专利名称：体外重建的人红细胞及其制备和在血液代用品中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种由结构蛋白、磷脂、血红蛋白等体外重建人工红细胞，作为新型血液代用品。本发明以结构蛋白、磷脂为基本分子材料协同包封血红蛋白，在体外重建人工红细胞；通过血红蛋白与结构蛋白、磷脂的结合，体外重建出生理功能和形态接近天然红细胞，具有可变形性、稳定性好、携氧-释氧能力强、去免疫化，而且细胞大小可以控制到纳米级的重建红细胞。本发明还涉及所述重建红细胞的制备方法和其在血液代用品应用。
目前对于用安全、有效的血液代用品的需求也在不断的增大，在临床医学实践中，输液时使用血液受到严格的限制。主要是由于红细胞的天然特性及传播疾病的危险而导致的。传统的人员输血方式存在一系列问题1.天然血液贮存和运输也很困难血液保存时间短，在4℃-8℃条件下最长保存时间为42天，如果长途运输也易造成溶血。2.由于其存在各种病毒包括艾滋病、肝炎等浸染的危险性，虽然献血员经过严格验血筛选，但丙型肝炎的危险性仍是1∶3000，HIV感染是1∶100000～1∶1000000；输血也可引起其他病毒、细菌、寄生虫及其他疾病的传播。3.输血需要供受体配型，否则出现免疫反应，存在不同血型的配伍、特殊血型的缺乏等问题。4.人口老化，健康供血人群不足，某些地区新鲜血液严重缺乏血源相对枯竭严重不足等问题，给临床救治、急救带来严重的困难和挑战；特别是在战争、严重自然灾害、恐怖性突发事件中，仅靠血库供血、人员献血更是难以满足实际需求，因此对血液代用品特别是性能和功能上最接近正常红细胞的“重建红细胞”的需求市场是难以估量的。
长期以来，血液代用品的研究一直是基础医学、临床医学和相关学科的研究目标。起初血液代用品主要以补充血容量，弥补由于失血造成的营养物质丢失为目的，通过配伍的营养补液来补充失去的血浆，但这不能够给肌体及时的输送氧，无法纠正失血后人体的缺氧性损伤；能够富积氧气并可在血液中缓释氧的含氟高分子有机物的应用标志着新型血液代用品的出现，目前比较新的血液代用品是将牛、羊血红蛋白在清除其免疫特性后，通过分子之间的交联(cross-linking)形成大分子并在惰性载体上固定化，或通过转基因技术将血红蛋白的表达基因转移到植物中，通过植物获得血红蛋白，在血液循环中模拟正常红细胞中天然血红蛋白的携氧-释氧生理功能，但这种模拟的血液代用品由于没有细胞膜的屏障，易与血液中的许多活性分子作用，诱发一系列异常的副反应，目前所用的血液代替物都含有血红蛋白(hemoglobin)，用后病人很多时都会出现血压增加(increased blood pressure)的情况。这是由于用来保持正常血压的NO，跟血红蛋白起反应，NO被耗尽，所以血压上升。目前生物相容性最好的血液代用品应属人工红细胞即用脂质体膜包裹天然血红蛋白分子，或基因重组血红蛋白及化学合成血红蛋白成为人工红血球，大小与红血球相似。但其存在的问题是这类脂质体人工红细胞携氧效率不高，膜易脆，血红蛋白泄漏，存放时间短到十几分钟，长也不过几天。
理想的血液代用品是具有正常血液的优点并克服其不足的产品。理想的血液代用品应具备1.高携氧能力、具有优良的流变学性质，可以改善促进微循环；2.当氧张力在正常生理范围内能运送氧；3.具有希望的清除特性；4.无毒副作用；5贮存期较长(目前血液代用品的寿命很短，短则几小时，最长寿命为70几小时，而天然红细胞的寿命则为120天)、无配型需要、输血反应及不激活正常免疫系统功能。目前研制的还没有一种血液代用品具有血液的全部优点。
目前血液代用品存在的上述不足的原因是现有的血液代用品均侧重于模拟正常红细胞的生理生化功能如携氧功能，大多数研究者没有认识到模拟正常红细胞力学特性和流变学特性的重要性。天然红细胞主要由血红蛋白、膜磷脂和结构蛋白有机地构成，血红蛋白与结构蛋白、膜脂之间有着密切的结构相关性。在结构蛋白组成中有维持细胞特定形态的结构蛋白、也有负责氧传输的通道蛋白；血红蛋白与结构蛋白通过结合是血红蛋白锚定到膜上，是血红蛋白的构象变化有利于结合氧；结构蛋白又与膜脂通过疏水作用形成最有利于氧传输的通道。正是这种相互的结构关系使红细胞具备优良的可变形性和粘弹性以及正常的携氧-释氧功能。这些结构关系在构架重建人工红细胞的过程中应该是不可忽略的。目前脂质体包封血红蛋白稳定性和携氧功能达不到要求的原因在于，以往的研究忽略了血红蛋白与结构蛋白之间、结构蛋白与膜脂之间的结构关系，以及这种关系对红细胞具有优良可变型性和流变学性质的贡献，而仅仅用膜脂对血红蛋白进行物理性包封。
本发明所要解决的技术问题之二是提供制备上述体外重建的人红细胞的方法。
本发明所要解决的技术问题之三是将上述体外重建出生理功能和形态接近天然红细胞的人红细胞用于制备血液代用品。
为解决上述技术问题之一，本发明采用的技术方案是这样的即一种磷脂-结构蛋白协同包封血红蛋白，体外构建的人工红细胞，包括以下的材料1.血红蛋白源于人、牛、羊、猪等血液制品；或通过构建基因，大肠杆菌或酵母菌等载体表达或分泌得到的产物；或通过转基因技术，由植物载体生产得到的产物。
2.结构蛋白源于天然植物蛋白产物；或通过构建质粒、基因扩增及大肠杆菌或酵母菌等载体表达或分泌得到的产物；或源于人、牛、羊、猪等血液制品；所述结构蛋白的分子量为250,000～620,000道尔顿，其紫外吸收光谱为λmax＝280(生理盐水)；在其凝胶电泳紫外扫描图谱中清晰可见三个蛋白峰，分别占总蛋白峰值的15％～20％、12％～24％和15％～20％。
3.磷脂源于天然植物浓缩磷脂，经分离纯化得到产物；或通过微生物发酵技术得到的磷脂产物。
上述成分中，结构蛋白和磷脂构成红细胞的细胞膜成分，在细胞膜成分中，按重量百分比结构蛋白占5～40％，磷脂占60～95％；重建的红细胞中，细胞膜成分占5～30％，血红蛋白占70～95％。
上述体外重建的人红细胞在大于100倍的电镜下观察具有与天然人红细胞相似的双凹碟盘形态。
为解决上述技术问题之二，本发明采用的技术方案是分离得到的结构蛋白经过蛋白质纯化系统取得相应的结构蛋白组分；将血红蛋白、结构蛋白经纯化复性后冷冻干燥备用；复合磷脂和磷脂采用精制技术纯化后备用。应用膜磷脂-结构蛋白协同包封血红蛋白，体外制备人工红细胞。工艺流程如
图1所示，具体的制备方法的步骤如下1、将源于植物蛋白或动物血液的结构蛋白的粗制品经过分离纯化、冷冻、干燥得到结构蛋白纯品；2、按比例加入纯化的磷脂或复合磷脂，并加入溶剂，再经过旋转蒸发，获得重构的细胞膜；3、按比例将血红蛋白用生理盐水溶解，缓慢加入重构的细胞膜中，并通过旋转反应器包封血红蛋白；4、将步骤3获得的产物悬浮于含细胞培养液的生理盐水中，孵育培养至少30分钟后，即制得重构的人工红细胞。
为解决上述技术问题之三，本发明采用的技术方案是用上述体外重建的人红细胞制备的血液代用品中，按体积百分比，重建红细胞占10％～55％，细胞营养液占45％～905％，其中细胞营养液包括生理盐水和蛋白营养液等。
本发明具有如下的特点及创新1.本发明首次提出红细胞体外重建(reconstruction oferythrocyte in vitro)的概念；目前医学上所用的血液代用品包括脂质体包封血红蛋白在内都只能在部分功能和结构上模拟体内正常红细胞。
2.本发明提出的红细胞体外重建的概念是基于不仅充分认识红细胞的生理生化功能，而且还充分认识红细胞的生物力学和流变学性能；在设计上充分考虑这种细胞力学特性与其生理生化功能之间存在密不可分的内在联系。
3.本发明体外重建的红细胞不仅要具备正常的生理生化功能，而且要具备良好的变性性和正常红细胞具有的双凹碟盘形态。
4.本研究使通过外源性的膜脂、结构蛋白、血红蛋白构建红细胞；构建的红细胞不仅在功能上接近正常红细胞而且其寿命也比现有的血液代用品有较大改善。
(1)、提取结构蛋白取大豆5克用生理盐水10～30ml浸泡8～12小时，组织捣碎后过滤除去残渣；于乳液中加入10～200μl 20mmol氯化镁生理盐水溶液，待有絮状物生成时将溶液冷冻离心(5000rpm，～4℃)15～20分钟，弃去上清液，沉淀用生理盐水溶解，然后加入硫酸铵溶液至饱和聚沉絮状物，再通过冷冻离心(5000rpm，～4℃)15～20分钟，得到结构蛋白粗品。
(2)、结构蛋白的分离纯化上述结构蛋白粗品经透析、脱盐、纯化、冷冻干燥，得到结构蛋白产物。通过此法得到的植物结构蛋白为球蛋白，通常为αβ二聚体、四聚体、六聚体，实验中通过pH和离子强度的调控使产物中70％以上为αβ二聚体球蛋白。实施例2 结构蛋白的分离纯化方法II(1)、提取结构蛋白用含有抗凝剂的动物血液(每30ml血液加约5ml肝素pH7.4等渗磷酸盐缓冲液)为了最大限度地降低结构蛋白的变性和酶解作用，整个操作应在0～4℃低温下进行。取上述抗凝血5ml，冷冻离心(3000rpm，～4℃，15～30分钟)，使红细胞沉淀，分离血浆上清液和血沉棕黄层(buffy coat)。
将红细胞用3倍体积量的预冷pH7.4的等渗磷酸缓冲液洗涤2～5次，每次冷冻离心(3000rpm，～4℃，15分钟)，除去上清液和沉淀表层。
于洗净的红细胞中，按体积比10～50的比例加入预冷的5～10mmol/L，pH7.4低渗Tris(三羟甲基氨基甲烷)-HCl缓冲液，置于～4℃环境中2～12小时溶血；然后冷冻离(9000rpm，～4℃，15～30分钟)，使红细胞结构蛋白沉淀。
(2)、结构蛋白的分离纯化用Tris-HCl缓冲液洗涤2～5次，得到结构蛋白粗品，再经透析、脱盐、纯化、冷冻干燥，得到结构蛋白产物。实施例5 结构蛋白的紫外吸收光谱检测将分离纯化得到的结构蛋白产物，以200～800ppm的浓度溶解于生理盐水中，进行紫外分光光度分析。仪器PE-λ900，扫描波长范围200～400nm。光谱图参见图2。图中实线代表源于动物血液的结构蛋白的紫外吸收峰，虚线均代表源于植物蛋白的结构蛋白的紫外吸收峰。三条光谱曲线均显示在280nm处存在最大吸收峰。实施例3 结构蛋白凝胶电泳紫外扫描图谱检测将分离纯化得到的结构蛋白产物，以10～200μg/ml的浓度溶解于生理盐水中，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。仪器电泳仪BIO-RAD300；图像系统IMAGE SYSTEM SX-100扫描凝胶。
参见图3，图中(1)蛋白峰P1占总蛋白峰值的15～26％、蛋白峰P2占总蛋白峰值的12～24％为重建红细胞的主要构架蛋白。(2)P3占总蛋白峰值的15～20％为重建红细胞的功能蛋白。实施例4 构建人工红细胞膜磷脂的复配本发明构建红细胞膜的磷脂可以为磷脂纯品，或为复合植物磷脂，或精制植物磷脂。
实施例中的复配磷脂的主要成分和重量百分比为1.磷脂酰胆碱 20～60％2.磷脂酰乙醇胺15～40％3.磷脂酰肌醇 5～20％4.磷脂酰丝胺酸12～30％实施例5 重建人工红细胞方法I(1)细胞膜构建a、将200～500mg精制浓缩大豆磷脂置于50ml圆底烧瓶中，用5ml脂质溶解液(氯仿/甲醇3/1)缓慢溶解，将圆底烧瓶置于旋转蒸发器上的水浴锅中，开启加热单元使水浴温度达到36℃，待磷脂样品溶解后启动旋转蒸发器(10rpm)缓慢涂布磷脂于园底烧瓶瓶壁；待涂布均匀后，将水浴的温度升至60～80℃，并充入氮气保护，然后继续旋转蒸发至溶剂挥发干净，冷却至室温。
b、将制备的结构蛋白10～50mg溶于200μl等渗生理盐水或等渗磷酸盐缓冲液(pH7.4)，并加入10μl 10mmol/L抗氧剂或保护剂溶液。待样品溶解后，缓慢滴加到旋转蒸发器上的园底烧瓶中。
(2)包封血红蛋白将分离制备的人血红蛋白20～50mg，在氮气保护下，溶于400ml等渗生理盐水或等渗磷酸盐缓冲液(pH7.4)，并加入10μl 10mmol/L抗氧剂或保护剂溶液；待样品溶解后，缓慢滴加到旋转蒸发器上已涂布了磷脂和结构蛋白的园底烧瓶中，在36℃水浴和氮气N2保护下，继续旋转烧瓶30分钟。待反应结束后，将反应液转移至试管中并充入N2封盖。
(3)孵育培养将细胞样品孵育培养3～30分钟，然后加入适量体积的含蛋白营养液的等渗生理盐水稀释，调节重建红细胞的压积在35～45％；储存于4℃冰箱冷藏备用。实施例6 重建人工红细胞方法II(1)、细胞膜构建a、将200～500mg磷脂酰胆碱和10mg胆固醇置于50ml圆底烧瓶中，用5ml脂质溶解液(氯仿/甲醇3/1)缓慢溶解，将圆底烧瓶置于旋转蒸发器上的水浴锅中，开启加热单元使水浴温度达到36℃，待磷脂样品溶解后启动旋转蒸发器(10rpm)缓慢涂布磷脂于园底烧瓶瓶壁；待涂布均匀后，将水浴的温度升至60～80℃，并充入氮气保护，然后继续旋转蒸发至溶剂挥发干净，冷却至室温。
b、将制备的植物结构蛋白10mg溶于200μl等渗生理盐水或等渗磷酸盐缓冲液(pH7.4)，并加入10μl 10mmol/L抗氧剂或保护剂溶液。待样品溶解后，缓慢滴加到旋转蒸发器上的园底烧瓶中。
(2)、包封血红蛋白将分离制备的人血红蛋白20～50mg，在氮气保护下，溶于400ml等渗生理盐水或等渗磷酸盐缓冲液(pH7.4)，并加入10μl 10mmol/L抗氧剂或保护剂溶液；待样品溶解后，缓慢滴加到旋转蒸发器上已涂布了磷脂和结构蛋白的园底烧瓶中，在36℃水浴和氮气N2保护下，继续旋转烧瓶30分钟。待反应结束后，将反应液转移至试管中并充入N2封盖。
(3)孵育培养将细胞样品超声振荡3～30分钟，然后加入适量体积的含蛋白营养液的等渗生理盐水稀释，调节重建红细胞的压积在35～45％；储存于4℃冰箱冷藏备用。实施例7 重建人工红细胞具有正常红细胞的可变形性实验人工红细胞可变形性以红细胞的膜粘弹性来描述，采用微管吸吮系统测定人工红细胞的粘弹性。人工红细胞用生理盐水悬浮置于小池中，并用生理盐水注满整个微管系统；用显微操作系统移动微管至悬浮人工红细胞的表面，通过压力系统(参见附图4)产生一阶跃负压吸吮人工红细胞；使细胞的小部分被吸入微管，用摄像处理仪、录相系统和时标记录人工红细胞随负压的变形时间过程；通过回放图像处理系统测定微管半径Rp、人工红细胞被吸入微管的长度及各点得时间过程。采用Kelvin模型和Chien“半球帽子模型”描述人工红细胞的粘弹性。
根据红细胞膜粘弹性的本购理论，用kelvin模型拟合实验结果。该模型由一个模量为μ的弹性单元和一个粘性系数为η的粘性单元并联而成。
设在t时刻，红细胞被吸入微管的长度为Dp，在t1记录时间内，其所达到的最大值为Dpm，则有如下关系。
(ΔP)Rp/μ＝2Xm-1+ln(2Xm)τ＝-α/|4[d ln(Dpm-Dp)/dt]η＝μt其中ΔP为阶跃负压，Rp为微管半径，Xm为Dpm/Dp，τ为所记录变形过程的时间常数，a为拟合常数。
(ΔP)Rp/μ＝2X-1+ln(2X)＝αX+b通过实验数据和上述公式，可计算求得人工红细胞的弹性模量和粘性系数(参见表1)，作为表征人工红细胞可变形性的物理量。表1.人工红细胞粘弹性系数弹性模量μ 粘性系数η红细胞类型(10-3dyn/cm) (10-4dyn·s/cm)重建人工红细胞 4.562～7.8920.175～0.372天然正常红细胞 1.120～8.7530.185～0.452表1数据显示出重建红细胞的可变形性与天然正常红细胞没有明显差异。实施例8 重建人工红细胞具有正常红细胞的双凹碟盘形态的观察根据前面所述的方法所构建的人工红细胞，应具有正常红细胞所具有的双凹碟盘形态。
重建人工红细胞用倒置显微镜在100倍放大条件下观察，(参见图5A、图5C)，其形态几乎与正常红细胞(图5D)的形态相似，都具有双凹碟盘形态；细胞尺度接近或小于正常红细胞。图5B为微管吸吮系统测定人工红细胞的粘弹性的实验图片。实施例9 重建人工红细胞的携氧-释氧功能根据前面所述的方法所构建的人工红细胞，具有正常的携氧-释氧功能参见附图7。实施例9 重建人工红细胞作为血液代用品的动物实验应用实例1以重建人工红细胞为原料，配以生理盐水并加入10～20％的小牛血清复配成人工血液作为血液代用品；并进行动物实验。
重建人工红细胞10～55％(体积百分比)。
细胞营养液45～90％(体积百分比)，其中含有细胞营养液10～20％(体积百分比)的小牛血清。
实验动物雄性Wister大鼠，每组5只，体重在185～250克范围。
实验过程将1％本巴比妥钠溶液以体重5‰的用量，腹腔注入Wister大鼠，标准法消毒、备皮，颈静脉采血1ml；然后实验组注入1ml用重建人工红细胞制备的血液代用品；对照组注入1ml含小牛血清的生理盐水。结扎血管，缝合伤口；注入庆大霉素预防感染，隔离观察；成活率实验组100％、对照组80％(1只大鼠失血性休克死亡)。血液最大置换率为血容量的～10％，置换后大鼠血液循环、血氧饱和度、呼吸及生理活动均正常。实施例10 重建人工红细胞作为血液代用品的动物实验应用实例2以重建人工红细胞为原料，配以生理盐水并加入10～20％的小牛血清复配成人工血液作为血液代用品；并进行动物实验。
重建人工红细胞10～55％(体积百分比)。
细胞营养液45～90％(体积百分比)，其中含有细胞营养液10～20％(体积百分比)的小牛血清。
实验动物雄性Wister大鼠，每组5只，体重在185～250克范围。
实验过程将1％本巴比妥钠溶液以体重5％的用量，腹腔注入Wister大鼠，标准法消毒、备皮，颈静脉采血2ml；然后实验组注入2ml用重建人工红细胞制备的血液代用品；对照组注入2ml含小牛血清的生理盐水。结扎血管，缝合伤口；注入庆大霉素预防感染，隔离观察；成活率实验组100％、对照组40％(1只大鼠失血性休克死亡，2只大鼠出现呼吸窘迫症，最后死亡)。血液最大置换率为血容量的～20％，置换后大鼠血液循环、血氧饱和度、呼吸及生理活动均正常。实施例11 重建人工红细胞作为血液代用品的动物实验应用实例3以重建人工红细胞为原料，配以生理盐水并加入10～20％的小牛血清复配成人工血液作为血液代用品；并进行动物实验。
重建人工红细胞10～55％(体积百分比)。
细胞营养液45～90％(体积百分比)，其中含有细胞营养液10～20％(体积百分比)的小牛血清。
实验动物雄性Wister大鼠，每组5只，体重在185～250克范围。
实验过程将1％本巴比妥钠溶液以体重5‰的用量，腹腔注入Wister大鼠，标准法消毒、备皮，颈静脉采血3ml；然后实验组注入3ml用重建人工红细胞制备的血液代用品；对照组注入3ml含小牛血清的生理盐水。结扎血管，缝合伤口；注入庆大霉素预防感染，隔离观察；成活率实验组100％、对照组20％(1只大鼠失血性休克死亡，3只大鼠出现呼吸窘迫症，最后死亡)。血液最大置换率为血容量的～30％，置换后大鼠血液循环、呼吸及生理活动均正常。实施例16 重建人工红细胞作为血液代用品的动物实验应用实例4以重建人工红细胞为原料，配以生理盐水并加入10～20％的小牛血清复配成人工血液作为血液代用品；并进行动物实验。
重建人工红细胞10～55％(体积百分比)。
细胞营养液45～90％(体积百分比)，其中含有细胞营养液10～20％(体积百分比)的小牛血清。
实验动物雄性Wister大鼠，每组5只，体重在185～250克范围。
实验过程将1％本巴比妥钠溶液以体重5‰的用量，腹腔注入Wister大鼠，标准法消毒、备皮，颈静脉采血4ml；然后实验组注入4ml用重建人工红细胞制备的血液代用品；对照组注入4ml含小牛血清的生理盐水。结扎血管，缝合伤口；注入庆大霉素预防感染，隔离观察；成活率实验组100％、对照组0％(5只大鼠均出现失血性休克并出现呼吸窘迫症，最后死亡)。血液最大置换率为血容量的～40％，置换后大鼠血液循环、呼吸及生理活动均正常。实施例12 重建人工红细胞作为血液代用品的动物实验应用实例5以重建人工红细胞为原料，配以生理盐水并加入10～20％的小牛血清复配成人工血液作为血液代用品；并进行动物实验。
重建人工红细胞10～55％(体积百分比)。
细胞营养液45～90％(体积百分比)，其中含有10～20％(体积百分比)的小牛血清。
实验动物雄性Wister大鼠，每组5只，体重在185～250克范围。
实验过程将1％本巴比妥钠溶液以体重5‰的用量，腹腔注入Wister大鼠，标准法消毒、备皮，颈静脉采血3ml；然后实验组注入3ml用重建人工红细胞制备的血液代用品；对照组注入3ml含小牛血清的生理盐水。结扎血管，缝合伤口；注入庆大霉素预防感染，隔离观察；成活率实验组100％、对照组20％(1只大鼠失血性休克死亡，3只大鼠出现呼吸窘迫症，最后死亡)。血液最大置换率为血容量的～30％，置换后大鼠血液循环、呼吸及生理活动均正常。实施例13 重建人工红细胞复配血液代用品后的冷藏实验将重建人工红细胞配以生理盐水和稳定剂和抗氧剂并加入10～20％的小牛血清复配成人工血液作为血液代用品；分别置于4℃和-20℃冰箱中进行分步冷藏4～72小时实验。解冻复苏后，重建人工红细胞仍然具有正常的双凹碟盘形态；并且动物实验说明冷藏后的人工红细胞然可作为有效的血液代用品。
实验动物雄性Wister大鼠，每组5只，体重在185～250克范围。
实验过程将1％本巴比妥钠溶液以体重5‰的用量，腹腔注入Wister大鼠，标准法消毒、备皮，颈静脉采血1～3ml；然后实验组注入3ml用重建人工红细胞制备的血液代用品；对照组注入3ml含小牛血清的生理盐水。结扎血管，缝合伤口；注入庆大霉素预防感染，隔离观察；成活率实验组100％、。血液最大置换率为血容量的10～30％，置换后大鼠血液循环、呼吸及生理活动均正常。
权利要求
1.一种体外重建的人红细胞，其特征是包括以下的材料(1).血红蛋白；(2).结构蛋白其分子量250,000～620,000道尔顿，其紫外吸收光谱为λmax＝280(生理盐水)；在凝胶电泳紫外扫描图谱中清晰可见三个蛋白峰，分别占总蛋白峰值的15％～20％、12％～24％和15％～20％；(3).磷脂；上述成分中，结构蛋白和磷脂构成红细胞的细胞膜成分，在细胞膜成分中，按重量百分比结构蛋白占5～40％，磷脂占60～95％；重建的红细胞中，细胞膜成分占5～30％，血红蛋白占70～95％。上述体外重建的人红细胞在倒置显微镜下(100倍)观察具有与天然人红细胞相似的双凹碟盘形态。
2.一种体外重建的如权利要求1所述人红细胞的方法，其方法的步骤如下(1)、将源于植物蛋白或动物血液的结构蛋白的粗制品经过分离纯化、冷冻、干燥得到结构蛋白纯品；(2)、按比例加入纯化的磷脂或复合磷脂，并加入溶剂，再经过旋转蒸发，获得重构的细胞膜；(3)、按比例将血红蛋白用生理盐水溶解，缓慢加入重构的细胞膜中，并通过旋转反应器包封血红蛋白；(4)、将步骤3获得的产物悬浮于含细胞培养液的生理盐水中，孵育培养至少30分钟后，即制得重构的人工红细胞。
3.一种如权利要求1所述的体外重建的人红细胞制备的血液代用品，其特征是按体积百分比，重建红细胞占10％～55％，细胞营养液45％～90％。
4.根据权利要求1所述的体外重建的人红细胞，其特征是所述磷脂可以为磷脂纯品，或为复配磷脂，或精制植物磷脂。
5.据权利要求4所述的体外重建的人红细胞，其特征是复配磷脂的主要成分和重量百分比为磷脂酰胆碱20～60％、磷脂酰乙醇胺15～40％、磷脂酰肌醇5～20％、磷脂酰丝胺酸12～30％。
全文摘要
本发明涉及体外重建的人红细胞及其制备和在血液代用品中的应用。其中体外重建的人红细胞由血红蛋白、结构蛋白和磷脂构建；具有与天然人红细胞相似的双凹碟盘形态。本发明体外重建出的红细胞的生理功能和形态接近天然红细胞，具有可变形性、稳定性好、携氧－释氧能力强、去免疫化，而且细胞大小可以控制到纳米级的重建红细胞。本发明还涉及所述重建红细胞的制备方法和其在血液代用品应用。
文档编号C12N5/08GK1410529SQ0213378
公开日2003年4月16日 申请日期2002年9月18日 优先权日2002年9月18日
发明者王翔, 段建军, 高玮 申请人:重庆飞翔生物技术有限公司