专利名称：羽衣甘蓝抗旱耐盐耐冷的蛋白BoRSl编码序列的制作方法
技术领域：
本发明涉及的是一种蛋白编码序列，特别是一种抗旱耐盐耐冷羽衣甘蓝蛋白BoRS1编码序列，属于基因工程领域。
背景技术：
外界环境胁迫如高盐、干旱及寒冷等极大地影响植物的生长。特别是近代地球气候环境的变化和人类的活动引起的地表沙漠和半沙漠化，以及大面积干旱半干旱地区和盐碱滩涂地的存在，更加要求有适宜于这些地区种植的农作物品种能够不断地得到推广。当前一个重要的育种手段是将表现出抗逆基因对农作物进行基因工程改造，以获得抗盐、耐旱或耐寒冷的农作物新品种。相关的胁迫诱导或抗逆基因及其蛋白的研究越来越多。RD(脱水响应)基因是从最初是从植物干旱cDNA文库中克隆出的与干旱相关的一类基因，在植物的生长、发育和抗逆反应中发挥重要作用。
在对现有技术文献的分析中，虽然Yamaguchi-Shinozaki在“Characterization of the expression of a desiccation-responsive rd29gene of Arabidopsis thaliana and analysis of its promoter in transgenicplants(拟南芥脱水响应基因RD29表达特征及其启动子在转基因植物中的分析)”(Molecular and General Genetics分子和普通遗传学，1993.236(2-3)331-40)一文中对拟南芥基因RD29在脱水和盐胁迫处理下的表达已经做了充分肯定，但尚不清楚该基因的耐盐、抗旱和耐冷方面的实际效果，此外至今尚未发现与本发明主题有密切联系文献的报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种抗旱耐盐耐冷羽衣甘蓝蛋白编码序列。本发明公开了与羽衣甘蓝BoRS1密切相关的蛋白基因和羽衣甘蓝BoRS1蛋白序列及其核酸序列，及其在利用转基因技术改良植物抗旱耐盐耐冷中的应用。
本发明是通过以下技术方案实现的，在本发明提供了一种分离出的DNA分子，该分子包括编码具有羽衣甘蓝BoRS1蛋白质活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸第65-1915位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能与SEQ ID NO.3中从核苷酸第65-1915位的核苷酸序列杂交。
所述的编码序列具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列的多肽，或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
所述的编码序列具有SEQ ID NO.3中从核苷酸第65-1915位的核苷酸序列。
在本发明分离出的与抗旱耐盐耐冷相关蛋白质多肽BoRS1，它包括具有SEQID NO.3氨基酸序列的多肽。该多肽是具有SEQ ID NO.3序列的多肽，该多肽能够在盐、旱、冷、高渗透压以及水杨酸处理下均能发挥作用，而水杨酸是植物抗病虫的信号分子。
在本发明的载体包含上述的DNA分子。一种核酸分子，它包含所述的DNA分子中8-100个连续核苷酸。
在本发明用上述DNA分子转化的宿主细胞，它是真核细胞。在实例中该宿主细胞是拟南芥。
在本发明中，“分离的”、“纯化的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组分分开，而且已经与在细胞中伴随其蛋白质分开。
在本发明中，术语“羽衣甘蓝抗旱耐盐耐冷蛋白(或多肽)编码序列”指编码具有羽衣甘蓝BoRS1蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3中第65-1915位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO.3序列的编码框第65-1915位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO.3中第65-1915位核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQ ID NO.3所述的序列。该术语还包括能在中度严紧条件(70％-85％一致性)下，在高度严紧条件(85％以上一致性)下与SEQ ID NO.3中从核苷酸第1162-1703位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括与SEQ ID NO.3中从核苷酸第65-1915位的核苷酸序列的同源性至少70％的核苷酸序列。
该术语还包括能编码具有与天然的羽衣甘蓝BoRS1相同功能的蛋白的SEQ IDNO.3中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)通常为1-90个核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加为60个以内核苷酸。
在本发明中，术语“羽衣甘蓝抗旱耐盐耐冷蛋白或多肽”指具有羽衣甘蓝BoRS1蛋白活性的SEQ ID NO.3序列的多肽。该术语还包括具有与天然羽衣甘蓝BoRS1相关相同功能的、SEQ ID NO.4序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)通常为1-50个氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或为20个以内氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括羽衣甘蓝BoRS1蛋白的活性片段和活性衍生物。
本发明的羽衣甘蓝BoRS1多肽的变异形式包括同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨条件下能与羽衣甘蓝BoRS1相关DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用羽衣甘蓝BoRS1多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。
在本发明中，“羽衣甘蓝BoRS1保守性变异多肽”指与SEQ ID NO.3的氨基酸序列相比，有至多10个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行替换而产生。
表1
表2在415nt重叠中有85％的一致性Query129 cagaggaagaagagcatcacgagagtcgagcatctaaaatgttggggaaagtaaaggcaa 188|||| |||||||||||||| |||| ||||||| ||| ||||| ||||||||| | ||Sbjct1934 cagaagaagaagagcatcatgagaagggagcatccaaagtgttgaagaaagtaaaagaaa 1993Query189 aagctaagaagctcaagaacaggcttactaatcatgg 225| |||||||| |||||||||| || ||||| |||||Sbjct1994 aggctaagaaaatcaagaacagtctcactaaacatgg 2030Query376 tcatcccggagaaaataatgttccggcgccggaggagat 414|||| ||||||||| |||||||||||| ||||||||||Sbjct2255 tcatgccggagaaactaatgttccggcatcggaggagat 2293Query541 agagagcagagagactcatcacgcgccactgaacactcccgtctctctgctctctggaac 600||||||||||||| ||||||| | |||| |||||||||| || |||||||| || | |||Sbjct2495 agagagcagagaggctcatcaagagccattgaacactcctgtgtctctgctttcagcaac 2554Query601 agaggacgtgacta 614||||||||||||||Sbjct2555 agaggacgtgacta 2568Query1126 ttttccgacaagagatgatgatatgaaagtcgagattgggtcgggaagaggcttgccgac 1185
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表3在531aa重叠中有37％的一致性和46％的相似性Query3LTRPSSGHDQTEDPTQIXXXXXXXXXXSRASXXXXXXXXXXXXXXNRLTNHGIDGNXXXX 40LTRP GH+Q E+P +IAS N LT HG +G+Sbjct5LTRPY-GHEQAEEPIRIHHPEEEEHHEKGASKVLKKVKEKAKKIKNSLTKHG-NGHDHDV 62Query41 XXXXXXXXXXXXXXXXXXKHVAPVNEVSNVRGYRTSQPESLTHPGENNVPAPEEIIPSET 82H APV E S VRG T +P+SL+H GE NVPA EEI+P TSbjct63 EDDDDEYDEQDPEV-----HGAPVYESSAVRGGVTGKPKSLSHAGETNVPASEEIVPPGT 117Query83 KD----STDYTGTV-PEPSRDAAYEHEAPLYPVRT--------------------SDVSE 117K S+D+T + P +D +Y HEA PVRT S+ S+Sbjct118 KVFPVVSSDHTKPIEPVSLQDTSYGHEALADPVRTTETSDWEAKREAPTHYPLGVSEFSD 177Query118 REESRETHHAPLNTPVSLLSGTEDVT---TPGG-DGLLGGQREVNTDMPKRFEDDLSGES 173R ESRE H PLNTPVSLLS TEDVTPGG D LGGQR+VN + PKR E+D +Sbjct178 RGESREAHQEPLNTPVSLLSATEDVTRTFAPGGEDDYLGGQRKVNVETPKRLEEDPAAPG 237Query174 TYQSKIPYHTQQGSGEAGEDDHKKSGLGTELASESVTVFGGKEETGPRDDFGEKSHDFDE 233
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发明还包括羽衣甘蓝BoRS1蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然羽衣甘蓝BoRS1相关多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述列举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒，粘粒等。在生产本发明的羽衣甘蓝BoRS1多肽时，可以将羽衣甘蓝BoRS1编码序列可操作地连于表达调控序列，从而形成羽衣甘蓝BoRS1蛋白表达载体。
如本发明所用，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。
在本发明中，术语“宿主细胞”为真核细胞。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、烟草细胞和其它植物细胞。
还可用Northern印迹法技术分析羽衣甘蓝BoRS1基因产物的表达，即分析羽衣甘蓝BoRS1的mRNA转录物在细胞中的存在与否和数量。
此外，本发明可用作探针的核酸分子通常具有羽衣甘蓝BoRS1核苷酸编码序列的8-100个连续核苷酸，该探针可用于检测样品中是否存在编码羽衣甘蓝BoRS1相关的核酸分子。
本发明检测样品中是否存在羽衣甘蓝BoRS1相关核苷酸序列的检测方法，包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于羽衣甘蓝BoRS1相关核苷酸编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为15-50个核苷酸。
此外，根据本发明的羽衣甘蓝BoRS1核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表达蛋白质的同源性基础上，筛选羽衣甘蓝BoRS1相关同源基因或同源蛋白。
为了得到与羽衣甘蓝BoRS1相关基因相关的羽衣甘蓝cDNAs的点阵，可以用DNA探针筛选羽衣甘蓝cDNA文库，这些探针是在低严谨条件下，用32P对羽衣甘蓝BoRS1相关的全部或部分做放射活性标记而得的。适合于筛选的cDNA文库是来自羽衣甘蓝的文库。构建来自感兴趣的细胞或者组织的cDNA文库的方法是分子生物学领域众所周知的。另外，许多这样的cDNA文库也可以购买到，例如购自Clontech，Stratagene，Palo Alto，Cal.。这种筛选方法可以识别与羽衣甘蓝BoRS1相关相关的基因家族的核苷酸序列。
本发明的羽衣甘蓝BoRS1相关核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
除了用重组法产生之外，本发明蛋白的片段还可用固相技术，通过直接合成肽而加以生产(Stewart等人，(1969)固相多肽合成，WH Freeman Co.，SanFrancisco；Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc 852149-2154)。在体外合成蛋白质可以用手工或自动进行。例如，可以用Applied Biosystems的431A型肽合成仪(Foster City，CA)来自动合成肽。可以分别化学合成本发明蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接以产生全长的分子。
利用本发明的羽衣甘蓝BoRS1蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与羽衣甘蓝BoRS1相关发生相互作用的物质，或者受体、抑制剂或拮抗剂等。
本发明具有实质性特点和显著进步，本发明在抗旱耐盐耐冷具有明显的作用，能够明显降低在干旱和盐碱半盐碱土地上及在寒冷地区种植的各种农作物在生物产量上的损失。干旱、高盐和耐冷能够造成大部分农作物如水稻、棉花、羽衣甘蓝和小麦等生长缓慢甚至死亡，从而使其明显减产甚至颗粒无收。我国存在大面积的干旱半干旱、盐碱半盐碱和寒冷地区，及世界范围内也存在干旱半干旱、盐碱半盐碱和寒冷地区，因此，本发明具有很大的应用价值。
具体实施例方式
下面结合实验室试验数据，以具体实施例来进一步阐述本发明下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆实验室手册(纽约冷泉港实验室出版社，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1羽衣甘蓝BoRS1基因的克隆1.组织分离羽衣甘蓝从市场上购得，将羽衣甘蓝置于25℃发芽24小时，然后转移至1/10MS液体培养基中培养，待羽衣甘蓝叶片为3-5片时，准备抽取DNA或RNA。
2.RNA的分离取部分组织，用研钵研碎，加入盛有裂解液的1.5mL EP管，充分振荡后，再移入玻璃匀浆器内。匀浆后移至1.5mL EP管中，用植物叶总RNA少量提取试剂盒抽提总RNA(Watson Biotechnologies.INC)。用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。
3.基因的全长克隆根据油菜RD29-like基因的氨基酸保守序列，利用同源性基因克隆原理，采用RACE方法(GibcoBRL试剂盒)进行cDNA全长克隆，分三个阶段进行(1)RT-PCRPCR[RS01(SEQ ID NO.1)+RS02(SEQ ID NO.2)]得到537bp片段，回收并连接到pGEMT-Easy载体上，用SP6或T7作为通用引物，采用终止物荧光标记(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377测序仪(Perkin-Elmer，USA)上进行测序。测序结果用GCG软件包(Wisconsin group，USA)中的BLAST和FASTA软件搜索已有的数据库(Genebank+EMBL)，知其核酸序列及编码蛋白与已知十字花科植物如拟南芥RD29基因的同源性较高，故初步认为它是一个抗逆基因。
(2)3’-RACEPCR[AP+RS301(5’-TCCGAAAGAGAGAGATGATT-3’)和RS302(5’-CCTGAAGAAGAAGACAAAGC-3’]得到BoRS 3’(533bp)，回收，连接到T-Easy载体上，用SP6或T7作为通用引物，采用终止物荧光标记(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377测序仪(Perkin-Elmer，USA)上进行测序。测序结果用GCG软件包(Wisconsin group，USA)中的BLAST和FASTA软件搜索已有的数据库(Genebank+EMBL)，知其核酸序列及编码蛋白与已知十字花科植物如拟南芥RD29基因的同源性较高，故初步认为它是一个与RD29相关基因。
(3).5’-RACE第-轮PCR[AAP+RS501(5’-GTCACAGGTGATGCAGTTTC-3’)]第二轮PCR[(AUAP+RS502(5’-C(G/T)C(T/C)GGAGTAACCTGTACTTG-3’))第二轮PCR[(AUAP+RS503(5’-CTCTTTCGGACCAGAGAATT-3’))得到RS5’(约1231bp)将测序结果的重叠区拼接，发现得到的片段即是该基因的完整编码区。
BLAST的结果证明从羽衣甘蓝中新得到的基因确为一个与拟南芥RD29相关的基因。
通过组合使用上述3种方法，获得了候选的羽衣甘蓝BoRS1蛋白的全长编码序列(SEQ ID NO.3)。
实施例2羽衣甘蓝BoRS1基因的序列信息与同源性分析本发明新的羽衣甘蓝BoRS1全长cDNA的长度为2076bp，详细序列见SEQ IDNO.3，其中开放读框位于65-1916位核苷酸(1851个核苷酸)。根据全长cDNA推导出羽衣甘蓝BoRS1的氨基酸序列，共617个氨基酸残基，分子量为66946.71道尔顿，等电点(pI)为4.46。详细序列见SEQ ID NO.3。
将羽衣甘蓝BoRS1的全长cDNA序列及其编码蛋白质用BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDStranslations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸和蛋白质同源性检索，结果发现它与拟南芥基因RD29在核苷酸部分片段上具有85％的相同性，(附表2)；在氨基酸水平上，它与拟南芥基因RD29B(AAB25482)也有38％的相同性(附表3)。由此可见，羽衣甘蓝基因BoRS1与拟南芥基因RD29无论从核酸还是蛋白水平上都存在一定的同源性，但同源性不高。拟南芥基因RD29A(AAB25481)和RD29B(AAB25482)已经被证明在干旱和冷条件下明显增强表达，并发挥着重要的作用，可以推测羽衣甘蓝基因BoRS1在抗旱耐盐方面也可能具有相似的作用。
实施例3羽衣甘蓝基因BoRS1蛋白或多肽在拟南芥中进行真核细胞表达及转基因植株的抗旱耐盐性鉴定含目的基因(羽衣甘蓝基因BoRS1基因)的表达载体的构建根据羽衣甘蓝基因BoRS1的全长序列(SEQ ID NO.3)，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点(这可视选用的载体而定)，以便构建表达载体。以实施例1中获得的扩增产物为模板，经PCR扩增后，将羽衣甘蓝基因BoRS1基因cDNA克隆至中间载体(如pBluescript)，进一步克隆到双元表达载体(如pBI121和改进的pCAMBIA2300)，在保证阅读框架正确的前提下鉴定好的表达载体，再将其转入农杆菌中，利用叶盘法技术转化模式植物烟草。
1.发苗种子用无菌水漂洗15-20分钟，再用70％的乙醇消毒1分钟，然后用0.1％升汞消毒10-12分钟。最后再用无菌水冲洗5遍。将洗好的种子用吸水纸吸干，放入MS培养基光照培养。
2.剪叶片取生长两周左右的无菌叶片，去掉其主叶脉，将其剪成约1厘米2见方的小叶片。
3.转化共培养将剪好的叶片放入事先培养好的菌液中(OD600值0.6-0.8)侵染3-5分钟。接着取出放入MS培养基暗培养2天。
4.筛选培养共培养结束后，将外植体放入筛选培养基。2周继代一次。2周左右有愈伤组织形成，约20天可见芽的分化。待绿芽长到2厘米后，切下生根。
筛选培养基MS+6BA(1.0mg/l)+NAA(0.1mg/l)+cb(250mg/l)+Kan(50mg/l)
生根培养基MS+NAA(0.5mg/l)+cb(250mg/l)+Kan(5mg/l)5.抗性植株培养；待根系发达后，将植株取出，用无菌水洗净附着的固体培养基，移入土壤中，刚开始用塑料袋罩几天，待植株健壮后再取下至温室中培养。
含羽衣甘蓝基因BoRS1的转基因拟南芥植株的抗旱耐盐性鉴定鉴于编码BoRS1，如拟南芥的RD29基因已被证明在抗旱耐盐条件下发挥作用，而羽衣甘蓝基因BoRS1转录水平与拟南芥的RD29具有一定的同源性，可进一步对含羽衣甘蓝基因BoRS1的转基因拟南芥植株进行抗旱耐盐鉴定。用300Mm氯化钠和300mM甘露醇处理处理转基因植株和转基因植株的种子(2天、7天、14天、21天、28天)后研究BoRS1基因在转基因植株中的表达情况以及各种处理对植株的生长情况。Northern blot分析结果证明，转基因植株BoRS1转录水平在冷和甘露醇处理后其表达量显著增强，而对照非转基因植株虽表达量提高，但明显低于转基因植株。此外非转基因植株生长缓慢，最后在冷和甘露醇处理下枯萎而死，转基因植物依然能正常生长，只是生长没有未经处理的植株快。在耐盐和抗病虫试验中，转基因植株也明显表现出比对照未转基因植株生长正常。这证明羽衣甘蓝基因BoRS1基因比拟南芥基因RD29具有更有效的和更广泛的抗逆境的功能，将可用于利用转基因技术改良植物抗旱耐盐耐冷的研究和产业化生产中。
实施例4羽衣甘蓝基因BoRS1在羽衣甘蓝中的拷贝数分析采用常规方法从羽衣甘蓝叶片中提取DNA(参考《分子克隆》，Sambrook等，1989)，分别用HindIII，Bg1II和BamHI酶切DNA[30μg.(微克)/样品]后，将DNA转至杂交膜(尼龙膜)上后。使用Amersham Pharmacia公司Gene ImagesTMContents CDP-StarTMlabelling module(PRN3540)，我们将BoRS1基因编码区标记为探针，然后进行杂交(于60℃杂交16小时)。取出膜，置于洗膜液I(1*SSC，1％SDS)中，于60℃漂洗3次，每次15分钟。转入洗膜液II(0.1*SSC，1％SDS)中于60℃漂洗3次，每次同样15分钟。用X光片压片60-90分钟，然后显影、定影(方法参照Roche DIG labeled试剂盒说明书)。结果(Southern杂交)发现在杂交膜上出现多条杂交条带，说明羽衣甘蓝基因BoRS1在羽衣甘蓝中拷贝数不低于2。
实施例5羽衣甘蓝基因BoRS1在羽衣甘蓝中的表达谱分析1.RNA的提取将2周苗龄的羽衣甘蓝幼苗先后经200mM甘露醇，100mMNaCl，冷处理(4℃)，100μM脱落酸(ABA)和200μM水杨酸(SA)分别处理0.5小时、1小时、3小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时，然后用植物叶总RNA少量提取试剂盒抽提总RNA(Watson Biotechnologies.INC)。提取叶总RNA及4℃处理24小时根、茎、叶RNA，并参考《分子克隆》有关RNA的制备章节(Sambrook等，1989)。
2.RNA的定量参考《分子克隆》(Sambrook等，1989)，分光光度计测OD260；RNA含量计算1 OD260＝40μg/ml。
3总RNA琼脂糖凝胶电泳分离1)取6ml 25*(倍)电泳缓冲液，加入117ml无菌水，混匀。2)称取1.5g琼脂糖，加入到上述溶液中，于微波炉里加热融化，转入55℃水浴中。3)于通风橱中取26.8ml甲醛，加入到55℃的凝胶溶液中，混匀。4)迅速倒入制胶板中，室温水平放置30分钟，待胶凝固。5)将提取的RNA(20μg)溶解于RNA变性溶液中，在65℃下加热10分钟，然后立即放在冰上。6)在样品中加入2ul 10*上样缓冲液，混匀。7)在电泳液未盖过胶的条件下点样，5V/cm电压电泳5小时左右。
4.RNA尼龙膜上转移1)转移之前，将尼龙膜用10*SSC浸泡。2)将湿润的膜准确地盖在膜上，将两张与膜大小相同的滤纸置2*SSC溶液中湿润，盖在膜上，排除气泡。3)滤纸上放一叠与膜大小相同的吸水纸，在吸水纸上放一玻璃板和一重物，水平放置，转移12-20小时。4)转移后，将膜于80℃焙烤2小时。
5.膜上杂交信号的检出1)将膜浸在5×Dendart’s，0.1％SDS，0.1mg/ml鲑鱼精DNA]，65℃下预杂交2小时。2)将用Gene ImagesTMContents CDP-StarTMlabelling module标记的探针在沸水中变性5分钟，直接加入1)的杂交液中，于65℃杂交16-24小时。3)取出膜，置于洗膜液I(1*SSC，1％SDS)中，于65℃漂洗3次，每次15分钟。转入洗膜液II(0.1*SSC，1％SDS)中于65℃漂洗3次，每次15分钟。4)用X光片压片60-90分钟，然后显影、定影(方法参照Roche DIGlabeled试剂盒说明书)。Northern杂交表明；不同的化学物质和激素处理，都不同程度的提高了羽衣甘蓝BoRS1转录水平，尤其是冷处理(4℃)和甘露醇(相当于干旱处理)下，表达明显比其它处理增强。说明羽衣甘蓝BoRS1转录水平在干旱、盐和冷胁迫下，均能发挥作用。外源应用ABA也能诱导该基因的表达水平，并且表现为两步诱导过程，暗示该基因有可能也会在病虫害胁迫下发挥作用。
羽衣甘蓝BoRS1基因在冷处理(4℃)的不同时间处理的表达谱分析1.RNA的提取将2周苗龄的羽衣甘蓝幼苗置于4℃冷处理0.5小时、1小时、3小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时；，然后按照上述方法抽提RNA并定量。
2.Northern表达结果显示，羽衣甘蓝BoRS1在冷处理30分钟后即开始启动表达，在24小时后达到最高峰，随后慢慢下降，说明羽衣甘蓝BoRS1在冷处理能够表达并表现出一定规律。
本发明涉及的序列及记号分列如下(1)SEQ ID NO.1的信息(i)序列特征(A)长度20bp(B)类型核苷酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii).分子类型寡核苷酸(iii).序列描述SEQ ID NO.1TGG(A/G)TCGGGAAGAG(G/A)CTTGC(2)SEQ ID NO.2的信息(i)序列特征(A)长度20bp(B)类型核苷酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii).分子类型寡核苷酸(iii).序列描述SEQ ID NO.2CTTCCTCTT(G/C)(A/C)ACCGCCTCA
(2)SEQ ID NO.3的信息<110>上海交通大学<120>羽衣甘蓝抗旱耐盐耐冷的蛋白BoRS1编码序列<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>2076<212>DNA<213>羽衣甘蓝(Brassica oleracea var.acephala)<400>1acgcggggaa tacacagaac acagaaaaga gttttggtta gttcactaag aaaagctttg 60gaaaatggat ttgacacgtc cttcttctgg tcatgatcaa acggaggatc cgacccagat 120tcaccatcca gaggaagaag agcatcacga gagtcgagca tctaaaatgt tggggaaagt 180aaaggcaaaa gctaagaagc tcaagaacag gcttactaat catggcattg atggcaacga 240gcaagaccac gatgtggtgg atgaagaaga agaagatgat gaatctgacg aggcagagtc 300agagaagcat gtcgcaccag taaatgaagt ttccaatgtg agaggctata gaacgagcca 360acctgagtca ttgactcatc ccggagaaaa taatgttccg gcgccggagg agatcattcc 420ttcagagacg aaggattcaa ctgattacac cggaaccgtc cccgaaccat cacgagatgc 480tgcttacgag cacgaggcac cgctttatcc tgtgagaacg tcagatgtgt cggagaggga 540agagagcaga gagactcatc acgcgccact gaacactccc gtctctctgc tctctggaac 600agaggacgtg actactcccg gtggagatgg gttgctcggt ggtcaacggg aagtcaacac 660cgatatgccc aaaagattcg aggacgatct gagtggtgaa tctacttatc agtcaaagat 720tccgtatcac acccaacaag ggagtgggga agctggagaa gatgatcata agaagtcagg 780actaggaact gagctggcgt ccgaatctgt aaccgttttt ggcgggaaag aagaaactgg 840gccgagggat gattttgggg agaaaagcca tgactttgat gagaagatcg aaacaagaat 900cgggaacgat tgtggaaagc caggaactga gctgagtgaa gattttccgg ggaagggcca 960tgaatttgaa caggcgatcg gatctggaat cggggaggat aacggcgccg gaaaacaagg 1020aactgagcgg agggaagatt ttttggggaa aagctatgag tttgatcatg agattgaatc 1080tgcattcggc aaagattcac ccaccagact tcccggagac gaaatttttc cgacaagaga 1140tgatgatatg aaagtcgaga ttgggtcggg aagaggcttg ccgacagaaa ctgatgatca 1200cttctcacca gaattctctg gtccgaaaga gagagatgat ttcgattcgc aggctgagca 1260
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1.一种抗旱耐盐耐冷羽衣甘蓝BoRS1蛋白编码序列，其特征在于，包括编码具有羽衣甘蓝BoRS1蛋白质活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸第65-1915位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能与SEQ ID NO.3中从核苷酸第65-1915位的核苷酸序列杂交。
2.根据权利要求1所述的抗旱耐盐耐冷羽衣甘蓝BoRS1蛋白编码序列，其特征是，所述的编码序列具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列的多肽，或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
3.根据权利要求1或2所述的抗旱耐盐耐冷羽衣甘蓝BoRS1蛋白编码序列，其特征是，所述的编码序列具有SEQ ID NO.3中从核苷酸第65-1915位的核苷酸序列。
4.根据权利要求1所述的抗旱耐盐耐冷羽衣甘蓝BoRS1蛋白编码序列，其特征是，包含DNA分子中8-100个连续核苷酸。
5.根据权利要求4所述的抗旱耐盐耐冷羽衣甘蓝BoRS1蛋白编码序列，其特征是，DNA分子转化的宿主细胞，它是真核细胞。
全文摘要
一种抗旱耐盐耐冷羽衣甘蓝蛋白编码序列，属于基因工程领域。包括编码具有羽衣甘蓝BoRS1蛋白质活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸第65－1915位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能与SEQ ID NO.3中从核苷酸第65－1915位的核苷酸序列杂交。本发明在植物抗旱耐盐耐冷方面具有明显的作用，能够明显减少农作物在干旱半干旱、盐碱半盐碱或冷害发生条件下生物产量的损失。本发明在植物抗旱耐盐耐冷方面具有很大的应用价值。
文档编号C12N15/82GK1557953SQ200410016230
公开日2004年12月29日 申请日期2004年2月12日 优先权日2004年2月12日
发明者唐东芹, 余舜武, 钱虹妹, 黄丹枫, 唐克轩 申请人:上海交通大学