专利名称：一个与精神分裂症密切相关联的易感基因位点的制作方法
技术领域：
本发明涉及一个与精神分裂症有显著关联的易感基因位点。
背景技术：
精神分裂症是最严重的精神疾病之一。在我国，精神分裂症的终身患病率高达0.7％。这样大的患病群体，不仅给家庭和社会带来沉重的经济负担，而且还严重威胁社会的安全与稳定。因此，确定精神分裂症的病因，建立有效地防治方法，已成为医学界乃至整个社会需迫切解决的问题。精神分裂症与遗传因素有密切关系，且归类于多基因遗传病。人类基因组系统扫描发现，除19号、21号和Y染色体外，其余染色体上都可能含有精神分裂症易感基因。利用连锁和关联方法定位精神分裂症的易感基因已成为分子遗传学研究的热点。Pulver等最早报道22q区域可能存在精神分裂症易感基因(Pulver AE，et al.Am J MedGenet，1994，5436-43)。腭-心-面综合征(velo-cardio-facial syndrome，VCFS)也使研究者们注意到第22号染色体与精神疾病的联系(Pulver AE，et al.J Nerv MentDis，1994，182476-478)。但至今在该染色体区域内未发现确定特异的与精神分裂症有关的易感基因。
发明内容
本发明的目的之一是在第22号染色体区域内揭示与精神分裂症密切相关联的易感基因位点；目的之二是通过该易感基因位点遗传特性提出一种判定精神分裂症的易感人群的方法，以利于指导精神分裂症的预防和治疗。
本研究结果表明UFD1L/CDC45L是精神分裂症的易感基因位点。是含有三个单核苷酸多态性的序列长度为69987bp的UFD1L/CDC45L位点，由于该位点的单核苷酸多态性rs1547931碱基C突变为G，从而与精神分裂症的易感性相关联。UFD1L/CDC45L位点位于22q11.2染色体区域，编码泛有素融合降解1型蛋白和细胞周期启动蛋白。泛有素融合降解1型蛋白在胎儿期及产后期大量表达，原位杂交表明其在鼠脑内表达，并与能形成海马的内侧终脑有显著亲和性，泛有素融合降解1型蛋白通常在神经嵴细胞中表达，这些神经嵴细胞可形成心脏、支气管弓、咽囊、腭面骨、胸腺和甲状旁腺。细胞周期启动蛋白在真核细胞中启动DNA的复制。
本发明在22q11区通过连锁不平衡分析方法进行单个核苷酸多态性(SNPs)连锁不平衡制图分析，通过NCBI(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/mapviewer)数据库，获得22q11内所有侯选基因，并获得UFD1L/CDC45L位点序列。通过http//www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP及http//snp.cshl.org/数据库，在UFD1L/CDC45L位点上选择含有限制性酶切位点的单核苷酸多态性rs1547931、rs2238769和rs2073732。下列所示为这三个单核苷酸多态性的核苷酸序列。三个加黑部分分别为引物序列，三个方框内是发生互换的碱基，划线处则分别是PstI和RsaI限制性内切酶识别的酶切位点，箭头所示内切酶的切割部位。具体信息如下。
SNP1rs2238769，Gene bank accession numberAC000087，Base changeC/G8161 acttgagggt gaaagggtga ggctatctag gttcacctcg cttggtcaaa cagctttcca8221 gaaccagagc aactttgtga aaagcgcctt atgtggtgga tgctttcttt gctcccaaat 8341 tcttctctga cttccactgc agcagctgga ggagcagagc cagagccctc aggctgagaa8401 cacgaggcct ctgcaggcag ggcgggctcc ccatatggcc tctgcgtact ctggcacctgSNP2rs1547931，Gene bank accession numberAC000087，Base changeC/G15121 tgagagtagc atggaggtac agtaagggtg ggcactccct cctatcacca agggtgactc 15241 atggagctga catacagctg gtccacagta aactggactg ggctcagcca agggtctgag15301 attgttgcaa gtgaaagaga ctccaatgtc cctcagtcca ctgactctca aactgcattt15361 tgtgacttag aggctcccag tgccctgggg ctcccagtcc ctctgtaccc cctcactttcSNP3rs2073732，Gene bank accession numberAC000088，Base changeC/T21061 catgtcttgt gtgtcagcag cttttttggg agggcgtttg agaaggcagc ggaaagcacc21121 agctcccgga tgctgcacaa ccattttgac ctctcaggtg agagtctcct gccactctgc 21241 tggctggagg agcctggcca gcagccctct tgaccttcca gatctggccc tgggacaggc21301 tactcctggt ggctcaggga gctctggtga acctcaggcc cctgagaggg aaaaagtgtt以中国东北地区226个汉族精神分裂症患者和他们健康父母双亲组成的核心家系(Trios)为研究对象。患者均于2000-2002年间入院，按国际疾病分类标准第10版(ICD-10)被诊断为精神分裂症。这种基于家系的研究，系以父母双亲传递给患病子女的等位基因为“病例”，以未传递的等位基因为“对照”。因病例与对照等位基因均来自同样的基因池，可避免人群层化问题。
家系成员均由外周静脉抽取抗凝血5ml，用星普液体微量DNA提取试剂盒(宁波)提取基因组DNA。步骤如下①取血样100μl，加入到1.5ml离心管中，然后加入100ul的1×TE缓冲液，摇匀；②一边振荡，一边加入200μl的B1试剂，充分混匀；③在振荡中加入200μl的B2试剂，充分混匀；④将混合溶液移入旋转离心柱中离心(14000rpm，分钟)；⑤向旋转离心柱中加入400μl的B3试剂后离心(14000rpm，1分钟)；⑥重复上述步骤；⑦空柱离心(14000rpm，2分钟)，将旋转离心柱移入干净的1.5ml离心管中，加入100μl的B4试剂离心(14000rpm，1分钟)；此时离心管中的溶液体积为100μl，含有已经提取的基因组DNA。使用美国BECKMAN公司生产的型号为Du640紫外分光光度仪，分别取波长260nm、280nm两个波段，测得其相应DNA的OD260nm及OD280nm值，然后再通过公式，计算出DNA含量，公式为DNA含量＝50mg/ml×OD260nm×稀释倍数，另外通过公式计算出DNA纯度，公式为DNA纯度＝OD260nm/OD280nm。
依据相应的碱基序列合成三对引物。rs2238769为TATCTAGGTTCACCTCGCTTGG和TCGTGTTCTCAGCCTGAGGG。rs1547931为GAGGTACAGTAAGGGTGGGC和GCACTGGGAGCCTCTAAGTC。rs2073732为AAGGCAGCGGAAAGCACCAG和GTTCACCAGAGCTCCCTGAG。PCR反应体系为20μl，其中含10mM Tris-HCl(pH8.3)，50mM KCl，1.5mM MgCl2，0.001％(w/v)gelatin，200μM of each dNTP，上下游引物各0.4μM，Taq DNA聚合酶(Promega)1.0U，DNA模板30-50ng。PCR扩增条件为①94℃ 5min②96℃ 30s，62℃ 60s，72℃ 35s 2个循环；③95℃ 30s，60℃ 60s，72℃ 35s 6个循环；④94℃ 55s，56℃～58℃ 60s，72℃ 35s 28个循环；⑤72℃ 10min。取PCR产物5μl用1.5％琼脂糖凝胶电泳，以DNA marker DL2000为分子量标准品。所扩增的片段长度分别为222bp(8184～8405)、250bp(15134～15381)和230bp(21103～21332)。
在PCR扩增后的反应体系中，加入适量相对应的限制性内切酶及其酶切缓冲液，置37℃温箱5小时。经2.5％琼脂糖凝胶电泳，根据酶切图谱判断基因型。存在3种基因型，其中有完全切开的纯合基因型，未切开的纯合基因型，既有切开又有未切开的杂合基因型。
建立Pedigree和SPSS SNP基因分型数据库(参见表1和表2)，应用拟合优度卡方检验和传递不平衡检验，应用UNPHASED分析软件进行单倍体传递卡方检验，利用SPSS软件管理数据。
表1 Pedigree数据库格式Number 病人 父亲 母亲 性别 状态 PstI RsaIABC41 2 312 1/12/2ABC42 0 011 1/22/2ABC43 0 021 1/11/2ABC91 2 322 1/11/2ABC92 0 011 1/21/2ABC93 0 021 1/11/2ABC11 1 2 322 1/22/2ABC11 2 0 011 2/22/2ABC11 3 0 021 1/12/2
表2 SPSS数据库格式 传递不平衡检验(Transmitted disequilibrium test，TDT)显示在所有被检测的SNPs当中，只有rs1547931与精神分裂症显著关联(x2＝11.072，P＝0.001)。在226个家系452个父母中，167个为杂合子，而这些杂合父母分别将62个C等位基因和105个G等位基因传递给患病子女(见表3)。由于G等位基因传递过多，说明含G等位基因的单倍体或染色体可能携带决定精神分裂症易感性的突变位点。
表3 UFD1L/CDC45L位点与精神分裂症的关系等位基因 传递等位基因限制性SNPs主等位 次等位主等位次等位P内切酶基因基因 基因 基因Rs2238769 RsaIC G 108 870.133Rs1547931 PstIG C 105 620.001Rs2073732 PstIC T 107 850.112单倍体传递卡方检验(Haplotype transmission chi-square test)显示有两种单倍体系统与精神分裂症密切相关联，它们分别是rs2238769-rs1547931和rs1547931-rs2073732单倍体系统(见表4)。单倍体可以是一条染色体或一段染色体。故此结果进一步说明UFD1L/CDC45L位点rs2238769和rs2073732之间的染色体区域存在决定精神分裂症易感性的突变位点。
表4 单倍体传递卡方检验结果单倍体 x2dfPRs2238769-rs1547931 19.8 30.00018Rs1547931-rs2073732 23.0 30.00004
根据本发明由UFD1L/CDC45L基因位点碱基突变特性判定精神分裂症的易感人群的方法，可对未表现精神分裂症临床症状的人群进行如下所示方法的筛查，rs1547931碱基为G的个体为精神分裂症的易感人群。rs1547931碱基为C的个体不易发生精神分裂症。对精神分裂症易感人群在日常生活中应尽量减少诱发因素，如环境因素的刺激，可降低精神分裂症的发病率。这是本发明的一个重要用途。
根据本发明，对精神分裂症的患者可采用如基因敲除等基因工程方法针对性进行基因治疗。另外，疾病基因的存在有可能导致蛋白质产物结构与功能的缺损或改变，阻碍或干扰特定生化通路中生物大分子的相互作用。正因为UFD1L/CDC45L位点的碱基突变，可能造成蛋白质表达及功能异常。本发明为进一步检测蛋白功能，开发新型治疗药物，开展基于遗传学背景的个体化药物治疗奠定了十分重要的基础，并将带来十分可观的社会与经济效益。
具体实施例方式
通过提取受试者基因组DNA进行单核苷酸多态性rs1547931的基因型分析，其rs1547931碱基为G的个体为精神分裂症的易感人群。
1.基因组DNA提取受试者均由外周静脉抽取抗凝血5ml，用星普液体微量DNA提取试剂盒(宁波)提取基因组DNA。步骤如下①取血样100μl，加入到1.5ml离心管中，然后加入100ul的1×TE缓冲液，摇匀；②一边振荡，一边加入200μl的B1试剂，充分混匀；③在振荡中加入200μl的B2试剂，充分混匀；④将混合溶液移入旋转离心柱中离心(14000rpm，分钟)；⑤向旋转离心柱中加入400μl的B3试剂后离心(14000rpm，1分钟)；⑥重复上述步骤；⑦空柱离心(14000rpm，2分钟)，将旋转离心柱移入干净的1.5ml离心管中，加入100μl的B4试剂离心(14000rpm，1分钟)；此时离心管中的溶液体积为100μl，含有已经提取的基因组DNA。使用美国BECKMAN公司生产的型号为Du640紫外分光光度仪，分别取波长260nm、280nm两个波段，测得其相应DNA的OD260nm及OD280nm值，然后再通过公式，计算出DNA含量，公式为DNA含量＝50mg/ml×OD260nm×稀释倍数，另外通过公式计算出DNA纯度，公式为DNA纯度＝OD260nm/OD280nm。
2.PCR扩增目的片段应用以下引物序列GAGGTACAGTAAGGGTGGGC和GCACTGGGAGCCTCTAAGTC进行PCR扩增。PCR反应体系为20μl，其中含10mM Tris-HCl(pH8.3)，50mM KCl，1.5mM MgCl2，0.001％(w/v)gelatin，200μM of dNTP，上下游引物各0.4μM，Taq DNA聚合酶(Promega)1.0U，DNA模板30-50ng。PCR扩增条件为①94℃ 5min②96℃ 30s，62℃ 60s，72℃ 35s 2个循环；③95℃ 30s，60℃ 60s，72℃ 35s 6个循环；④94℃ 55s，56℃～58℃ 60s，72℃ 35s 28个循环；⑤72℃ 10min。取PCR产物5μl用1.5％琼脂糖凝胶电泳，以DNA marker DL2000为分子量标准品。所扩增的片段长度为250bp(15134～15381)
3.限制性内切酶酶切鉴定基因型酶切的反应体系为20μl，其中，10μl PCR产物，限制性内切酶PstI 0.8μl，酶切缓冲液2μl，BSA 0.2μl。置37℃温箱5小时。经2.5％琼脂糖凝胶电泳，根据酶切图谱判断基因型。存在3种基因型，其中有完全切开的纯合基因型(G/G)，未切开的纯合基因型(C/C)，既有切开又有未切开的杂合基因型(C/G)。
4.结果判定rs1547931碱基为G的个体为精神分裂症的易感人群。rs1547931碱基为C的个体不易发生精神分裂症。
权利要求
1.一个与精神分裂症密切相关联的易感基因位点，是含有三个单核苷酸多态性的序列长度为69987bp的UFD1L/CDC45L位点，由于该位点的单核苷酸多态性rs1547931碱基C突变为G，从而与精神分裂症的易感性相关联。
2.一种根据权利要求1所述的UFD1L/CDC45L基因位点碱基突变特性判定精神分裂症的易感人群的方法，其特征是通过提取受试者基因组DNA进行单核苷酸多态性rs1547931的基因型分析，其rs1547931碱基为G的个体为精神分裂症的易感人群，具体作法是(1)基因组DNA提取，用微量DNA提取试剂盒提取基因组DNA，(2)PCR扩增目的片段，引物序列为GAGGTACAGTAAGGGTGGGC和GCACTGGGAGCCTCTAAGTC，(3)限制性内切酶酶切鉴定基因型，酶切的反应体系为20μl，其中，10μl PCR产物，限制性内切酶PstI 0.8μl，酶切缓冲液2μl，BSA 0.2μl，置37℃温箱5小时，经2.5％琼脂糖凝胶电泳，根据酶切图谱判断基因型，(4)结果判定，rs1547931碱基为G的个体为精神分裂症的易感人群，rs1547931碱基为C的个体不易发生精神分裂症。
全文摘要
本发明提供一个与精神分裂症的发生密切相关的易感基因位点，即含有三个单核苷酸多态性的序列长度为69987bp的UFD1L/CDC45L位点。由于该位点的单核苷酸多态性rs1547931碱基C突变为G，从而与精神分裂症的易感性相关联。rs1547931碱基为G的个体为精神分裂症的易感人群。UFD1L/CDC45L位点及其编码蛋白对阐明精神分裂症遗传学机制及建立基因诊断方法，指导精神分裂症预防、开发新型治疗药物具有重要作用。
文档编号C12Q1/68GK1603421SQ200410010790
公开日2005年4月6日 申请日期2004年4月5日 优先权日2004年4月5日
发明者尉军, 鞠桂芝, 谢林, 刘树铮, 于雅琴, 史杰萍, 沈岩, 许琪 申请人:吉林大学