专利名称：随机化的dna文库和双链rna文库,其用途及生产方法
技术领域：
本发明涉及以质粒或病毒载体为基础的DNA文库，它能够表达长度为10-30个碱基对双链RNA的所有可能序列，其中每条双链RNA由单个发夹式的RNA分子形成，或由两个分开的具有不同3’突出端的RNA分子所形成。这种DNA文库中的每个单独成员编码上面说明的双链RNA的所有组分。该文库可以在没有预先了解其靶基因的情况下，用于筛选能够诱导特定表型的双链RNA。本发明还涉及产生这种DNA文库的方法。
背景技术：
信使RNA(mRNA)通常被理解为蛋白合成中携带信息的中间体，它通过RNA聚合酶由DNA模板转录，随后通过核糖体翻译而产生蛋白分子。近来，更多的论据证明，很多基因转录为根本就不翻译成蛋白的RNA分子(Okazaki Y等，Nature；420(6915)563-573(2002))。人们发现，一些未翻译的RNA通过序列特异的方式诱导mRNA降解而实施其调节其mRNA的功能(Ambros V，Cell；113(6)673-676(2003))。该发现与最近的发现非常一致，即双链RNA和合成的siRNA也能在广泛的生物体中诱导同源mRNA的降解(McManus MT，Sharp PA.，Nature Rev Genet.；3(10)737-747(2002))。已发现，长的双链RNA对哺乳动物细胞中的RNA合成产生强的非特异性抑制，但siRNA能避开这种障碍而对与该siRNA序列具有序列同一性的靶基因，仍然保持其强的抑制效果(Elbashir SM等，Nature；411(6836)494-498(2001))。这样，使得siRNA成为功能基因组中基因敲毁的主要工具。siRNA还有可能通过降低与疾病相关基因的活性而成为可以治疗某种疾病的药物。
siRNA通常是19-25个碱基对的双链RNA，它由发夹形式的单个RNA分子形成，或者由两个分开的RNA分子形成并具有不同3’突出端。siRNA可由三种途径产生化学合成；在启动子的驱动下，由DNA载体表达；或用RNA酶III(Dicer)切割长的双链RNA。迄今为止，所有使用的siRNA都是以一段预定基因为靶而设计的。
发明内容
本发明涉及DNA文库，每个文库含有一定长度双链RNA的所有可能排列(排列是指不同的序列)。这种文库很容易构成，以用来产生所有排列的siRNA。该文库提供了一种以不依赖靶基因的方式，针对与任何特定表型有关的表征的高通量筛选双链RNA(以及siRNA)的方法。更具体地说，由这种文库编码的siRNA可以用于单个进行的筛选，或用于作为任何复杂程度的混合物进行的筛选，而不必要知道其序列或其靶基因。这种方法可以克服siRNA应用中的两个主要障碍(1)关于每种生物体的转录组的知识不完全。根据最近的小鼠转录组分析资料看，我们对这个认识最多的模式动物的转录组的知识仍远不完全。有关人和任何其他动物的转录组知道得就更少。因为应用我们的文库不需要预先知道任何关于靶序列的信息，这样就可以直接在任何生物体中完成全基因组的siRNA筛选。(2)siRNA的成本非常高。无论如何制备siRNA，要制备以某种生物体的所有已知mRNA为靶的siRNA，其费用是非常高的。实际上，包含能够应用于任何生物体的所有siRNA排列的可再生单个DNA文库可使生产siRNA的费用减少到最低的水平。
因此，本发明的一个方面涉及一种用于在活细胞中生产预定长度为10-30个碱基对的双链RNA分子文库的DNA文库，其中，在编码双链RNA分子的双链部分的DNA区序列中，随机化的位置选自4个至所有核苷酸，以及，此中所说的双链RNA分子的每条链由该DNA文库的单个成员产生。本发明还提供包含该DNA文库的试剂盒。
另一方面本发明提供一种制备该DNA文库的方法。
本发明还有一个方面涉及由该DNA文库获得的RNA文库。
根据以下的详细描述和附属的权利要求，在下文中，本发明的其他方面及优点会更清楚。
图1表示构建可编码所有排列的特定长度双链RNA的DNA文库的实施例。实施例1，可编码所有含有19个碱基对的双链体区和3’Poly U突出端的双链RNA的DNA文库。图1A表明克隆的技术方案。图1B表示该文库质量的实验证明。如琼脂糖凝胶中所示，单个克隆(1x)和10个克隆(10x)集合，以及30个克隆的集合在酶切后都产生预期的单一条带，表明文库中的大多数克隆含有预期的插入片段。同样的步骤可以用于产生编码不同长度(10-30个碱基对)双链RNA的此类DNA文库，以及产生只有部分DNA序列(4-30nt)随机化的此类DNA文库。
图2表示一种质粒的结构，用以证明存在于RNA编码区相对两侧的2个启动子和2个终止子可以对靶基因的表达给予有效的向下调节。根据目前已获得的所有科学知识，这种有效的向下调节只能通过由这种质粒有效地生产双链RNA而实现。因此，可以断定，这种质粒能够在活细胞中有效地生产双链RNA。A表明克隆的技术方案。B表示凝胶分析证明了设计的片段已插入该质粒。C说明细胞分析证明了所产生的质粒导致对靶基因海肾荧光素酶的有效抑制。
图3表示产生编码特定长度双链RNA所有排列的DNA文库的另一种方法实例。图A表明克隆的技术方案。图B表示图A中不同片段的序列，下划线为重要的限制酶位点。同样的步骤可以用于产生编码不同长度(10-30个碱基对)双链RNA的此类DNA文库，以及产生只有该DNA序列(4-30nt)部分随机化的此类DNA文库。
图4表示另一种产生编码所有排列的特定长度双链RNA的DNA文库的替代方法。A表明克隆的技术方案。B表示A中不同片段的序列，下划线为重要的限制酶位点。同样的步骤可以用于产生编码不同长度(10-30个碱基对)双链RNA的此类DNA文库，以及产生只有该DNA序列(4-30nt)部分随机化的此类DNA文库。
具体实施例方式
小片段干扰核酸(siRNA)最初是用来定义位于3’-UU或TT或其他单链突出端之间的，具有19-21nt双链区的短双链RNA的术语。近来，又引入了若干这种原始形式siRNA的变体(例如发夹型)。这种siRNA可以用于在各种不同生物体细胞中，减少与该siRNA双链区有相同序列的基因的表达。虽然较长的双链DNA和RNA也能用本发明的方法产生，但是本发明的文库限于长度为10-30个碱基对的双链DNA和RNA，因为长度超过30个碱基对的核苷酸，在其转染到活细胞中后，产生免疫应答和其他干扰的副作用的可能性增大。siRNA最初是用化学法合成的，但现已引入数种采用病毒启动子，如T7启动子，或微小RNA启动子，例如H1或U6，以游离的方式或在质粒或病毒载体中用酶法产生siRNA的方法。
本发明提供一种构建编码随机siRNA文库的DNA文库的方法。此类文库与现有技术的不同在于，在现有技术中，人们必须按照已知的基因序列来设计siRNA，而根据本发明的文库，可以对一组完全随机的不同siRNA进行筛选(不需要了解其序列或其靶基因的序列)，以寻找与每一siRNA相关的表型，然后再鉴定与每个siRNA有关的基因。
构建含有单个随机化区的DNA文库制备以质粒或病毒载体为基础、并编码所有排列的siRNA的完全随机化DNA文库，必需要确保DNA文库的每个成员表达一条独特、完整的双链RNA。现有的制备基于载体的siRNA(短的双链RNA)的方法中，没有一种能满足上述要求。
本发明描述了只有一个随机化区域的随机DNA文库的构建。对于每个质粒，2个启动子分别从相对的方向驱动该区域的转录，从而产生2条互补的RNA链。2个终止子置于随机化区域的每一端，以确保可以从每个方向产生限定长度的RNA。该方法的优点是避免了如以下所述的，在双区域系统中，为了在每个单独的质粒中产生2个反向的互补区所带来的麻烦的克隆步骤。可以用于这类系统的启动子的一个例子是RNA聚合酶III启动子H1或U6。RNA聚合酶III需要一段TTTTT才能进行正确的转录终止。为使用此RNA聚合酶从2个方向驱动同一区域的表达，必须将TTTTT插入随机化区的两端，不过有一个问题RNA聚合酶III启动子必须放在紧靠着随机化区域的位置，以确保从随机区域起始处的准确部位开始正确转录，但是这些启动子并不含有可以使相对的方向出现TTTTT终止子的AAAAA链段。唯一可采取的方法是使RNA聚合酶III启动子突变，插入AAAAA链段，但尚不知道该AAAAA链段的插入会如何影响转录的起始和转录的速率。如以下将要描述的，我们使RNA聚合酶III H1启动子突变，并在该启动子的末端插入AAAAA链段，结果证实了该突变的启动子可以正确启动转录和产生了有效的siRNA。因此，我们首先着手于构建将终止信号置于随机区域两侧的质粒库(图1)。
构建双H1启动子紧靠海肾荧光素酶的载体构建含有2个突变的RNA聚合酶III启动子的质粒，其中每个启动子插入另一启动子所需的转录终止子序列，siRNA区域以模式分子海肾荧光素酶为靶进行设计(图2)。这种质粒可以由单个19bp的靶序列成功地产生有效的siRNA双链体，这一个重要发现构成了构建仅有一个随机化区域的完全随机化的siRNA文库的基础(图2)。
RNA聚合酶III H1启动子的突变和样本质粒的构建详述如下。
1、删除pBluescript II KS-H1载体(Brummelkamp TR等，Science，296(5567)550-553(2002))中紧靠Bgl II位点上游的3个核苷酸用以下引物PCR扩增原载体中EcoR I-Bgl II(H1启动子)之间的片段5’引物GGAATTCGAACGCTGACGTCATCAACCCG3’引物GAAGATCTGTCTCATACAGAACTTATAAGATTCCC(突变按照下面所述插入AAAAA序列后，为了使转录由正确的位置开始，删去正好在Bgl II位点上游的3个核苷酸)将PCR产物中的EcoR I-Bgl II片段克隆到原pBluescript IIKS-H1(Brummelkamp TR等，上面提及的)载体中，通过序列测定验证该质粒DNA修饰后的序列001 TCCAGGNANC GCGGGCCCAG TGTCACTAGGCGGGAACACC CAGCGCGCGT051 GCGCCCTGGC AGGAAGATGG CTGTGAGGGACAGGGGAGTG GCGCCCTGCA101 ATATTTGCAT GTCGCTATGT GTTCTGGGAA ATCACCATAAACGTGAAATG151 TCTTTGGATT TGGGAATCTT ATAAGTTCTG TATGAGACAGATCTTCAATA
201 TTGGCCATTA GCCATATTAT TCATTGGTTA TATAGCATAAATCAATATTG251 GCTATTGGCC ATTGCATACG TTGTATCTAT ATCATAATATGTACATTTAT301 ATTGGCTCAT GTCCAATATG ACCGCCATGT TGGCATTGATTATTGACTAG351 TTATTAATAG TAATCAATTA CGGGGTCATT AGTTCATAGCCCATTATGGG401 AGTTCCGCGT TACATAACTT ACGGTAAATG GCCCGCCTGGCTGACCGCCC451 AACGACCCCC GCCCATTGAC GTCAATAATG ACGTATGTTCCCATAGTAAC2、构建含有突变的双H1启动子的载体(以下称为pDH，代表含有双H1启动子的质粒)用以下引物PCR扩增上述修饰的载体中的EcoR I-Bgl II片段5’引物ACGCGTCGACGAATTCGAACGCTGACGTCATCAACCCG3’引物CCCAAGCTTGTCTCATACAGAACTTATAAGATTCCC将上述PCR产物的Sal I-Hind III片段反向克隆到上述修饰的载体中，用Bgl II+Sal I消化，检验该质粒DNA，正确的克隆应含有~1000bp的片段。结果表明，所有检查的10个克隆都是正确的(注意pDH实际上含有2个截短的H1启动子，这是因为随后克隆过程的需要。该启动子的缺失部分会在随后的克隆过程中补回)。
3、将海肾荧光素酶靶序列放入pDH，构成pDHRL相应于海肾荧光素酶的mRNA nt82-100的序列用作测试DNA。以海肾荧光酶素该位点为目标的siRNA即鉴别为有活性(Brummelkamp TR等，上面提及的)。合成2个寡聚DNA并相互退火，制备双链DNA5’GGGGAAGATCTAAAAAAATAAATGAATCAAGAACATTTTTAAGCTTGGGG5’CCCCAAGCTTAAAAATGTTCTTGATTCATTTATTTTTTTAGATCTTCCCC上述的双链DNA用Bgl II-Hind III酶切，然后克隆到pDH的BglII-Hind III位点之间。用Bgl II+SaI消化以检验DNA片段在质粒中的正确插入，正确的克隆应产生~250bp的片段。所有测试的3个克隆都表明具有正确的插入(图2)。
pDHRL对荧光素酶表达的有效抑制。取上述的3个克隆克隆1，克隆2和克隆3，各按1.2μg和0.6μg的量，分别与海肾荧光素酶质粒和编码虫荧光素酶的质粒一起，在24孔板上转染HEK293细胞。48小时后，测定海肾荧光素酶和萤火虫荧光素酶的活性。(图2C)。结果表明，采用突变的启动子，该质粒能够对靶基因海肾荧光素酶的表达产生非常有效的抑制，这表明了在本发明构建的双启动子/双终止子质粒中，采用突变的H1启动子，有效地产生了siRNA。该结果尤其表明，使用突变的H1启动子，由RNA聚合酶III驱动的RNA转录可以正确地起始和终止，而导致有效地产生正确长度的双链体RNA，该RNA能有效导致RNA干扰和基因表达的抑制。
将随机化的DNA克隆到pDH中，构成编码所有排列的siRNA的文库采用类似于在pDHRL构建中，构建编码抗荧光素酶的siRNA的质粒的方法，构建编码所有siRNA排列的随机化DNA文库，其唯一的不同在于测试序列的第二条链采用酶法产生，以保持该序列的随机化性质。
合成在两个已知序列中插入具有19、20和21nt的随机化区域的三种寡核苷酸。
19聚体随机化区域GGGGAAGATCTAAAAA NNNNNNNNNNNNNNNNNNN TTTTTAAGCTTGGGG20聚体随机化区域GGGGAAGATCTAAAAA NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN TTTTTAAGCTTGGGG21聚体随机化区域GGGGAAGATCTAAAAA NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN TTTTTAAGCTTGGGG使上述寡核苷酸与引物CCCCAAGCTTAAAAA退火，并在1mM浓度的dNTP存在下，在合适的缓冲液中用Klenow片段补平(除非另有说明，除了DNA寡核苷酸之外，所有化学试剂均购自New EnglandBiolabs Inc)。用Bgl II-Hind III酶切所得的双链寡聚体，然后克隆到pDH的Bgl II-Hind III位点，构成pDH-文库A。
pDH-文库A的质量首先用41个克隆的克隆长度分析进行估价，用单个克隆、10个克隆的集合和30个克隆的集合制备质粒DNA，然后用限制酶切割。该结果表明所有的克隆都含有同样长度的插入(图1B)。将上述的10个克隆分别制备质粒DNA并测定序列。如所预期的一样，所有测序的克隆含有预期的19个碱基对。
这些克隆的序列也表现出预期的随机性(参见以下的序列)。
AAAGGGTTTACGTGGTTGGAATCGTCTTATTTGCATGCAATTGACATGTGAGCTTGGAGTAGCTTGTTGAGGTTGGCAGCATCACTGTATGTGTCCTATCTTCGTGGAGGTTGGCTATGAAGGTGGTGATGCGCTTAATTGGTGGTGGTAGGTGGCTGTATGTGAGTGGCTTTAATCTCTGGTGTCCTAATTGTAGGGACTTGGATGAT代替供外源基因异位表达的质粒载体的另一种载体是各种类型的病毒载体。因为用于构建病毒载体的所有克隆技术都是公知的，具有本领域适当知识的任何人都能制备可以实现类似于质粒的表达功能的病毒结构体，上述制备DNA文库的公开也使得在病毒载体中产生此类DNA文库得以实现。
构建含有一对序列方向相反的随机化区域的DNA文库虽然pDHRL和pDH文库A所代表的具有2个启动子和2个终止子的载体是本发明的优选模式，但是一旦在此公开了编码所有排列的siRNA的DNA文库的概念后，其他构建编码所有排列的siRNA的DNA文库的方法就变得显而易见了。这些方法之一是构成编码所有排列的发夹形式的该siRNA的质粒文库。作为实施例，这样的文库可按照以下步骤构成。
1、合成文库的寡核苷酸，使其包含一19nt随机化序列的完全随机化区域，这些19nt随机化序列位于2个5’端磷酸化的预定序列(P1和P2)之间。合成形成发夹的寡核苷酸，使其含有5’端磷酸化和3’突出端并含有P1区互补序列的链段。使文库核苷酸和发夹DNA退火并用T4DNA连接酶连接，然后用Klenow片段补平(图3)。
2、将上述的延伸混合物纯化后，用BamH 1酶切并连接到双链受体中，该受体的一端为粘末端，其3’突出端则作为进一步引发合成的位点(P3)。连接后，对该DNA通过分子大小选择，只收集含有文库寡核苷酸和发夹寡核苷酸，以及受体接头的全长片段。
3、使纯化的全长片段与引物3(引物3与P3引发合成位点互补)退火，并用链置换DNA聚合酶phage29 DNA聚合酶推动DNA片段ALPHA的合成。每个ALPHA DNA片段含有在序列两端完全双链的受体接头，以相反方向排列的两个相同的随机化序列拷贝，该两个拷贝通过双链形式的线性化发夹接头序列连接。
4、对DNA片段ALPHA在其受体接头区的适当位置进行切割，再连接到质粒中，供进一步操作(α质粒)。
5、α质粒先用Sam I和Bpm I酶切，然后用Klenow补平并连接。产生的质粒在大肠杆菌中增殖，然后用Bcg I酶切插入片段，以除去两个随机化区之间的多余序列，留下9nt的链段(TTCAAGAGA)在以后siRNA发夹中形成环状结构(图4)。
6、随后，可用Hind III和Bgl II将质粒中的该插入片段全部切下，插入pBluescript-H1载体中，构成文库。此文库编码所有排列的发夹形式siRNA。在这种情况下，该质粒质只需要1个启动子和1个终止子用于在细胞中形成发夹RNA。
如图4所说明的，上述克隆方案稍加修饰可以产生有2个野生型H1启动子和2个转录终止子的DNA文库，其中该文库的每个成员编码双链RNA的2条分开的链。如图4所说明，该修饰包括第2个启动子和TTTTT终止子在该DNA文库的2个反向的随机化区之间的插入。根据以上所述及图1-3的详细公开，对于本领域的技术人员来说，这种取代的方案是显而易见的。
必须强调，由于该文库采用酶操作，所以丢失了所有含有该限制酶位点的siRNA。每用一种限制性酶将导致约0.025％siRNA的丢失。因此，从这意义上来看，本发明优选的基于2个启动子和2个终止子的模式与根据上述发夹文库方案所产生的文库相比，其丢失的siRNA较少，因而是更完全的文库，这是由于在两种方案中所用酶的数目不同的缘故。因为在理论上，文库含有约2.75×1011种排列，因使用限制性酶而造成丢失的siRNA种类对于文库的质量以及对于抗任何特定基因的活性siRNA的筛选仅产生可忽略的影响。在本发明的正文中，所提及的“所有排列的siRNA”应理解为已考虑到并包括了这种影响。通过在构建文库中去除限制酶的使用，可以进一步消除该影响。
另一要注意的方面是序列和限制酶只是用于质粒构建的一组实例。本领域的技术人员很容易选择不同的限制酶和相应的寡核苷酸序列，按照上述公开的原理，以类似的方式在质粒和病毒载体中进行构建。
产生编码细胞特异、组织特异或种特异的双链RNA的DNA文库根据公开的编码一特定长度的所有排列的双链RNA的随机DNA文库，建立编码细胞特异、组织特异或种特异的双链RNA的DNA文库的方法，对于本领域的技术人员来说是显而易见的。一个构建这种DNA文库的例子陈述如下。
使含有19nt随机区的寡核苷酸与由特定类型细胞纯化的mRNA杂交。该mRNA可以通过用Poly(A)聚合酶添加在其末端的生物素固定在涂布链霉抗生物蛋白的固体载体(如塑料珠)上。mRNA的固定化也可以用其他方法进行。杂交后，洗去所有未结合的DNA寡核苷酸，收集结合的DNA亚随机寡核苷酸，并以所述用于完全随机的DNA寡核苷酸的相同方案，将其克隆到载体中。由此制备方法产生的文库将会高度富集编码与来源mRNA序列相同的双链RNA的分子。应该特别提到，虽然在这里的上下文中，所有的克隆步骤都以1种质粒载体来描述，但其原理应该可应用于所有类型的质粒，而且含有突变的启动子、终止子和该DNA文库编码区的表达盒可以在这些不同类型的质粒间转移。
还应特别指出，虽然在上下文中所有的克隆步骤都以1种类型的启动子即H1启动子描述，但其原理应该可应用于所有类型的RNA聚合酶III型的启动子。
一种取代质粒载体用作外源基因异位表达的载体是各种类型的病毒载体。因为所有用于构建病毒载体的克隆技术都是公知的知识，而且具有本领域相当知识的任何人都能够制备出可以实现类似于质粒的表达功能的病毒结构体，上述制备DNA文库的公开，也使得在病毒载体中产生这类DNA文库能够实现。
总结本发明涉及DNA文库，它可产生长度为10-30个碱基对的双链RNA，该双链RNA中的至少一条链含有单链突出端，本发明还涉及生产这种DNA文库的方法。长度为19-21个碱基对的siRNA被公认为最常用的双链RNA，通常在其至少一条链上有TT或UU突出端。因而，在此对本发明的优点通过与其他方法产生的siRNA作比较来进行讨论。
实际上，只有1/3至1/5左右的短双链RNA满足基本的结构要求(19-21个碱基对的双链区，3’单链突出，(通常为TT，或UU，但不限于这种突出))。对于用siRNA敲毁30000个人类基因，必须要合成90,000-150,000个siRNA，费用为1800-3000万美元。对于其他生物体，要产生针对其所有基因的siRNA，也必须拨给同样数量的费用。
本发明可产生一种在质粒中编码的siRNA文库，该文库理论上含有所有排列(419＝2.75×1011)的siRNA(19个碱基对的双链加上突出端)(其他长度的双链RNA文库的大小用类似的方法很容易计算)，并可用于能找到其合适的启动子的任何生物体。产生这种文库的费用仅是化学合成所有siRNA的费用的一小部分。换句话说，这是一个复杂程度为2.75×1011的文库，它含有能使哺乳动物和非哺乳动物系统的任何基因沉默的反应物。对于高产量基因组范围的功能基因组学和药物靶筛选，以及核酸药物的开发来说，这种文库是很有用的工具箱。
通过对文库寡核苷酸进行一步寡核苷酸选择，这种文库的复杂程度可进一步显著降低。这种方法导致产生复杂性非常低(102-108)的编码对基因、细胞/组织、或生物体特异的siRNA文库，而不会损失该文库的实用性。这种低复杂程度的文库可以采用不同的序列测定方法，测定其部分或全部序列，并能够实现产生含有已知的针对某生物体，例如人、小鼠、或大鼠的每个基因的siRNA编码物质的质粒集合物。
以上的描述大多是基于质粒系统，但利用同样的原理，很容易在病毒载体中建立同样的文库和集合物。
本发明的一些重要类别的应用在此列出，作为例子(1)由此文库通过标准的筛选(可以是自动化的)，可以选择用于任何特定基因的siRNA编码质粒的完全集合物。
(2)根据本发明，可以选择用于任何特定细胞类型、组织和生物体的siRNA编码质粒的完全集合物。
(3)然后，对此类编码siRNA的质粒的完全集合物，很容易评价其各自的敲毁基因表达的能力。
(4)最重要的是，此类DNA文库可以在没有预先了解该靶基因的序列或其siRNA的序列的情况下，用于基于表型的靶基因筛选，因此，技术员可以避开预选择靶基因的弯路。这种方法将会成为功能注解和药物靶筛选最有价值的方法。
权利要求
1.一种用于在活性细胞中产生预定长度为10-30个碱基对的双链RNA分子文库的DNA文库，其中编码双链RNA分子的双链部分的DNA区的序列在所有的核苷酸位置上随机化，以及其中所说的双链RNA分子的两条链都由该DNA文库的单个成员产生。
2.一种用于在活性细胞中产生预定长度为19-30个碱基对的双链RNA分子文库的DNA文库，其中编码双链RNA分子双链部分的DNA区的序列在至少19个核苷酸位置上随机化，以及其中所说的双链RNA分子的两条链都由该DNA文库的单个成员产生。
3.一种用于在活性细胞中产生预定长度为15-30个碱基对的双链RNA分子文库的DNA文库，其中编码双链RNA分子双链部分的DNA区的序列至少在15个核苷酸位置上随机化，以及其中所说的双链RNA分子的两条链都由该DNA文库的单个成员产生。
4.一种用于在活性细胞中产生预定长度为10-30个碱基对的双链RNA分子文库的DNA文库，其中编码双链RNA分子的双链部分的DNA区的序列在至少4、7、10个核苷酸位置上随机化，以及其中所说的双链RNA分子的两条链都由该DNA文库的单个成员产生。
5.一种用于在活性细胞中产生预定长度为10-30个碱基对的双链RNA分子文库的DNA文库，其中编码双链RNA分子双链部分的DNA区的序列在4至所有的核苷酸位置上随机化，以及其中所说的双链RNA分子的两条链都由该DNA文库的单个成员产生。
6.根据权利要求1-5中任何一项所述的DNA文库，其中所说的双链RNA分子在其一端或两端还含有单链区。
7.根据权利要求1-6中任何一项所述的DNA文库，其中该DNA文库的每个成员含有一个用于转录双链RNA分子的启动子和一个用于转录双链RNA分子的终止子，以及其中所形成的双链RNA为发夹形的双链分子。
8.根据权利要求1-6中任何一项所述的DNA文库，其中该DNA文库的每个成员含有至少两个用于转录双链RNA分子组分的启动子和两个用于转录双链RNA分子组分的终止子，以及其中该双链RNA由双链区的2个分开的并相互互补的RNA分子形成。
9.根据权利要求1-8所述的DNA文库，其中该DNA文库构建在质粒载体中。
10.根据权利要求1-8所述的DNA文库，其中该DNA文库构建在病毒载体中。
11.根据权利要求1-10所述的DNA文库，其中该DNA文库的随机性可通过选择随机的DNA寡核苷酸，然后将所说的随机的DNA寡核苷酸克隆到载体中的方法修饰，即将随机的DNA寡核苷酸与从某个来源的总RNA制备物或总mRNA制备物杂交，随后只将可与此总RNA制备物或总mRNA制备物杂交的寡核苷酸克隆到载体中，其中该RNA来源可以是细胞、细胞系、组织或生物体。
12.含有根据权利要求1-11中任何一项所述的DNA文库的试剂盒。
13.一种构建根据权利要求1-6和8-11中任何一项所述的DNA文库的方法，其中一对突变的H1启动子以相反的方向放置，用以推动插入该两个启动子之间的DNA片段的RNA表达，其中所说的突变的H1启动子在紧靠转录起始点之前至少5个核苷酸区的序列与野生型的H1启动子的不同，所说的突变的H1启动子的5个核苷酸区为AAAAA。
14.由根据权利要求1-12中任何一项所述的DNA文库得到的RNA文库，其中所产生的双链RNA的长度在10-30个核苷酸的范围。
15.一种使用根据权利要求1-12中任何一项所述的DNA文库的方法，其中该文库作为一种混合物暂时或永久地导入细胞中。
16.一种利用根据权利要求1-12所述的DNA文库筛选具有生物功能的双链RNA的方法。
17.一种使用根据权利要求1-12所述的DNA文库筛选新基因的方法。
18.根据权利要求15-17中任何一项所述的方法获得的新基因。
19.根据权利要求15-17中任何一项所述的方法获得的基因的新功能。
20.根据权利要求15-17中任何一项所述的方法获得的药物组合物。
全文摘要
本发明涉及以质粒或病毒载体为基础的DNA文库，它能够表达长度为10－30个碱基对的所有可能序列的双链RNA，其中每条双链RNA由单个发夹式的RNA分子形成，或由两个分开的具有不同3’突出端的RNA分子所形成。这种DNA文库中的每个单独成员编码上面说明的双链RNA的所有组分。该文库可以在没有预先了解其靶基因的情况下，用于筛选能够诱导特定表型的双链RNA。本发明还涉及产生这种DNA文库的方法。
文档编号C12N15/11GK1662652SQ03814361
公开日2005年8月31日 申请日期2003年6月23日 优先权日2002年6月21日
发明者梁子才, 张宏彦, 陈梅红, 沈岩 申请人:北京诺塞基因组研究中心有限公司