有CaMV35S启动子。所述pGV4质粒被用于在步骤(e)中提供MnSOD基因，并且包括遍在蛋白启动子和NOS终止子。用于将在步骤(f)中获得的愈伤组织分化成芽的培养基，是含有0.3ppm苄基氨基嘌呤(BAP)的MS基础培养基。将所述愈伤组织在光照条件下保持30天时间，以便长芽。用于将在步骤(f)中获得的愈伤组织分化成根的培养基，是含有2-3ppm吲哚乙酸(IAA)或0.3％活性碳的MS基础培养基。所述方法还包括在无菌水中将所述植物驯化至少2天，并将它转移到无菌土壤中。所述无菌土壤含有比例为1∶1的土壤和沙子。在步骤(b)的遮光条件下，将所述愈伤组织培养30天。在步骤(d)的光照条件下，将所述愈伤组织培养30天。所述用于转化的biolistic枪是PDS-1000/He枪。所述biolistic枪使用选自金的高速微型载体。所述微型载体用DNA分子、亚精胺和氯化钙包衣。所述DNA分子的浓度为大约5微克/微升。所使用金的大小为1.5-3.0μ。破裂碟片压力为900psi，氦气压力为1100psi，并且在枪膛中产生25mg/Hg的真空度。在步骤(c)中以6厘米的距离对所述愈伤组织进行轰击，900psi的破裂碟片压力和1100psi的氦气压力表现出最佳结果。发明详述步骤1收集植物材料珍珠稗843B品种(又被称为ICMB-2品系)的种子是一种高度均匀的自交系。它是由堪萨斯州立大学FortHays实验站分部通过从BKM2068中选择而培育成的。它是雄性不育系843A的保持系。AICPMIP在1984年推荐将它用于大规模推广和生产商业化杂交种。843B是d2矮化型，成熟早(42天)，表现出良好的分蘖能力(4-5个圆锥花序)，具有小的半紧凑的圆锥花序和大的种子(ICRISAT，粟米研究组，Hyderabad)。用水漂洗所述种子，然后用70％的乙醇处理进行表面消毒。然后用蒸馏水充分洗涤，并用50％的商用漂白液消毒20分钟。发现使用0.1％氯化汞是没有用处的，因为种子由于过多接触这种化合物而不能形成愈伤组织。在片层空气流装置中，用无菌蒸馏水对所述种子进行6次彻底清洗。外殖体中的盾片组织能在体外增殖，并且具有再生和器官发生的最大潜力。步骤2由含有5毫克/升2，4-D的MS培养基(MS5)中的种子诱导胚胎发生愈伤组织。将所述愈伤组织培养物放置在BOD中，在25℃下遮光培养。每隔5天将所述愈伤组织转移到新的培养基上，以便减少由于高的酚类物质含量所导致的愈伤组织褐变。以30天的间隔，在含有浓度逐渐减低的2，4-D的培养基中，对所述愈伤组织进行继代培养。将MS3期的愈伤组织用于biolistic转化。将消毒种子放入MS5培养基中，每个培养皿放30粒种子。所述种子在2-3天内开始愈伤化。发现硬而紧凑的胚胎发生愈伤组织块被包围在缺乏组构的软的愈伤组织块内。在MS3平板上对胚胎发生愈伤组织进行继代培养，并在光照条件下培养30天。这一时期的愈伤组织最适合轰击。将增殖的愈伤组织转移到MS1上，以及随后转移到单纯的MS培养基上，以便进一步分化。在含有0.3％BAP的长芽培养基中的愈伤组织能很好地开始增殖，并分化形成绿色芽。将所述平板保持在光照条件下，将所述幼苗转移到含有活性碳的长根培养基上，直到形成细小的白色根系。将成熟的幼苗放在无菌水中培养2天时间使其变硬，然后再转移到装有1∶1的土壤和沙子混合物的花盆中。用于对珍珠稗的胚胎发生愈伤组织进行biolistic轰击的方法将两种质粒用于两个独立的实验中。1)pIG121Hm(16.2kb)，它含有受CaMV35S启动子和NOS终止子控制的GUS编码序列，以及能产生潮霉素抗性的Hph基因。2)pGV4(4.2kb)，它含有由UBI启动子和NOS终止子控制的MnSOD序列。遍在蛋白驱动启动子比较强，并且比其他单子叶启动子更有活力。它还有助于保持转基因在植物中的稳定性(9)。Biolistic装置和轰击所使用的biolistic枪是购自Biorad的PDS-1000/He枪。它是一种借助于诸如金或钨的高速微型载体，将外源DNA导入于愈伤组织或其他组织中的装置。在我们的实验中使用了金，因为它在植物系统中具有惰性和无活性的性质。将氦气用于加速所述微型载体，用DNA分子对载体进行了包衣。通过这种方法，可以将任何类型的组织用于转化，并且最大限度地降低假阳性结果。可以方便地进行瞬时测定。在将实验标准化期间，尝试了愈伤组织平板与阻挡屏之间的不同距离。还将3个不同时期MS5、MS3、MS1的愈伤组织用于轰击实验。所使用的金的大小为1.5-3.0μ。破裂碟片压力为900psi，而氦气压力必须为1100psi。在枪膛中产生25mg/Hg的真空度。所使用的DNA浓度为大约5微克/微升。金悬浮液称出6毫克金颗粒，向其中加入100微升100％的乙醇，并涡旋搅拌1分钟。以10000rpm的速度离心10秒，用移液管将上清液移出，并将100微升无菌蒸馏水加入沉淀中。涡旋搅拌并离心，重复相同的过程。将50微升最终的金悬浮液用于轰击。颗粒包衣方法将5微克DNA加入50微升金悬浮液中，并充分混合。向其中添加20微升0.1M亚精胺(SigmaAldrich)，并在涡旋搅拌器上低速混合。添加50微升2.5M氯化钙，并充分混合。将该混合物在室温下放置10分钟。以10000rpm的速度离心10秒，用移液管将上清液移出，将50微升100％的乙醇添加到沉淀中。轰击将具有结合的DNA的微型载体涂在大型载体碟片上。在乙醇蒸发之后，将所述大型载体放入其支架中。将破裂碟片和阻挡屏安装就位，并且保持其他必需的参数。在轰击之前4小时，将愈伤组织放入渗透液中。渗透液中含有30克/升的甘露糖醇或山梨醇。制备轰击材料的这一步骤，有助于增强轰击基因的瞬时表达。通过对靶细胞进行质壁分离，能促进细胞的瞬时表达和稳定转化(10)。质壁分离的细胞在由颗粒穿透细胞之后不太可能排出其原生质(10)。在轰击之后，将愈伤组织放置在渗透液中，在黑暗中培养16小时。将所述愈伤组织转移到含有30毫克/升潮霉素的MS3平板上(第一次选择)。为了进行瞬时GUS测定，将愈伤组织转移到GUS缓冲液中，在黑暗中培养24小时过夜。在15天之后将第一选择培养基中的愈伤组织转移到第二选择培养基中(MS3，含有50毫克/升潮霉素)。每隔2周进行继代培养，直到在平板中出现愈伤组织的抗性集落。GUS测定在0.2M磷酸缓冲液，Triton-X100％、氯霉素(100毫克/毫升)、叠氮化钠(100毫克/毫升)、milliQ水中，用x-Gluc作底物测定GUS活性。在37℃下培养所述愈伤组织24小时(Jefferson’s方法)。PCR分析为了进行PCR，用K.Edwards，Johnstone和Thompson的方法提取DNA(8)。将愈伤组织收集在无菌eppendorf试管中，并在室温下，在不使用提取缓冲液的情况下浸解15分钟。添加400微升提取缓冲液(200mMTris-HCl，250mM氯化钠，25mMEDTA，0.5％SDS，pH7.5)，并涡旋搅拌5秒钟。以13000rpm的速度将提取物离心1分钟。取出300微升上清液放入一个新的试管中，并添加300微升异丙醇。在室温下放置2分钟。以13000rpm的速度离心，并将沉淀真空干燥5分钟。将适量的TE加入干燥的沉淀中，并在4℃下保存DNA。在第一选择培养基中选择30天之后，取出愈伤组织进行第一次筛选。用上述方法从愈伤组织中提取DNA，发现DNA的浓度大约为50纳克/微升。用GUS片段作正对照。在另一个实验中，用MnSOD片段作正对照。用来自未转化过的843B的愈伤组织的DNA作负对照。在25微升的体积中进行PCR分析，其中含有2.5微升PCR缓冲液，1微升50mM氯化镁，0.5微升10mMdNTPs，0.5微升正向引物和0.5微升反向引物，0.2微升TaqDNA聚合酶和25纳克模板DNA。将GUS正向引物5’CCATACCTGTTCACCGACGA3’，GUS反向引物5’GGAATTGATCAGCGTTGGTG3’，SOD正向引物5’CTACGTCGCCAACTACAACAA3’，SOD反向引物5’TAGTCTGGTCTGACATTCTTG3’用于PCR分析。用Peltier热循环仪(MJ)进行40轮PCR，开始为93℃3分钟，93℃45秒，50℃45秒，以及在72℃下最后延伸5分钟。通过琼脂糖凝胶电泳分离扩增的产物，并且用溴化乙锭染色。PCR产物Southern印迹分析将PCR凝胶用于Southern吸印目的。对所述凝胶进行吸印3小时，并将DNA转移到尼龙膜(HybondN，Amersham)上。预杂交在60℃下进行3小时(5％硫酸葡聚糖，5×SSC，0.1％SDS)，使用2％w/v的液体封闭物。用GUS和MnSOD专一性探针检测该滤膜16小时。在60℃下，用1×SSC和0.1％SDS洗涤所述膜2次，每次15分钟。在室温下，将所述膜在缓冲液A和液体封闭物的溶液中培养1小时。然后用抗荧光素AF缀合物抗体处理所述膜1小时。用缓冲液A和0.3％的Tween20充分洗涤所述膜2次，每次5分钟。将所述DNA一侧放在CDP-明星检测试剂上，放在黑暗中。擦去过多的试剂，并用塑料袋进行密封，然后曝光1小时和24小时，以便检测需要的带。所使用的探针是来自PAHC27质粒的GUS的2.08kb的SacI和BamHI片段，和来自pGV4质粒的MnSOD片段的900bp的pstl片段。结果植物再生和轰击。谷物类作物的盾片区是高度增殖的区域，它能大量产生全能愈伤组织。当珍珠稗品种843B的成熟种子的盾片部分朝向培养基放置时，它的愈伤化速度优于当它的盾片区远离培养基放置时的愈伤化速度。所述愈伤化速度在含有30克/升蔗糖，10毫克/升肌醇和各种浓度的2，4-D(5毫克/升，3毫克/升和1毫克/升)的MS培养基中非常有效。光照对种子的愈伤化效率起着重要影响。当MS3平板保持在黑暗中时，所有谷物的愈伤组织都开始产生酚类物质，其产生量大于在光照条件下的。因此，愈伤组织褐化，并且停止增殖，或者在很大程度上延缓增殖。为了抑制褐变现象，每隔5天将愈伤组织转移到新的MS培养基中，并且从M3期开始将它放在光照条件下。粟米组织培养的一个主要缺陷是形成多孔的柔软白色愈伤组织，这种组织极少或从不发生组构。必须偶尔去掉这种愈伤组织，以便获得硬实的胚胎发生愈伤组织块。珍珠稗843B品种的再生比例为30％。通过体细胞胚胎发生所获得的植物具有正常的染色体数，并表现出正常的结实性(图1-图4)。将三个愈伤化时期用于轰击。在这三个时期中MS3期是最适合的。愈伤组织平板距离阻挡屏6厘米的距离对于有效转化来说是理想的。这一点是通过瞬时Gus测定证实的。在愈伤组织上出现了明确的兰色斑点，证实了在它里面存在Gus基因。转化过的愈伤组织的选择用GUS和MnSOD结构轰击胚胎发生愈伤组织。将所述愈伤组织铺在含有潮霉素的选择培养基上。在为期1个月的时间里，一共获得了20个抗性愈伤组织。而在对照平板上没有愈伤组织存活。在所述选择培养基上愈伤组织的生长，类似于未转化过的品系的愈伤组织在非选择性培养基上的生长。所有愈伤组织都可以抗浓度高达50毫克/升的潮霉素。PCR分析用适合GUS和MnSOD的引物对随机挑选的抗性愈伤组织进行PCR分析。在该处理中维持所有合适的参数(材料和方法)。在分析12个愈伤组织中GUS基因的存在时，有3个愈伤组织出现了相当于正对照中的GUS基因的带(2.0kb)(图5)。根据PCR结果得出的转化效率为23％。重复进行PCR，以便证实这一结果。对用MnSOD轰击过的愈伤组织进行的PCR分析，发现在14个分析过的愈伤组织中，有一个具有相当于阳性对照中的带的需要的MnSOD基因插入片段(900bp)。在这两种情况下，负对照都没有出现任何带。重复所述PCR，以便证实这一结果。Southern印迹分析对PCR凝胶进行吸印，以便通过Southern分析分析GUS和MnSOD基因的存在。在处理所述印迹时，在负对照泳道中没有观察到信号。但是，在负对照泳道上，在MnSOD印迹上有一个微弱的信号。这可能是由于在珍珠稗中存在天然的MnSOD基因，因为它是一种半干旱作物。在GUS和MnSOD印迹上的阳性对照，都表现出相当于阳性样品泳道中的信号的信号。这一结果与PCR结果吻合。表1OSM-对愈伤组织进行渗透处理的时间DIST-愈伤组织距离阻挡屏的距离TRAN-转化效率表1表示珍珠稗843B的转化效率。GUS分析发现了不同时期的愈伤组织的不同结果。MS3期愈伤组织，在6厘米的距离上表现出了最佳的转化效率。参考文献1PascalLambe，MoniqueDinant，Rene.F.Matagne，DifferentiallongtermexpressionandmethylationofthehphandGUSgenesintransgenicpearlmilletcallus.Plantscience108(1995)51-622.Vasil.，VandVasil.，I.K，SomaticembryogenesisandplantregenerationfromtissueculturesofP.americanumxP.purpureumhybrid.Amer.J.Bot，68(6)864-872，19813.Hagio.，Takashi，optimizingtheparticlebombardmentmethodforefficientgenetictransformation，JARQ32，239-247(1998)4.Vasil.，v，Vasil.，I.K，somaticembryogenesisandplantregenerationfromthesuspensionculturesofpearlmillet，Amer.J.Bot，47，(1981)669-698.5.Hunold.Bronner，Hahne.，G，earlyeventsinmicroprojectilebombardment；cellviabilityandparticlelocation，ThePlantJournal(1994)，5(4)，593-6046.Kohli.，A，Gahakwa.，D，Philippevain，PaulChristou，Transgeneexpressioninriceengineeredthroughparticlebombardment，Planta(1999)208；88-977.MichaelNuccio，Rhodes，Hanson.，A.D，Metabolicengineeringofplantsforosmoticstressresistance，Plantbiotechnology，(2000)，128-1348.Edwards.，K，Johnstone，Thompson，.C，AsimpleandrapidmethodforthepreparationofplantgenomicDNAforPCRanalysis，N.A.Research，(1991)19，No.613499.Alan.，H，Peter.H，UbiquitinePromoterbasedvectorsforhighlevelexpressionandscreenablemarkersgenesinmonocotyledonousplants，Transgenicresearch5，213-218(1996)10.PhilippeVain，McMullen.，Michael，J.，John，Osmotictreatmentenhancesparticlebombardmentmediatedtransientandstabletransformationofmaize，PlantcellReports(1993)12；84-88权利要求1.一种biolistic转化和再生珍珠稗的方法，包括(a)在含有5毫克/升2，4-D的MS培养基上启动由珍珠稗种子开始的胚胎愈伤组织形成；(b)在黑暗中培养所述愈伤组织一段预定的时间；(c)在含有3毫克/升2，4-D的MS培养基上继代培养所述愈伤组织；(d)在光照条件下培养所述继代培养的愈伤组织一段预定的时间；(e)利用biolistic装置用含有预先确定的基因的质粒DNA对所述胚胎愈伤组织进行biolistic轰击；(f)让所述增殖的愈伤组织生长，并分化成幼苗；(g)用已知方法分析所述预先确定的基因在再生的幼苗中的表达。2.如权利要求1的方法，其中，所使用的珍珠稗品种是珍珠稗843B品种。3.如权利要求2的方法，其中，所述预先确定的基因是选自GUS编码基因、潮霉素抗性基因或MnSOD基因的标记基因。4.如权利要求1的方法，其中，在步骤(e)中用于转化基因的质粒选自pIG121Hm和pGV4结构。5.如权利要求4的方法，其中，所述pIG121Hm质粒被用于提供GUS和潮霉素抗性基因，并且含有CaMV35S启动子。6.如权利要求4的方法，其中，所述pGV4质粒被用于在步骤(e)中提供MnSOD基因，并且包括遍在蛋白启动子和NOS终止子。7.如权利要求1的方法，其中，用于将在步骤(f)中获得的愈伤组织分化成芽的培养基，是含有0.3ppm苄基氨基嘌呤(BAP)的MS基础培养基。8.如权利要求7的方法，其中，将所述愈伤组织在光照条件下保持大约30天时间，以便长芽。9.如权利要求1的方法，其中，用于将在步骤(f)中获得的愈伤组织分化成根的培养基，是含有2-3ppm吲哚乙酸(IAA)或0.3％活性碳的MS基础培养基。10.如权利要求1的方法，其中，所述方法还包括在无菌水中将所述植物驯化至少2天，并将它转移到无菌土壤中。11.如权利要求10的方法，其中，所述无菌土壤含有比例为1∶1的土壤和沙子。12.如权利要求1的方法，其中，在步骤(b)的遮光条件下，将所述愈伤组织培养30天。13.如权利要求1的方法，其中，在步骤(d)的光照条件下，将所述愈伤组织培养30天。14.如权利要求1的方法，其中，所述用于转化的biolistic枪是PDS-1000/He枪。15.如权利要求1或9的方法，其中，所述biolistic枪使用选自金的高速微型载体。16.如权利要求15的方法，其中，所述微型载体用DNA分子、亚精胺和氯化钙包衣。17.如权利要求15的方法，其中，所述DNA分子的浓度为大约5微克/微升，亚精胺的浓度为0.1M，氯化钙的浓度为2.5M。18.如权利要求15的方法，其中，所使用金的大小为1.5-3.0μ。19.如权利要求14的方法，其中，破裂碟片压力为900psi，氦气压力为1100psi，并且在枪膛中产生25mg/Hg的真空度。20.如权利要求1和14-19的方法，其中，在步骤(c)中以6厘米的距离对所述愈伤组织进行轰击，破裂碟片压力为900psi而氦气压力为1100psi。全文摘要本发明涉及珍珠稗的biolistic转化和再生方法，包括a)在含有5毫克/升2，4－D的MS培养基上启动由珍珠稗种子开始的胚胎愈伤组织形成；b)在黑暗中培养所述愈伤组织一段预定的时间；c)在含有3毫克/升2，4－D的MS培养基上继代培养所述愈伤组织；d)在光照条件下培养所述继代培养的愈伤组织一段预定的时间；e)利用biolistic装置用含有预先确定的基因的质粒DNA对所述胚胎愈伤组织进行biolistic轰击；f)让所述增殖的愈伤组织生长，并分化成幼苗；g)用已知方法分析所述预先确定的基因在再生的幼苗中的表达。文档编号C12N15/09GK1426476SQ01808556公开日2003年6月25日申请日期2001年2月26日优先权日2000年2月25日发明者维尔卢·摩托瓦拉·帕特尔,N·拉亚普拉姆,R·克里斯南,D·钱德兰申请人:阿维斯塔金格兰技术有限公司