一种微流控芯片及其早期诊断系统和应用的制作方法

专利名称：一种微流控芯片及其早期诊断系统和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及微全分析系统，具体地说是一种微流控芯片及其早期诊断系统和应用。
背景技术：
现有技术(文献1.WHO，Cumulative number of reported cases(SARS).Available at http//www.who.int/csr/sarscountry/2003-04-03；文献2.PoutanenSM，Low DE，Henry B，Finkelstein S，Rose D，Green K，Tellier R，Draker R，Adachi D，Ayers M，Chan AK，Skowronski DM，Salit I，Simor AE，Slutsky AS，Doyle PW，Krajden M，Petric M，Brunham RC，and McGeer AJ.Identificationof severe acute respiratory syndrome in Canada.N Engl J Med.Low-1～low-11(at www.nejm.org on March 31，2003)；文献3.Stephensen CB，CaseBolt DB，and Gangopadhyay NN.Phylogenetic analysis of a highlyconserved region of the polymerase gene from 11 coronaviruses anddevelopment of a consensus polymerase chain reaction assay.Virus Res.1999，60181-189；文献4.Vabret A，Mouthon F，Mourez T，Gouarin S，PetitjeanJ，and Freymuth F.Direct diagnosis of humanrespiratorycoronaviruses229Eand;OC43bythepolymerasechainreaction.JVirolMethods.2001，9759-66；文献5.朱汝南，等。用逆转录—聚合酶链反应鉴别呼吸道合胞病毒亚型。中华儿科杂志，1998，361-3。文献6.王艳，马文丽，宋艳斌，等。反转录巢式PCR方法检测SARS冠状病毒。第一军医大学学报，2003，3(5)421-423.文献7.杨洁，王战会，陈金军，侯金林。SARS冠状病毒多聚酶基因临床检测方法的建立。第一军医大学学报，2003，23(5)424-427.)所述的检测内容只是针对呼吸道致热病毒单一的病原体检测方法，无论是通过抗原抗体反应原理分析的抗体检测法，还是通过基因分析的聚合酶链反应(PCR)的早期诊断法都是如此。就PCR检测法而言，常规PCR法都是将病原体的基因经PCR反应后将产物经普通凝胶(如Agrose凝胶)电泳分离得到目的产物进行确认的，PCR反应体系和电泳检测是分开的，较难进行定量，检测灵敏度较低；其次，操作亦不方便；另一种PCR检测法是实时定量PCR(real-time quantitative PCR)，该方法PCR反应和定量检测基本上是同时进行的，是目前最为先进的PCR方法。尽管该法具有灵敏度高、定量等优点，但是，它对非特异性的PCR反应无法进行识别，因为它没有对扩增产物进行分离的过程，因此，它会产生假阳性结果。文献(文献6.王艳，马文丽，宋艳斌，等。反转录巢式PCR方法检测SARS冠状病毒。第一军医大学学报，2003，3(5)421-423.文献7.杨洁，王战会，陈金军，侯金林。SARS冠状病毒多聚酶基因临床检测方法的建立。第一军医大学学报，2003，23(5)424-427.)阐述了SARS病毒检测中所采用的逆转录PCR和巢式PCR方法，最终运用的分析方法是普通凝胶电泳，所以存在检测灵敏度低且不能对产物进行定量等问题。
微全分析系统(Miniaturized Total Analysis System，μ-TAS)或称芯片实验室(Lab-on-a-chip)，是指把生物和化学等领域中所涉及的样品制备、生物与化学反应、分离检测等基本操作单位集成或基本集成一块几平方厘米的芯片上，用以完成不同的生物或化学反应过程，并对其产物进行分析的一种技术(文献14林炳承.微流控芯片实验室及其功能化，中国药科大学学报[J].2003，34(1)1-6)，它是通过分析化学、微机电加工(MEMS)、计算机、电子学、材料科学与生物学、医学和工程学等交叉来实现泵、阀、管道等器件的微型集成达到化学分析检测即实现从试样处理到检测的整体微型化、自动化、集成化与便携化这一目标。最近的发展表明，90年代初由Manz等人(文献15.Manz A，GraberN，Widmer H M.SensorActuators B，1990，1244)提出的以微电子加工技术为依托的芯片实验室的发展将会象四十年前微电子技术在信息科学的发展中引发一场革命一样，预计芯片实验室将在未来的发展中对分析科学乃至整个科学技术以及相关的产业界产生相似的作用。计算机芯片使计算微型化，而芯片实验室使实验室微型化，因此，在生物医学领域它可以使珍贵的生物样品和试剂消耗降低到微升甚至纳升级，而且分析速度成倍提高，成本成倍下降；在化学领域它可以使以前需要在一个大实验室花大量样品、试剂和很多时间才能完成的分析和合成，将在一块小的芯片上花很少量样品和试剂以很短的时间同时完成大量实验；在分析化学领域，它可以使以前大的分析仪器变成平方厘米尺寸规模的分析仪，将大大节约资源和能源。芯片实验室由于排污很少，所以也是一种“绿色”技术。
有关报道(文献8.Jianing Yang，Yingjie Liu，Cory B.，et al.Highsensitivity PCR assay in plastic micro reactors Lab Chip，2002，2，179-187；文献9.R.C.Anderson，X.Su，G.J.Bogdan and J.A.Fenton，Miniatureintegrated device for automated multistep genetic assays，Nucleic Acids Res.，2000，28(12)，60E.文献10.Y.J.Liu，C.B.Rauch，R.L Stevens，R.Lenigk，J.Yang，D.B.Rhine and P.Grodzinski，DNA amplification and hybridizationassays in integrated plastic monolithic devices，Anal.Chem.，2002，74，3063-3070.文献11.Y.J.Liu，C.B.Rauch，R.L.Stevens，R.Lenigk，J.Yang，D.B.Rhine and P.Grodzinski，DNA amplification and hybridization assays inintegrated plastic monolithic devices，Anal.Chem.，2002，74，3063-3070.文献12.P.Wilding，L.J.Kricka，J.Cheng，G.Hvichia，M.A.Shoffner and P.Fortina，Integrated cell isolation and polymerase chain reaction analysis using siliconmicrofilter chamber，Anal.Biochem.，1998，257(2)，95-100.文献13.H.Nagai，Y.Murakami，Y.Morita，K.Yokoyama and E.Tamiya，Development of amicrochamber array for picoliter PCR，Anal.Chem.，2001，73(5)，1043-1047.)微流控芯片和PCR的结合情况。这些文献未报告用于呼吸道疾病病原体的检测，更未报道用于SARS病毒的检测；同时亦未报道用于多种病原体的检查。

发明内容
本发明的目的在于提供一种灵敏度高、定量、检测结果准确的微流控芯片及其早期诊断系统和应用为实现上述目的，本发明采用的技术方案为微流控芯片，由管道、盛液池等组成，在盛液池间的进样管道上设有反应池。
可高度集成和高通量的PCR微流控芯片由可耐110度左右温度的光透性好的材料(无色，可透过750～150纳米波长的光)组成，例如有机材料，如聚碳酸酯(PC)塑料等，以及无机材料，如石英、玻璃等；其结构中包括有多个盛液池、微通道和毫米级的反应管道或反应孔(池)组成，其结构示意图如图2、3、6所示。其中芯片底层(板)的厚度为1毫米～50微米；在进样管道上的反应池与盛液池间可设有提取区；管道及反应池深度为10～50微米，宽度或直径为50微米～5毫米；在管道的末端打有2～4毫米直径的孔。
芯片的构建方式是通过微电子的制膜、涂胶、光刻、化学刻蚀或光(短波激光)刻的方法将微通道和反应管道或反应孔(池)构建在上述的材料上，另一块相同材质和大小的封板通过化学(如胶粘、硅酸盐等)和物理(如加热等)的方法对接到上述的板上(有管道的一面)，形成所需的微流控芯片；在反应孔和道中加入一些有机或(和)无机材料，可使检测样品得到提取或(和)浓缩。
所述微流控芯片的早期诊断系统，由热循环仪、微流控芯片、激光诱导荧光检测系统及电源组成，微流控芯片的反应池置于热循环仪的热循环区，微流控芯片的管道未端分别通过电极与电源的正负极相连，激光诱导荧光检测系统的检测点设于微流控芯片的分离管道上。
微流控芯片热循环仪由发热与致冷的电子元件、电路控制、温度循环控制程序组成；其原理示意图如图1所示。
可用于进行非典型性肺炎病毒、呼吸道流感病毒、呼吸道副流感病毒、呼吸道合胞病毒及呼吸道腺病毒五种致热性病毒的联合基因早期鉴别诊断。
本发明具有如下优点1.定量、检测结果准确。将聚合酶链反应(PCR)和其产物分离检测集成在耐热的芯片上，即将样品中DNA或RNA提取和浓缩、PCR和其产物的荧光标记(以已知量的DNA作内标，可将产物进行定量分析)集成在同一块芯片上；既保持了实时定量PCR的定量优点，同时克服了其假阳性的缺点。在操作上采用在线技术，所以象实时定量PCR一样克服了常规PCR那种多步骤、离线、易污染的分析方法，操作方便。
2.检测灵敏度高。本发明采用了高灵敏的激光诱导荧光检测技术，所以其灵敏度比常规PCR检测技术大大提高。
3.检测速度快。芯片上其PCR反应体积在5微升以下，所以，大大减少了试剂用量，同时芯片反应器具有比以往PCR反应器体表面积比率大，使扩增效率大大提高，又因热循环仪采用了双向加热与致冷，因而可缩短扩增反应的时间，使扩增与检测时间缩短至25分钟内完成，达到快速检测目的。
4.集成性高。本发明芯片上实现了多操作步骤、多功能集成；可集成和实现高通量，即可在同一块芯片上实现多人份多病原体的同时检测。
5.应用效果好。本发明利用芯片实验室技术研制出一套呼吸道五种致热性病毒病原体微流控芯片早期诊断系统，同时可进行五种致热性病毒的联合基因早期鉴别诊断。这五种致热性病毒包括呼吸道非典型性肺炎(SARS)病毒、呼吸道流感病毒、呼吸道副流感病毒、呼吸道合胞病毒、呼吸道腺病毒；其发病特点有许多相似性，如传染性、引起肺炎严重者导致患者死亡等，给人们的生命财产造成重大损失；又因为均为病毒感染所以其症状有许多相似性，如发热、导致肺炎等；临床血液学检查均为白细胞总数下降，严重者所造成的肺部感染的X胸片相类同，以此难以作出鉴别诊断；特别是在病源学不清的情况下，易造成大流行，造成重大的损失，SARS在中国的流行就是其中最近的一例。本发明同样利用基因扩增的方法(PCR)对上述的五种病毒进行一次性多重扩增，其扩增反应在本发明所述的扩增反应芯片扩增器中进行，然后在线进行扩增产物的标记和芯片电泳分离。


图1为微流控芯片热循环仪原理示意图；其中11为致冷原件，12为发热原件，13为芯片，14为计算机温度控制，15为电源电路。
图2为本发明检测芯片之一示意图；图3为本发明检测芯片之二示意图；图4为本发明检测芯片之三示意图；图5为本发明检测芯片之四示意图；图6为本发明检测芯片之五示意图；其中1为盛液池，2为热循环区，3为反应池，4为检测点。
图7为SARS病毒基因PCR产物芯片电泳图谱。
图8为SARS基因扩增产物与DNA标准品图谱。
具体实施例方式
实施例1 PCR芯片的构建以玻璃PCR芯片为例将构思好的芯片图如图2-6利用CAD软件在计算机上进行设计后，用5000dpi以上的打印机制成掩模，按标准的电子蚀刻工艺在符合分析化学用途的玻璃上蚀刻出所设计的图案，其管道、反应器、提取区管道、反应腔等其深度一般在10微米至50微米之间，宽度或直径一般在50微米至5毫米之间；蚀刻好的玻璃用超声波打孔器在管道的末端打上2毫米至4毫米直径的孔，然后与另一块厚度为1毫米至50微米的同质玻璃经过严格的多步骤清洗过程后，将蚀刻有通道的玻璃面与另一准备好的玻璃片对接好，放入程序控温炉中，并在对接好的玻璃片上压适当的重物；然后，采用程序控温的方法在经过约48小时的升温和降温程序，将二块玻璃通过热键合封接到一起；最后，根据玻璃表面的粗糙度进行打磨和抛光，从而得到所需要的芯片。
本发明PCR反应芯片的特点如下1.PCR反应器置于芯片内部，避免加热时液体蒸发，如图2，3，6中所示的反应池等；2.增加了反应时反应池的体表面积(与进样孔比较)，提高了反应效率，如图2，3，6中所示；3.将反应池数量增加，如图4，5所示可以同时实施多个样品的DNA扩增；如果用其中的一个池载已知量的DNA标准，同时可实现PCR产物的定量分析；4.在图2，3，4，5，6中均可实施多重PCR的条件优化与扩增，即可完成多重PCR的扩增与产物的分离检测。
实施例2以SARS为例，利用德国BNI公司的引物和模板在芯片PCR、芯片电泳仪上完成了DNA扩增和PCR产物的分离检测。
模板包含有SARS病毒序列400多碱基序列的质粒。
引物ATG AAT TAC CAA GTC AAT GGT TAC正义引物CAT AAC CAG TCG GTA CAG CTA C反义引物PCR反应所用的如Taq酶等其它试剂由大连宝生物生物技术公司提供。
将试剂按说明书配制好，然后取3μL放入到已经将缓冲液灌好在微流通道中的玻璃芯片的样品孔中，在样品孔和其它三个含缓冲液的孔中再分别加入5～7μL矿物油覆盖反应试剂或缓冲液以防蒸发；将准备好的此芯片放入芯片PCR仪中；按照94℃ 1分钟预温后，按94℃30秒，55℃30，72℃30秒程序进行25次，最后72℃60秒；将芯片的四个孔中分别插入四个铂电极，按下列电泳条件在芯片分析仪上进行进样与分离检测，即可得到PCR产物峰，从而实现芯片对SARS检测的目的(见图7所示)。同理可进行SARS样品的检测，略有不同之处是样品首先需要进行RNA的提取。
实验条件电泳缓冲液100mM三(羟甲基)氨基甲烷(TBE)缓冲液，pH9.4；分离电压150～250V/cm，由正极至负极，抑制电压340～400V/cm；进样电压400V/cm，由正极至负极；在分离DNA时，100mM TBE缓冲液中加入2％的羟甲基纤维素(HPMC)；芯片在使用前用双蒸水冲洗干净，然后灌注电泳缓冲液，同时将样品加入样品池中，尽量保持各池中液面高度一致。每次电泳完毕后，吸出各池中液体，然后用双蒸水冲洗通道5分钟。芯片可一次性使用亦可多次使用。
利用本发明芯片扩增了SARS病毒的cDNA中的189bp长基因片段，并在线分离了其PCR扩增产物(189bp)和定量，见图8。本例定量分析结果为5ng/ul。
权利要求
1.一种微流控芯片，由管道、盛液池等组成，其特征在于在盛液池间的进样管道上设有反应池。
2.按照权利要求1所述微流控芯片，其特征在于芯片由可耐温度110度的光透性好的材料组成，其中芯片底层的厚度为1毫米～50微米。
3.按照权利要求1所述微流控芯片，其特征在于在进样管道上的反应池与盛液池间设有提取区。
4.按照权利要求1所述微流控芯片，其特征在于管道及反应池深度为10～50微米，宽度或直径为50微米～5毫米。
5.按照权利要求1所述微流控芯片，其特征在于在管道的末端打有2～4毫米直径的孔。
6.一种权利要求1所述微流控芯片的早期诊断系统，其特征在于由热循环仪、微流控芯片、激光诱导荧光检测系统及电源组成，微流控芯片的反应池置于热循环仪的热循环区，微流控芯片的管道未端分别通过电极与电源的正负极相连，激光诱导荧光检测系统的检测口设于微流控芯片的分离管道上。
7.一种权利要求6所述微流控芯片早期诊断系统的应用，其特征在于用于进行非典型性肺炎病毒、呼吸道流感病毒、呼吸道副流感病毒、呼吸道合胞病毒及呼吸道腺病毒五种致热性病毒的联合基因早期鉴别诊断。
全文摘要
本发明涉及微全分析系统，具体地说是一种微流控芯片及其早期诊断系统和应用，微流控芯片，由管道、盛液池等组成，在盛液池间的进样管道上设有反应池；早期诊断系统，由热循环仪、微流控芯片、激光诱导荧光检测系统及电源组成，微流控芯片的反应池置于热循环仪的热循环区，微流控芯片的管道末端分别通过电极与电源的正负极相连，激光诱导荧光检测系统的检测口设于微流控芯片的分离管道上。本发明的优点为定量、检测结果准确，检测灵敏度高、速度快，集成性高，应用效果好。
文档编号C12Q1/25GK1514012SQ03133769
公开日2004年7月21日 申请日期2003年7月22日 优先权日2003年7月22日
发明者周小棉, 林炳承, 刘大渔, 钟润涛, 戴忠鹏, 罗勇, 李义海, 梅晓丹 申请人:珍奥集团股份有限公司