分解源自海参的硫酸化脱氧半乳聚糖的酶的制作方法

专利名称：分解源自海参的硫酸化脱氧半乳聚糖的酶的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种能降解在糖工程领域有用的硫酸化脱氧半乳聚糖的酶，制备该酶的方法和激活该酶的各种因子，以及用作糖工程的反应物的硫酸化脱氧半乳聚糖低聚糖及其制备方法。
背景技术：
海参中含有几种硫酸化多聚糖。它们包括一种其主要组分为硫酸化岩藻糖的多聚糖的硫酸化脱氧半乳聚糖。已经报道了从海参来源的硫酸化脱氧半乳聚糖具有抑制AIDS病毒感染的活性和抗凝血活性。如果从海参来源的硫酸化脱氧半乳聚糖被开发用作药物，就必须测定其结构。已经对源自海参的硫酸化脱氧半乳聚糖的结构进行了研究，但是目前只测定了该结构的平均值。如果将一种能降解硫酸化脱氧半乳聚糖的酶用于测定该硫酸化脱氧半乳聚糖的结构将是很有利的。但是，商业上没有可购买的能降解源自海参的硫酸化脱氧半乳聚糖的酶。各种褐藻中也含有硫酸化脱氧半乳聚糖，而且在很多情况中它们的结构是不同的，取决于它们被从其中分离出来的藻类。例如，从Fucus evanescens，Laminaria japonica和Nemacystus decipiens中提取的硫酸化脱氧半乳聚糖的结构互不相同。已经报道了几种能降解从褐藻中分离的硫酸化脱氧半乳聚糖的酶(WO 96/34004，WO97/26896，WO 99/11797，WO 99/41288和EP 1306389)，但是它们中没有一种能用于降解源自海参的硫酸化脱氧半乳聚糖。因此，认为从海参中分离的硫酸化脱氧半乳聚糖的结构与从褐藻中分离的硫酸化脱氧半乳聚糖的结构不同。
如上所述，需要一种能降解源自海参的硫酸化脱氧半乳聚糖的酶，酶的制备以及结构上同源的硫酸化脱氧半乳聚糖。

发明内容
因此，本发明的主要目的是提供能降解源自海参的硫酸化脱氧半乳聚糖的硫酸化脱氧半乳聚糖降解酶和制备该酶的方法，以及通过使该酶对硫酸化脱氧半乳聚糖作用而获得的较小的分子以及制备该分子的方法。本发明的更进一步的目的是提供一种能激活硫酸化脱氧半乳聚糖降解酶的因子。
发明概述本发明的发明者已经发现，一种属于Fucoidanobacter属的细菌菌株，Fucoidanobacter marinus SI-0098，能产生一种新的硫酸化脱氧半乳聚糖降解酶，并发现了制备该酶的方法。本发明的发明者还发现利用该酶可从源自海参的硫酸化脱氧半乳聚糖制备一种新的硫酸化脱氧半乳聚糖低聚糖。从而，已经完成了本发明。
本发明的第一个方面涉及一种从Fucoidanobacter属的细菌的培养物获得的内型α-L-岩藻糖苷酶。
根据第一个方面，可以从能制备内型α-L-岩藻糖苷酶的Fucoidanobacter属细菌的培养物收集该酶。
本发明的第二个方面涉及一种能从Fucoidanobactet属细菌的培养物获得的硫酸化脱氧半乳聚糖硫酸酯酶。
根据第二个方面，可以从能制备硫酸化脱氧半乳聚糖硫酸酯酶的Fucoidanobacter属细菌的培养物收集该酶。
本发明的第三个方面涉及一种硫酸化脱氧半乳聚糖低聚糖，其能通过使第一个方面的内型α-L-岩藻糖苷酶对源自海参的硫酸化脱氧半乳聚糖的级分作用来获得。
第三个方面的硫酸化脱氧半乳聚糖低聚糖可以根据制备硫酸化脱氧半乳聚糖低聚糖的方法制备，包括使第一个方面的内型α-L-岩藻糖苷酶作用于源自海参的硫酸化脱氧半乳聚糖级分。该方法可以在氯化钠的存在下进行。
本发明的第四个方面涉及一种硫酸化脱氧半乳聚糖低聚糖，其可以通过使第一个方面的内型α-L-岩藻糖苷酶和第二个方面的硫酸化脱氧半乳聚糖硫酸酯酶对源自海参的硫酸化脱氧半乳聚糖级分作用来获得。
第四个方面的硫酸化脱氧半乳聚糖低聚糖可以根据制备硫酸化脱氧半乳聚糖低聚糖的方法制备，包括使第一个方面的内型α-L-岩藻糖苷酶和第二个方面的硫酸化脱氧半乳聚糖硫酸酯酶对源自海参的硫酸化脱氧半乳聚糖级分作用。该方法可以在氯化钠和/或氯化钙的存在下进行。
附图简述

图1该图说明了pH与本发明的内型α-L-岩藻糖苷酶的相对活性(％)之间的关系。
图2该图说明了温度(℃)与本发明的内型α-L-岩藻糖苷酶的相对活性(％)之间的关系。
图3该图说明了盐浓度(mM)与本发明的内型α-L-岩藻糖苷酶的相对活性(％)之间的关系。
图4该图说明了pH与本发明的硫酸化脱氧半乳聚糖硫酸酯酶的相对活性(％)之间的关系。
图5该图说明了温度(℃)与本发明的硫酸化脱氧半乳聚糖硫酸酯酶的相对活性(％)之间的关系。
图6该图说明了盐浓度(mM)与本发明的硫酸化脱氧半乳聚糖硫酸酯酶的相对活性(％)之间的关系。
图7该图说明了使用本发明的内型α-L-岩藻糖苷酶通过降解硫酸化脱氧半乳聚糖获得的硫酸化脱氧半乳聚糖低聚糖的凝胶过滤洗脱曲线。
图8该图说明了使用本发明的内型α-L-岩藻糖苷酶和硫酸化脱氧半乳聚糖通过降解硫酸化脱氧半乳聚糖获得的硫酸化脱氧半乳聚糖低聚糖的HPLC分析结果。
发明详述在下文中，将对本发明进行详细描述。
尽管其并不是对本发明的限制，但是例如，源自Apostichopusjaponicus的硫酸化脱氧半乳聚糖能被用作本发明的源自海参的硫酸化脱氧半乳聚糖。Apostichopus japonicus优选作为原料，因为使用它能高效率的制备本发明的硫酸化脱氧半乳聚糖低聚糖。
本发明的内型α-L-岩藻糖苷酶是一种能对源自海参的硫酸化脱氧半乳聚糖作用从而产生一种在还原末端具有岩藻糖的低聚糖。
本发明的硫酸化脱氧半乳聚糖硫酸酯酶是一种能在它对通过使本发明的内型α-L-岩藻糖苷酶对源自海参或Apostichopusjaponicus的硫酸化脱氧半乳聚糖作用而产生的低聚糖作用的基础上释放硫酸的酶。
本发明的硫酸化脱氧半乳聚糖低聚糖是一种低聚糖，其可通过使本发明的内型α-L-岩藻糖苷酶单独或与本发明的硫酸化脱氧半乳聚糖硫酸酯酶一起对源自海参的硫酸化脱氧半乳聚糖作用而获得。它在还原末端具有岩藻糖。
首先通过把海参浸泡在水溶液中提取硫酸化多聚糖级分，从而产生源自本发明使用的海参的硫酸化脱氧半乳聚糖。在该情况下，优选获得pH4-9，温度为100℃或以下的级分以防止硫酸化脱氧半乳聚糖转化为较小的分子。此外，硫酸化多聚糖级分中的氨基酸，小分子色素或其类似物通过超滤可以有效的除去。活性碳处理或类似处理对除去疏水物质是有效的。
海参的硫酸化多聚糖级分可如上所述获得。该级分可用作硫酸化脱氧半乳聚糖级分，例如，作为测定本发明的内型α-L-岩藻糖苷酶或硫酸化脱氧半乳聚糖硫酸酯酶活性的底物，或作为制备本发明的硫酸化脱氧半乳聚糖低聚糖的底物。更纯的硫酸化脱氧半乳聚糖可以通过使用阴离子交换柱分离级分获得。使用阴离子交换柱纯化的硫酸化多聚糖级分和硫酸化脱氧半乳聚糖都能用作测定本发明的内型α-L-岩藻糖苷酶或硫酸化脱氧半乳聚糖硫酸酯酶的底物，或用作制备本发明的硫酸化脱氧半乳聚糖低聚糖的底物。
关于用于制备本发明的内型α-L-岩藻糖苷酶或硫酸化脱氧半乳聚糖硫酸酯酶的细菌没有特殊的限定，只要它是能制备该酶的细菌。例如，可使用Fucoidanobacter marinus SI-0098。该细菌菌株是本发明的发明者分离的细菌。该菌株命名为Fucoidanobacter marinusSI-0098，并于1995年3月29日(原始保藏日期)保藏在国际专利微生物保藏单位，国家高等科学和技术研究所(AIST Tsukuba Central6，1-1，Higashi 1-chome，Tsukuba，Ibaraki 305-8566，Japan)，保藏号为FERM P-14873，于1996年2月15日(要求转为国际保藏机构的日期)在布达佩斯条约下保藏于国际专利微生物保藏单位，国家高等科学和技术研究所，保藏号为FERM BP-5403。
本发明的发明者测定了该菌株的编码16S rRNA的DNA的核苷酸序列，检测了它与已知细菌的16S rRNA的同源性，并认为该菌株属于与Verrucomicrobia关系最近的新属的细菌。
该菌株的编码16S rRNA的DNA的序列如SEQ ID NO1所示。本发明的内型α-L-岩藻糖苷酶，或硫酸化脱氧半乳聚糖硫酸酯酶，包括根据编码16S rRNA的DNA序列，从被测定属于Fucoidanobactermarinus SI-0098所属的属的细菌所获得的内型α-L-岩藻糖苷酶，或硫酸化脱氧半乳聚糖酯酶。
可以添加任何营养源到培养基中，培养能制备本发明的内型α-L-岩藻糖苷酶或硫酸化脱氧半乳聚糖硫酸酯酶的细菌，只要它在该营养源的存在下能通过微生物被利用而产生酶。例如，硫酸化脱氧半乳聚糖，海参，干海参，海藻，褐藻酸，海带多糖，岩藻糖，葡萄糖，甘露醇，甘油，蔗糖，麦芽糖，淀粉或其类似物可被用作碳源。酵母提取物，蛋白胨，水解酪蛋白氨基酸，玉米浆，肉膏，脱脂大豆，硫酸铵，氯化铵，尿素，尿酸或其类似物适于用作氮源。此外，钠，钾，镁，钙，锌的氯化物，磷酸盐或硫酸盐或其类似物都可以添加。总的来讲，从海水中分离的微生物能很容易地在海水或商业可利用的人造海水中生长。
测定培养条件以便基于所使用的微生物，培养基的组分等等本发明的内型α-L-岩藻糖苷酶或硫酸化脱氧半乳聚糖硫酸酯酶的产率能达到最大。通常，通过在培养温度15到30℃，培养基pH5到9的条件下通气搅动培养5到72小时能达到本发明的内型α-L-岩藻糖苷酶或硫酸化脱氧半乳聚糖硫酸酯酶的最大的产率。本发明的内型α-L-岩藻糖苷酶或硫酸化脱氧半乳聚糖硫酸酯酶可通过培养后进行离心从各自分离到的细胞和培养物上清获得。
通过在合适的培养基中培养Fucoidanobacter marinus SI-0098，收集细胞，并使用细胞裂解的常规方法裂解细胞(例如，超声处理)可获得无细胞提取物。本发明的内型α-L-岩藻糖苷酶或硫酸化脱氧半乳聚糖酯酶可以使用纯化的常规方法从提取物中纯化。本发明的内型α-L-岩藻糖苷酶或硫酸化脱氧半乳聚糖硫酸酯酶可以通过例如，盐析，离子交换柱色谱，疏水柱色谱，凝胶过滤或类似的方法获得其纯化的形式。另外，与用于细胞内的酶纯化相似的方法可用于纯化来自含有该酶的培养物上清的本发明的内型α-L-岩藻糖苷酶或硫酸化脱氧半乳聚糖硫酸酯酶。
本发明的内型α-L-岩藻糖苷酶的物理和化学特性如下(I)作用于源自海参的硫酸化脱氧半乳聚糖从而水解α-L-岩藻糖基(fucosyl)键；(II)最适pH为大约7到9(图1，该图说明了反应的pH与酶的相对活性之间的关系，其中纵轴表示相对活性(％)，横轴表示pH)；和(III)最适温度为大约25到45℃(图2，该图说明了反应温度和酶的相对活性之间的关系，其中纵轴表示相对活性(％)，横轴表示温度(℃))。
本发明的内型α-L-岩藻糖苷酶可通过测定降解硫酸化脱氧半乳聚糖的活性来鉴定。通过离心制备菌株的培养物获得的上清，使用各种柱色谱纯化后获得无细胞提取物，或酶溶液可用于鉴定。
本发明的内型α-L-岩藻糖苷酶在氯化钠存在下被激活。
含有氯化钠的任何物质如作为试剂的氯化钠，精制食盐，海水或人工海水都可用作氯化钠。添加到本发明的内型α-L-岩藻糖苷酶的反应混合物中的氯化钠的浓度范围可以从大约1mM到大约1M，优选从大约5mM到大约900mM。
本发明的硫酸化脱氧半乳聚糖硫酸酯酶的物理和化学性质如下(I)作用于源自海参的硫酸化脱氧半乳聚糖从而释放硫酸，而且与通过使本发明的内型α-L-岩藻糖苷酶单独作用所获得的转化相比，其在内型α-L-岩藻糖苷酶的存在下促进源自海参的硫酸化脱氧半乳聚糖转化为较小的分子；(II)其最适PH为大约6到8(图4，该曲线图说明了反应PH与酶的相对活性之间的关系，其中纵轴表示相对活性(％)，横轴表示PH)；和(III)其最适温度为大约20到45℃(图5，该曲线图说明了反应温度与酶的相对活性之间的关系，其中纵轴表示相对活性(％)，横轴表示温度(℃)。
本发明的硫酸化脱氧半乳聚糖硫酸酯酶可通过测定释放的硫酸来测定。通过离心制备菌株的培养物获得的上清，使用各种柱色谱纯化后获得无细胞提取物，或酶溶液可用于鉴定。
本发明的硫酸化脱氧半乳聚糖酯在氯化钠和/或钙离子的存在下被激活。
关于氯化钠，含有氯化钠的任何物质如作为试剂的氯化钠，精制食盐，海水或人造海水都可用作氯化钠。添加到本发明的硫酸化脱氧半乳聚糖酯酶的反应混合物中的氯化钠的浓度范围可以从大约1mM到大约2M，优选从大约5mM到大约1M。
关于钙离子，含有钙离子的任何物质如作为试剂的氯化钙或醋酸钙可用作钙离子。添加到本发明的硫酸化脱氧半乳聚糖酯酶的反应混合物中的钙离子的浓度范围可以从大约0.1mM到大约1M，优选从大约1mM到大约500mM。
Fucoidanobacter marinus SI-0098是一种能利用硫酸化脱氧半乳聚糖，并在细胞内或外产生本发明的内型α-L-岩藻糖苷酶和硫酸化脱氧半乳聚糖酯酶以降解硫酸化脱氧半乳聚糖的微生物。
本发明的硫酸化脱氧半乳聚糖低聚糖是通过使本发明的内型α-L-岩藻糖苷酶单独或与本发明的硫酸化脱氧半乳聚糖酯酶一起对源自海参的硫酸化脱氧半乳聚糖或含有硫酸化脱氧半乳聚糖的物质作用而获得的低聚糖。它在还原末端具有岩藻糖。例如，硫酸化脱氧半乳聚糖的部分纯化制品，源自海参的硫酸化多聚糖级分，使用水溶液获得的海参的提取物，干海参或未加工海参优选用作含有硫酸化脱氧半乳聚糖的物质。
为了制备本发明的硫酸化脱氧半乳聚糖低聚糖，硫酸化脱氧半乳聚糖或含硫酸化脱氧半乳聚糖的物质可以根据常规方法进行溶解。硫酸化脱氧半乳聚糖或含硫酸化脱氧半乳聚糖的物质可以最大的浓度溶解在溶液中。但是，浓度选择通常要考虑其可操作性，以及反应中使用的本发明的内型α-L-岩藻糖苷酶或硫酸化脱氧半乳聚糖硫酸酯酶的量。硫酸化脱氧半乳聚糖的溶剂根据对象可以从水，缓冲液等中选择。关于反应条件没有特别限定，只要使所用的酶能显示其活性。一般，溶液的PH接近中性。酶反应通常在大约30℃进行。可以通过调节反应中使用的内型α-L-岩藻糖苷酶和硫酸化脱氧半乳聚糖硫酸酯酶的比率或量，反应混合物的组成，反应时间等等来控制硫酸化脱氧半乳聚糖低聚糖的分子量。本发明的具有更多的相似分子量或电荷密度分布的硫酸化脱氧半乳聚糖低聚糖可以通过对如上所述获得的本发明的硫酸化脱氧半乳聚糖低聚糖使用阴离子交换柱进行分子量分馏或分馏来制备。分子量分馏的常规方法(例如，凝胶过滤或超滤)可以使用。可选择地，较小的分子可以进一步的使用离子交换树脂处理，活性碳处理或类似的方法进行纯化，或它们可以被脱盐，灭菌或冻干。
本发明的硫酸化脱氧半乳聚糖低聚糖在分子里含有硫酸盐基团，该基团与不同的碱形成盐。本发明的硫酸化脱氧半乳聚糖低聚糖当它们以盐的形式存在时是稳定的。它经常以钠和/或钾和/或钙盐的形式提供。本发明的以游离形式存在的硫酸化脱氧半乳聚糖低聚糖可以使用阳离子交换树脂如Dowex 50w从其盐中分离。可选择地，它可以进行常规的盐交换来使其转化为各种预期盐的任何一种。
药学上可接受的盐可用作本发明的硫酸化脱氧半乳聚糖低聚糖的盐。盐的例子包括与碱金属(例如，钠和钾)和碱土金属(例如，钙，镁和锌)以及铵盐形成的盐。
本发明的内型α-L-岩藻糖苷酶和硫酸化脱氧半乳聚糖硫酸酯酶可用于硫酸化脱氧半乳聚糖的结构分析，因为它们能把硫酸化脱氧半乳聚糖转化为较小的分子。此外，本发明的硫酸化脱氧半乳聚糖低聚糖还能用作糖工程的反应物。例如，可用作糖工程反应物的物质(例如，它可用作硫酸化脱氧半乳聚糖低聚糖的荧光标记标准)可以通过使低聚糖与2-氨基吡啶一起根据JP-B 5-65108中所述的方法进行氨化作用来制备PA-标记的低聚糖来提供。另外，本发明的硫酸化脱氧半乳聚糖低聚糖可用作抗原根据已知的方法来制备能识别本发明的硫酸化脱氧半乳聚糖低聚糖的抗体。能识别本发明的硫酸化脱氧半乳聚糖低聚糖的抗体能用于分析硫酸化多聚糖的结构，而且因此，它是很有用的。
实施例下面的实施例进一步详细说明了本发明，但不构成对其范围的限制。
参考实施例1海参来源的硫酸化多聚糖级分的制备35kg的商业海参的体壁部分被细微切割，并在匀浆器中以4体积的丙酮处理8000rpm 5分钟。匀浆然后通过滤纸过滤来获得滤渣。滤渣然后在匀浆器中用4体积的丙酮处理8000rpm 5分钟。匀浆然后通过滤纸过滤来获得滤渣。这样获得的滤渣通风干燥，获得1132g海参体壁的丙酮处理的制品。
400g的海参体壁丙酮处理制品悬浮于含有100mM氯化钠和10mM氯化钙的10L 30mM咪唑-盐酸缓冲液(pH6.5)中，添加2g肌动蛋白酶E到其中，混合物于45℃处理3小时，然后于95℃处理2小时。处理过的混合物过滤通过不锈钢滤网(孔径106μm)，添加20g活性碳到得到的滤出液中，混合物于室温搅动30分钟。然后离心混合物获得上清，以10％终浓度添加乙醇到上清中。使用带有排阻分子量100,000的空心纤维的超滤装置将混合物浓缩到2L。对浓缩液进行离心除去不溶性物质。得到的上清使用超滤装置与含有10％乙醇的100mM氯化钠进行溶剂交换。溶液于4℃或以下冷却，然后用盐酸调节PH到2.0。离心除去形成的沉淀物以获得上清。上清的PH用氢氧化钠调节到8.0。上清使用超滤装置与20mM氯化钠进行溶剂交换。离心从溶液中除去不溶性物质。然后上清被冻干获得37g源自海参的硫酸化多聚糖级分的干产物。
参考实施例2硫酸化脱氧半乳聚糖级分的制备7g参考实施例1中所述的源自海参的硫酸化多聚糖级分的干产物被溶解于含有50mM氯化钠和10％乙醇的700ml 20mM咪唑-盐酸缓冲液中(PH7.0)，并离心除去不溶性物质。得到的上清上样到用相同缓冲液平衡过的5-L DEAE-Cellulofine A-800柱中。用相同的缓冲液洗涤后，用50mM到2.05M的氯化钠梯度溶液进行洗脱来收集级分，每个级分含有500ml洗出液。根据苯酚-硫酸方法和咔唑-硫酸方法分别测定每个级分的总糖含量和糖醛酸含量。收集用0.8到1.5M的氯化钠洗脱的级分(级分nos.45-57)来获得硫酸化脱氧半乳聚糖级分。
参考实施例3测定内型α-L-岩藻糖苷酶活性的方法15μl硫酸化脱氧半乳聚糖级分1％溶液，75μl 50mM磷酸钠缓冲液(PH8.5)，9μl 4M氯化钠，41μl水和10μl本发明的内型α-L-岩藻糖苷酶溶液被混合到一起。于37℃反应1小时后，反应混合物于100℃处理10分钟。离心混合物获得的100μl上清使用HPLC进行分析，来测定转化为较小分子的程度。作为对照，通过其中用来溶解本发明的内型α-L-岩藻糖苷酶的缓冲液用于替代酶溶液的反应获得反应混合物，以及通过其中的水用于替代硫酸化脱氧半乳聚糖级分的反应获得的反应混合物使用HPLC以类似的方法进行分析。
1个单位的内型α-L-岩藻糖苷酶活性定义为在上述的反应系统中在1分钟内断裂1μmol硫酸化脱氧半乳聚糖岩藻糖键所需的酶量。内型α-L-岩藻糖苷酶活性根据下述等式计算
{(15×1000×1/100)/MG}×{(MG/M)-1}×{1/(60×0.01)}＝U/ml15×1000×1/100添加到反应系统中的硫酸化脱氧半乳聚糖级分(μg)；MG作为底物的硫酸化脱氧半乳聚糖的平均分子量；M反应产物的平均分子量；(MG/M)-11分子硫酸化脱氧半乳聚糖中被酶断裂的位点数；60反应时间(分钟)；和0.01酶溶液(ml)的体积。
HPLC如下进行。
设备L-6200(Hitachi)；柱OHpak SB-806HQ(8×300mm；Showa Denko)；洗脱液50mM含有5mM叠氮钠的氯化钠；检测示差折光率检测器(Shodex RI-71，Showa Denko)；流速1ml/分钟；和柱温25℃。
进行以下步骤以测定反应产物的平均分子量。商业可获得的分子量已知的支链淀粉在与上述HPLC分析相同的条件下进行分析。普鲁兰的分子量与保留时间之间的关系表示成一种曲线，该曲线用作测定反应产物的分子量的标准曲线。通过测定酶溶液在280nm处的吸收来测定蛋白质的量。通过定义含有1mg/ml蛋白质的溶液的吸收值为1.0来进行计算。
参考实施例4测定硫酸化脱氧半乳聚糖硫酸酯酶活性的方法15μl 1％的硫酸化脱氧半乳聚糖级分溶液，75μl 50mM咪唑-盐酸缓冲液(PH7.0)，6μl 4M氯化钠，3μl 1M氯化钙，31μl水和20μl本发明的硫酸化脱氧半乳聚糖硫酸酯酶溶液被混合在一起。于37℃反应1小时后，反应混合物于100℃处理10分钟。使用HPLC对通过离心混合物获得的100μl上清进行分析来测定产生的硫酸的量。作为对照，通过其中用来溶解本发明的硫酸化脱氧半乳聚糖硫酸酯酶的缓冲液用于代替酶溶液的反应获得的反应混合物，以及通过其中水用于代替硫酸化脱氧半乳聚糖级分的反应获得的反应混合物使用HPLC以类似的方法进行分析。
1个单位的硫酸化脱氧半乳聚糖硫酸酯酶活性定义为在上述反应系统中1分钟内产生1μmol硫酸所需的酶量。硫酸化脱氧半乳聚糖硫酸酯酶活性可根据下面的等式进行计算S/(60×0.02)＝U/mlS反应产生的硫酸(μmol)；60反应时间(分钟)；和0.02酶溶液的体积(ml)。
HPLC如下进行。
设备L-6200(Hitachi)；柱OHpak SB-804HQ(8×300mm；Showa Denko)；洗脱液50mM含有5mM叠氮钠的氯化钠；检测示差折光率检测器(Shodex RI-71，Showa Denko)；流速1ml/分钟；和柱温35℃。
使用HPLC在同样的条件下对1mM或0.5mM硫酸钠进行分析来测定作为反应的结果所释放的硫酸的量。硫酸钠的浓度与峰高之间的关系以曲线图表示，该曲线图用作测定释放的硫酸的量的标准曲线。
实施例1内型α-L-岩藻糖苷酶的制备(1)Fucoidanobacter marinus SI-0098接种到5ml已经于120℃高压灭菌20分钟的由含有如参考实施例1中所述制备的源自海参的硫酸化多聚糖级分的人造海水和蛋白胨组成的培养基(JamarineLaboratory)(PH8.2)中，其浓度分别为0.3％和1％，并于25℃培养2天。150μl的培养物被接种到100ml含有相同组分的培养基中，并于25℃培养3天。每个都装有600ml含有相同组分的培养基和浓度为0.01％的消泡剂(KM70，Shin-EtsuChemical)的7个2-L锥形烧瓶于120℃高压灭菌20分钟。接种1ml培养物到每个培养基中，并于25℃培养3天。培养后，离心培养物获得细胞和培养物上清。重复同样的培养步骤，从12.6L培养物中获得大约15g湿细胞。
细胞悬浮于200ml含有100mM氯化钠和5mMβ-巯基乙醇的10mM咪唑-盐酸缓冲液(PH7.5)中，通过超声处理进行裂解，并离心获得上清。上清用相同缓冲液进行充分透析，并离心获得上清。
上清上样到用相同缓冲液平衡过的500-ml DEAE-CellulofineA-800柱上。用相同缓冲液洗涤后，用100到500mM的氯化钠梯度溶液进行洗脱来收集级分，每个级分含有45ml洗出液。测定各个级分的内型α-L-岩藻糖苷酶活性并收集具有活性的级分。
用含有50mM氯化钠和5mMβ-巯基乙醇的10mM咪唑-盐酸缓冲液(PH7.5)对活性级分进行充分透析以进行溶剂交换。酶溶液上样到用相同缓冲液平衡过的150-ml DEAE-Cellulofine A-800柱上。用相同的缓冲液洗涤后，用50到400mM的氯化钠梯度溶液进行洗脱来收集级分，每个级分含有20ml洗出液。测定各个级分的内型α-L-岩藻糖苷酶活性并收集具有活性的级分。
用含有50mM氯化钠和5mMβ-巯基乙醇的10mM咪唑-盐酸缓冲液(PH7.5)对活性级分进行充分透析以进行溶剂交换。酶溶液上样到用相同缓冲液平衡过的80-ml硫酸化的Cellulofine A-800柱上。用相同的缓冲液洗涤后，用50到1500mM的氯化钠梯度溶液进行洗脱来收集每个含有5ml洗出液的级分。测定各个级分的内型α-L-岩藻糖苷酶活性并收集具有活性的级分。
用含有100mM氯化钠和5mMβ-巯基乙醇的10mM咪唑-盐酸缓冲液(PH7.5)对活性级分进行充分透析，接着用含有150mM氯化钠和5mMβ-巯基乙醇的磷酸钾缓冲液进行溶剂交换。酶溶液上样到用相同缓冲液平衡过的40-ml羟磷灰石柱(Wako Pure ChemicalIndustries)上。用相同的缓冲液洗涤后，用40到250mM的磷酸钾梯度溶液进行洗脱来收集每个含有6ml洗出液的级分。测定各个级分的内型α-L-岩藻糖苷酶活性并收集具有活性的级分。
用含有100mM氯化钠和5mMβ-巯基乙醇的10mM咪唑-盐酸缓冲液(PH7.5)对活性级分进行充分透析以进行溶剂交换。酶溶液上样到用同样的缓冲液平衡过的1520-ml聚丙烯酰胺葡聚糖S-200柱(4.4×100cm，Pharmacia)上。用相同的缓冲液进行洗脱来收集每个含有13.5ml洗出液的级分。测定各个级分的内型α-L-岩藻糖苷酶活性。
从而，获得了本发明的内型α-L-岩藻糖苷酶的纯化制品。测定了本发明的内型α-L-岩藻糖苷酶的分子量为大约32,000(分布状态20,000到40,000，根据在聚丙烯酰胺葡聚糖S-200上凝胶过滤洗脱中的位置)或42,000(分布状态30,000到50,000，根据其在电泳中的迁移率)。
纯化步骤总结于下面的表1。
表1

实施例2内型α-L-岩藻糖苷酶的制备(2)Fucoidanobacter marinus SI-0098如实施例所述的进行培养，从4.2L培养物获得大约6g湿细胞。
细胞悬浮于50ml含有50mM氯化钠的10mM磷酸钠缓冲液(PH7.5)中，通过超声处理进行裂解，并离心获得上清。上清用相同缓冲液进行充分透析，离心获得上清。
上清上样到用相同缓冲液平衡过的300-ml DEAE-CellulofineA-800柱上。用相同缓冲液洗涤后，用50到500mM的氯化钠梯度溶液进行洗脱来收集级分，每个级分含有25ml洗出液。测定各个级分的内型α-L-岩藻糖苷酶活性并收集具有活性的级分。
用含有100mM氯化钠的磷酸钠缓冲液(PH7.5)对活性级分进行充分透析以进行溶剂交换。酶溶液上样到用同样缓冲液平衡过的50-ml DEAE-Cellulofine A-800柱上。用相同的缓冲液洗涤后，用100到400mM的氯化钠梯度溶液进行洗脱来收集每个含有10ml洗出液的级分。测定各个级分的内型α-L-岩藻糖苷酶活性并收集具有活性的级分。
用含有50mM氯化钠的50mM磷酸钾缓冲液(PH7.5)对活性级分进行充分透析以进行溶剂交换。酶溶液上样到用相同缓冲液平衡过的20-ml羟磷灰石柱上。用相同的缓冲液洗涤后，用50到200mM的磷酸钾梯度溶液进行洗脱来收集每个含有10ml洗出液的级分。测定各个级分的内型α-L-岩藻糖苷酶活性并收集具有活性的级分。
活性级分上样到用含有100mM氯化钠和5mM叠氮钠的10mM咪唑-盐酸缓冲液平衡过的1520-ml聚丙烯酰胺葡聚糖S-200柱(4.4×100cm，Pharmacia)上。用相同的缓冲液洗涤后，收集每个含有13.5ml洗出液的级分。测定各个级分的内型α-L-岩藻糖苷酶活性。
从而，获得本发明的内型α-L-岩藻糖苷酶的纯化制品。
纯化步骤总结如下表2。
表2

对本发明的内型α-L-岩藻糖苷酶纯化制品的最适pH，温度和盐浓度进行了研究。结果分别如图1，2和3所示。
实施例3使用内型α-L-岩藻糖苷酶制备硫酸化脱氧半乳聚糖低聚糖如参考实施例2中所述的1.5g硫酸化脱氧半乳聚糖级分溶解于135ml含有250mM氯化钠的50mM咪唑-盐酸缓冲液(pH8.2)中。添加144mU(15ml)的本发明的内型α-L-岩藻糖苷酶到其中。混合物于30℃摇动培养4天。每份由50ml混合物组成的3等份于1100-ml Cellulofine GCL-1000(4×87cm，Seikagaku Corporation)上进行凝胶过滤从而进行分子量分馏。根据苯酚-硫酸法测定每个洗脱级分的总糖含量。作为结果，观察到了如图7所示的分布状态。图7中，纵轴表示根据苯酚-硫酸法基于显色观察到的在480nm处的吸收，横轴表示级分号。从而，在分子量大约为40,000的分布状态的级分nos.50-75周围洗脱到了本发明的硫酸化脱氧半乳聚糖低聚糖。分析低聚糖的糖组成以及还原末端的糖类。作为结果，发现基本上全部有岩藻糖。
本发明的具有不同分子量的硫酸化脱氧半乳聚糖低聚糖能通过使本发明的内型α-L-岩藻糖苷酶对源自海参的硫酸化脱氧半乳聚糖级分作用来制备。
实施例4硫酸化脱氧半乳聚糖硫酸酯酶当如实施例1或2所述制备的内型α-L-岩藻糖苷酶单独使用时，不可能把源自海参的硫酸化脱氧半乳聚糖转化成比实施例3所述的分子量分布状态更小的分子。然后，观察到与本发明的内型α-L-岩藻糖苷酶共同存在的级分能把源自海参的硫酸化脱氧半乳聚糖级分转化成较小的分子。结果，在实施例1中用大约600mM氯化钠从硫酸化Cellulofine柱洗脱的级分中发现了本发明的内型α-L-岩藻糖苷酶具有激活硫酸化脱氧半乳聚糖转化成较小分子的活性。然后，使级分对源自海参的硫酸化脱氧半乳聚糖作用，并对在反应混合物中产生的物质进行了检测。首先，根据参考实施例4中所述的方法使用HPLC分析了反应混合物，并观察到了硫酸的产生。接着，根据苯酚-硫酸法测定了在Cellulofine GCL-25柱(4×90cm)上通过反应混合物的凝胶过滤洗脱出来的每个级分的总糖量以检测是否产生了含有较小分子的糖的组分。结果，没有发现含有较小分子的糖的组分的产生。基于以上所述，强烈说明能通过本发明的内型α-L-岩藻糖苷酶激活硫酸化脱氧半乳聚糖转化成较小分子的酶为硫酸化脱氧半乳聚糖硫酸酯酶。然后，对根据参考实施例4中所述的方法测定了其活性的硫酸化脱氧半乳聚糖硫酸酯酶进行纯化。
特定的，收集实施例1中用大约600mM氯化钠从硫酸化Cellulofine洗脱出来的本发明硫酸化脱氧半乳聚糖硫酸酯酶的活性级分，并上样于用含有100mM氯化钠，5mM叠氮钠和5mMβ-巯基乙醇的10mM咪唑-盐酸缓冲液平衡过的1520-ml聚丙烯酰胺葡聚糖S-200柱上。用相同的缓冲液进行洗脱来收集级分，每个级分含有13.5ml洗出液。根据洗出液的位置，测定出本发明的硫酸化脱氧半乳聚糖硫酸酯酶的分子量为大约84,000(分布状态70,000到100,000)。
研究了本发明硫酸化脱氧半乳聚糖硫酸酯酶的纯化制品的最适pH，温度和盐浓度。结果分别如图4，5和6所示。
实施例5钠盐浓度的影响对本发明的内型α-L-岩藻糖苷酶或硫酸化脱氧半乳聚糖硫酸酯酶的相对活性与反应系统中所含的氯化钠的浓度之间的关系进行了研究。结果发现，本发明的内型α-L-岩藻糖苷酶和硫酸化脱氧半乳聚糖硫酸酯酶被氯化钠激活。
实施例6钙盐浓度的影响对本发明的硫酸化脱氧半乳聚糖硫酸酯酶的相对活性与反应系统中所含的氯化钙的浓度之间的关系进行了研究。结果发现，本发明的硫酸化脱氧半乳聚糖硫酸酯酶被氯化钙激活。发现使用醋酸钙有相似的激活。
实施例7使用内型α-L-岩藻糖苷酶和硫酸化脱氧半乳聚糖硫酸酯酶制备硫酸化脱氧半乳聚糖低聚糖150μl 50mM咪唑-盐酸缓冲液(pH7.0)，14μl 4M氯化钠，6μl 1M氯化钙和64μl水与30μl参考实施例2中所述的源自海参的硫酸化脱氧半乳聚糖级分的1％水溶液进行混合。添加424μU(16μ1)的本发明内型α-L-岩藻糖苷酶和226μU(20μl)的本发明硫酸化脱氧半乳聚糖硫酸酯酶到其中。混合物于30℃反应2天。根据参考实施例4所述的方法使用HPLC对100μl反应混合物进行分析。结果如图8所示。图8中，纵轴表示示差折光率的相对强度，横轴表示保留时间。产生的本发明的硫酸化脱氧半乳聚糖低聚糖分布于对应分子量为大约9,000的7到10分钟的位置。从而，可以获得明显比实施例3中所述的低聚糖小的低聚糖。对低聚糖进行糖组成和还原末端的糖类分析。结果，发现基本上全部有岩藻糖。
因此，本发明的具有不同分子量的硫酸化脱氧半乳聚糖低聚糖可以通过使本发明的内型α-L-岩藻糖苷酶和硫酸化脱氧半乳聚糖硫酸酯酶作用于源自海参的硫酸化脱氧半乳聚糖级分来制备。
工业实用性本发明提供了一种新的内型α-L-岩藻糖苷酶和一种新的硫酸化脱氧半乳聚糖硫酸酯酶，其能用于源自海参的硫酸化脱氧半乳聚糖的结构分析或来自源自海参的硫酸化脱氧半乳聚糖的较小分子的可重复制备。本发明还提供了制备该酶的方法。更进一步的，可使用该酶提供可用作糖工程的反应物的具有不同分子量的源自海参的硫酸化脱氧半乳聚糖低聚糖。此外，还提供了使该酶有效利用的添加剂。
序列表<110>TAKARA BIO INC.
<120>分解源自海参的硫酸化脱氧半乳聚糖的酶<130>663848<150>JP 2002-180490<151>2002-06-20<150>JP 2002-239843<151>2002-08-20<160>1<210>1<211>1521<212>DNA<213>Fucoidanobacter marinuw SI-0098<400>1agagtttgat cctggctcag aatgaacgct ggcggcgtgg ttcagacatg caagtcgaac 60gggattgtct agttagcttg ctaattagac atgagagtgg cgaacgggtg cgtaacacgt 120aaagaaccta cccttatgtg ggggatagct caccgaangg tgaattaata ccgcatgtgg 180tctctcttca catgaagagt acactnaagc tggggacctt cgggcctggc gcatagggag 240ggctttgcgg cctatcagct tgttggtgag gtaacggctc accaaggcaa agacnggtag 300ctggtctgag aagatgatca gccacactgg aacttagaca cggtccagac acctacgggt 360ggcagcagtt tcgaatcttt cacaatgggc gaaagcctga tggagcaacg ccgcgtgggg 420gatgaaggcc ttcgggttgt aaacccctgt caccaaggat aaaacgtaat ctattaatac 480taggttgcct gatgtaactt ggagaggaag gagtggctaa ctctgtgcca gcagccgcgg 540taatacagag actccaagcg ttattcggat tcactgggcg taaagggagc gcaggcggcc 600agatgtgtca gaggtgaaat accgcagctt aactgtagaa ctgcctttga aactatctgg 660ctagagtatc ggagaggtaa gcggaattcc aggtgtagca gtgaaatgcg tagatatctg 720gaggaacacc aatggcgaag gcagcttact ggacgattac tgacgctcag gctcgaaagc 780atggggagcg aaagggatta gatacccctg tagtccatgc cgtaaacgtt gttcactagg 840tatcgggaca ttcgaccgtc tcggtgctca agctaacgcg ataagtgaac cgcctgagga 900ctacggccgc aaggctaaaa ctcaaaggaa ttgacgggag cctgcacaag cggtggagca 960tgtggcttaa ttcgatgcaa cgcgaagaac cttacctagg cttgacatgc agtggaccgg 1020ggcagagatg ccctttctct tcggagccgc tgcacaggtg ctgcatggct gtcgtcagct 1080cgtgtcgtga gatgtttggt taagtccagc aacgagcgca acccctgcca ctagttgcca 1140gcattaagtt ggggactcta gtgggacaaa ctctctctga gagtgggaag gtggggacga 1200cgtcaagtca gtatggccct tacgtctagg gctgcacacg tgctacaatg cccggtacag 1260agggacgcga taccgcgagg tggagcaaat ccttaaagcc gggcccagtt cagattggag 1320
tctgcaactc gactccatga agttggaatc gctagtaatg gcgcatcagc tatggcgccg 1380tgaatacgtt cccaggcctt gtacacaccg cccgtcacgt tatggaagcc ggttttgccc 1440gaagtatgtt agctaacccg caagggaggc gatgtcctaa ggtgaggctg gtaactggaa 1500cgaagtcgta acaaggtagc c152权利要求
1.具有下述物理和化学特性的内型α-L-岩藻糖苷酶(I)作用于源自海参的硫酸化脱氧半乳聚糖从而水解α-L-岩藻糖基键并把硫酸化脱氧半乳聚糖转化成较小的分子；(II)最适pH为大约7到9；和(III)最适温度为大约25到45℃。
2.制备权利要求1所定义的内型α-L-岩藻糖苷酶的方法，该方法包括培养能制备权利要求1所定义的内型α-L-岩藻糖苷酶的Fucoidanobacter属细菌，并从培养物中收集酶。
3.一种具有下述物理和化学特性的硫酸化脱氧半乳聚糖硫酸酯酶(I)作用于源自海参的硫酸化脱氧半乳聚糖从而水解硫酸酯键，释放硫酸，并与用权利要求1所定义的内型α-L-岩藻糖苷酶单独作用所获得的转化相比，其促进在权利要求1所定义的内型α-L-岩藻糖苷酶的存在下源自海参的硫酸化脱氧半乳聚糖转化成较小的分子；(II)最适pH为大约6到8；和(III)最适温度为大约20到45℃。
4.一种制备权利要求3所定义的硫酸化脱氧半乳聚糖硫酸酯酶的方法，该方法包括培养能制备权利要求3所定义的硫酸化脱氧半乳聚糖硫酸酯酶的Fucoidanobacter属细菌，并从培养物中收集该酶。
5.一种制备硫酸化脱氧半乳聚糖低聚糖的方法，该方法包括使权利要求1所定义的内型α-L-岩藻糖苷酶对硫酸化脱氧半乳聚糖作用，并从反应中获得硫酸化脱氧半乳聚糖低聚糖。
6.根据权利要求5的方法，其中内型α-L-岩藻糖苷酶可以在氯化钠的存在下起作用。
7.硫酸化脱氧半乳聚糖低聚糖，其可通过权利要求5所定义的方法获得。
8.一种制备硫酸化脱氧半乳聚糖低聚糖的方法，该方法包括使权利要求1所定义的内型α-L-岩藻糖苷酶和权利要求3所定义的硫酸化脱氧半乳聚糖硫酸酯酶对硫酸化脱氧半乳聚糖作用，并从反应中获得硫酸化脱氧半乳聚糖低聚糖。
9.根据权利要求8的方法，其中内型α-L-岩藻糖苷酶和硫酸化脱氧半乳聚糖硫酸酯酶可以在氯化钠和/或钙离子的存在下起作用。
10.硫酸化脱氧半乳聚糖低聚糖，其可通过权利要求8所定义的方法获得。
全文摘要
能分解源自海参的硫酸化脱氧半乳聚糖的硫酸化脱氧半乳聚糖裂解酶；制备该酶的方法；通过使该酶对硫酸化脱氧半乳聚糖作用所获得的小分子化合物；制备该化合物的方法；和硫酸化脱氧半乳聚糖裂解酶的激活因子。
文档编号C12N9/88GK1662648SQ0381432
公开日2005年8月31日 申请日期2003年6月20日 优先权日2002年6月20日
发明者酒井武, 石塚久美子, 加藤郁之进 申请人:宝生物工程株式会社