专利名称：通过发酵产生靶物质的方法
技术领域：
本发明涉及一种用于发酵工业的技术，更准确地讲是一种通过利用一种微生物发酵有效产生一种例如L-氨基酸的靶物质的方法。
背景技术：
细菌细胞一直在修饰其代谢途径和呼吸途径等等来适应不同的环境。在能量代谢中，Arc(有氧呼吸控制)以及Fnr(延胡索酸盐硝酸还原作用)都是已知为起到很重要作用的控制系统。其包括普遍存在于大肠杆菌以及其他类似的种群中的球形调控蛋白。前者为位于大肠杆菌染色体上的0分位点的arcA基因所编码，后者为位于大肠杆菌染色体上的29分位点的fnr基因所编码，且二者同时在一个厌氧条件下通过控制许多因子来使细胞适应一个环境。更进一步讲，其被解释为Arc A蛋白和Fnr蛋白同时为转录因子，并且其通过直接连接至靶基因的控制区域来正向或反向地控制作在厌氧环境下一个靶基因在大肠杆菌染色体上的表达(S.Iuchi et al.，Cell，66 5-7(1991))。
最近，编码来源于大肠杆菌的球形调控蛋白例如arcA蛋白及Fnr蛋白的基因被破裂后通过使用DNA微阵列技术被收集至一个数据库且向公众公开(http//www.genome.ad.jp/dbget-bin/get_htext？Exp_DB+-n+Bget-bin/get_htext？Exp_DB+-n+B)。
迄今为止，已知ArcA蛋白反向调节三羧酸循环中基因的表达(S.Iuchi et al.，Cell，66，5-7(1991))，而且三羧酸循环中基因的表达在数据库中的arcA破裂株中是增加的。另一方面，已知Fnr蛋白正向调控在厌氧环境中起到作用的呼吸途径中的基因的表达。
至于球形因子破裂株中的表达情况，dam-破裂株被提到其中TCA循环中的基因表达如同arcA破裂株一样是增加的(H.Mori，Nara Institute of science andtechnology，oral announcement at the symposium”Gene biotechnology of GenomeAge”，2001，organized by Japan Bioindustry Associateon，Resource BiotransformationStudy Group)。
Dam蛋白是涉及到胞内限制修饰系统修饰因子的一个甲基化酶，且其由存在于大肠杆菌染色体上的76分位点处的dam基因所编码(Proc，Natl，Acad，Sci.USA.，87(23)，9454-9458(1990))。
至今尚未报道有关通过球形因子例如基因arcA，fnr以及dam的表达控制来提高物质的产率。
发明内容
本发明的一个目的就是通过使用一个γ-蛋白细菌(γ-proteobacterium)例如大肠杆菌的发酵来提高一个有用物质的产率。
本发明的发明者进行了不同的研究以实现上述目的，他们发现由γ-蛋白细菌生产的物质可以通过修饰一个编码普遍存在于一个γ-蛋白细菌中的调控蛋白的基因来提高产率。那就是，他们发现能够产生靶物质的能力可以由破裂一个存在于γ-蛋白细菌中的arcA基因来提高而由此来完成本发明。
那就是，本发明提供了下述技术方案(1)能够产生靶物质且被修饰以致于其中的ArcA蛋白不能正常发挥功能的一种γ-蛋白细菌。
(2)如(1)所述的γ-蛋白细菌，其中的能正常发挥功能的ArcA蛋白是一个如下述(A)或(B)进行限定的蛋白(A)一个具有如SEQ ID NO32所述氨基酸序列的蛋白；(B)一个包括替代，缺失，插入或增加一个或多个氨基酸且其具有与正常情况下蛋白发挥正常的功能相比在γ-蛋白细菌中蛋白不能正常发挥功能时靶物质生产能力的提高而且具有如SEQ ID NO32所述氨基酸序列的蛋白。
(3)如(1)所述的γ-蛋白细菌，其中的能正常发挥功能的ArcA蛋白是一个具有与SEQ ID NO32所述氨基酸序列有70％或更多同源性的蛋白且其具有与正常情况下蛋白发挥正常的功能相比在γ-蛋白细菌中蛋白不能正常发挥功能时靶物质生产能力的提高。
(4)如(1)所述的γ-蛋白细菌，其中的能正常发挥功能的ArcA蛋白是一个具有SEQ ID NO32所述氨基酸序列包括替代，缺失，插入或增加2-20个氨基酸且其具有与正常情况下蛋白发挥正常的功能相比在γ-蛋白细菌中蛋白不能正常发挥功能时靶物质生产能力的提高的蛋白。
(5)如(1)～(4)之一所述的γ-蛋白细菌，其中的不能正常发挥功能的ArcA蛋白是通过在一个染色体上破裂arcA基因的方法来实现的。
(6)如(5)所述的γ-蛋白细菌，其中的arcA基因是由下述(a)或(b)定义的DNA(a)含有SEQ ID NO31中的101-817核苷的核苷酸序列的DNA；(b)与SEQ ID NO31中的101-817核苷的核苷酸序列杂交的DNA或在严格条件下能够从所述核苷酸序列中产生且编码一个与正常情况下蛋白发挥正常的功能相比不能正常发挥功能时靶物质生产能力的提高的蛋白的探针。
(7)如(1)～(6)之一所述的γ-蛋白细菌，其中的细菌属于埃希氏菌属。
(8)如(1)～(7)之一所述的γ-蛋白细菌，其中的靶物质是一种L-氨基酸。
(9)如(8)所述的γ-蛋白细菌，其中的L-氨基酸选自L-赖氨酸，L-谷氨酸以及L-精氨酸。
(10)一种产生靶物质的方法，其包括在培养基中培养如(1)～(9)之一所述的γ-蛋白细菌以在培养基或细胞中产生及积累靶物质且从所述的培养基和细胞中收集靶物质。
按照本发明，当一个有用物质例如L-氨基酸通过γ-蛋白细菌产生时，其生产效率可以被提高。
图1显示的是在WC196，WC196ΔarcA，WC196Δdam以及WC196Δfnr中的积累模式。
具体实施例方式
下面，本发明将详细描述。
(1)本发明所述的γ-蛋白细菌用于本发明的γ-蛋白细菌并不特别限制，只要它属于γ-蛋白细菌例如埃希氏菌属，肠杆菌属，泛菌属，克雷伯氏菌属，沙雷氏菌属，欧文氏菌属，沙门氏菌属，摩根氏菌属或其类似属且具有产生靶物质的能力即可。详细说，按照NCBI(生物工程学国家信息中心)分类学其被归于γ-蛋白细菌。
(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/htbin-post/Taxonomy/wgetorg？mode＝Tree&id＝1236&1v1＝3&keep＝1&srchmode＝1&unlock)。
属于埃希氏菌属的细菌例子包括大肠杆菌等，属于肠杆菌属的细菌的例子包括成团肠杆菌，产气肠杆菌等等。
成团肠杆菌的一些种最近重新划归为成团泛菌，菠萝泛菌，斯氏泛菌成团亚种或基于16S rRNA等的核苷序列的类似物。在本发明中，或者属于肠杆菌或者属于泛菌属的细菌因此划分为γ-蛋白细菌且含有arcA基因。
当通过基因工程技术培育大肠杆菌时，可以使用到大肠杆菌K12株及其衍生物。更进一步，当使用基因工程技术培育菠萝泛菌时，菠萝泛菌株AJ13355(FERMBP-6614)，AJ13356(FERMBP-6615)以及AJ13601(FERM BP-7207)以及其衍生物可以被用到。尽管上述菌株被分离时被鉴别为成团肠杆菌，这些菌株基于如上所述的16S rRNA等的核苷序列分析重新被划分为菠萝泛菌。
本发明所述的γ-蛋白细菌可以是上述任一细菌，且是一个具有可以产生靶物质能力的细菌。“产生靶物质能力”意指可以在细胞或培养基中产生或累积靶物质的能力，其在这样一个程度上即当本发明的细菌被培养在培养基中时，靶物质可以从细胞或培养基中收集。按照本发明所要产生的靶物质并不特别限制，只要其是一个可被γ-蛋白细菌产生且通过三羧酸循环产生或者通过底物合成的物质。具体的例子包括，传统上可被γ-蛋白细菌产生的物质，例如，不同的氨基酸例如L-赖氨酸，L-苏氨酸，L-异亮氨酸，L-谷氨酸及L-谷氨酰胺及L-精氨酸，有机酸例如L-高丝氨酸及琥珀酸等等。更进一步，本发明还能应用于尚未应用γ-蛋白细菌工业上生产的物质，其可以通过TCA循环合成的物质作为底物来合成。
作为生产L-赖氨酸的γ-蛋白细菌其可以作为一个举例的突变株其具有对L-赖氨酸类似物的抗性。该L-赖氨酸类似物是一个底物其可以抑制L氨基酸生产菌株的生长，但是当L赖氨酸共存于一个培养基中时这种抑制可以被全部或部分取消。L-赖氨酸类似物的例子包括溶菌素，赖氨酸羟氨基盐，S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸(AEC)，γ-甲基赖氨酸，α-氯己内酰胺等等。具有对这些赖氨酸类似物抗性的突变株可以通过将γ-蛋白细菌经过一个传统的人工基因诱变处理而得到。用于产生L赖氨酸的细菌株的具体例子包括大肠杆菌AJ11442(FERM BP-1543，NRRL B-12185；参照日本专利公开的56-18596以及美国专利号4346170以及大肠杆菌VL611。在这些微生物中，通过L赖氨酸的天冬氨酸激酶的反馈抑制已被减弱。
除了上面所述的以外，还有被提到的例如随后所述的L-苏氨酸产生菌，因为L赖氨酸对天冬氨酸激酶的抑制作用其一般在L苏氨酸产生菌中被删除。
在随后所述的实施例中，WC196菌株被用作大肠杆菌的L赖氨酸产生菌。该细菌菌株通过给予对来源于大肠杆菌K-12的W3110株的AEC抗性来孵育。该菌株被命名为大肠杆菌AJ13069，且于1994年12月6日保存于国立生物科学及人类科技研究所，科技工业代理机构且收到一个保藏号FERM P-14690(现在，该独立的管理公司，国际专利生物储藏，国立高级工业科技研究所，邮编305-8566，CHUO DAI-6，1-1HIGASHI 1-CHOME，TSUKUBA-SHI，IBARAKI-KEN，日本)。然后按照布达佩斯条约于1995年9月29日转送至国际保藏且收到一个保藏号FERM BP-5252(参照国际专利
发明者石川有纪子, 今泉明, 松井和彦, 児岛宏之, 之, 彦 申请人:味之素株式会社