专利名称：一种同体细胞核移植方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种生物同体细胞核移植技术。
背景技术：
近年来，生物工程克隆技术蓬勃开展，已有报道，动物克隆技术是将供体体细胞核经显微手术和细胞融合的方法移植到异体受体去核卵母细胞胞质中，重新组成胚胎(重构胚)。重构胚经培养使之发育至囊胚，再将囊胚移植到同步发情期的寄母子宫内，待发育成熟后分娩出动物，该动物被称为克隆动物，该技术称为体细胞克隆技术又称体细胞核移植技术。
哺乳动物体细胞克隆技术经过几年的发展，已经有了很大的突破，相继诞生了绵羊、山羊、牛、猪、鼠、猫、兔等克隆动物，为家畜良种繁育、濒危动物拯救、生产异种器官移植所需的供体器官、为人类疾病的治疗等开辟了广阔的前景。但是，目前的克隆效率仍处于较低的水平，后代出生率平均不超过3％，而且克隆动物出生后多有异常，动物克隆技术至今仍有一系列问题尚待解决，一系列谜惑有待揭示，如克隆胚胎发育阻滞、胎盘异常、流产率高、出生个体过重及致畸率高等。这些问题与难点极大程度限制了克隆技术的应用和发展。已有报道指出其中原因之一，在正常受精过程中，卵母细胞接受精子，相互识别，启动胚胎发育，而通过核移植技术导入卵母细胞胞质中的是已分化的体细胞核，其基因组状态与精子有很大差异，卵母细胞对其“识别”时出现困难，从而导致重编程的失败或不完全，致使克隆胚胎无法完成发育。
此外，受体卵母细胞的选择也是影响核移植效率的重要因素。例如，在过去的20年中，许多实验室进行的克隆牛工作中，很大程度上受到实验材料卵巢来源的制约。由于这些卵巢大都取材于屠宰场，无法评价提供卵巢的牛的性状和生理功能等状况，更无法了解它的遗传背景等。并且来自不同个体的受体细胞，其胞质结构成分也不相同。卵母细胞胞质中结构成分的不同主要表现为细胞胞质内DNA类型的多样性和细胞质的内环境的不同。不同的DNA组成及内环境的差异会影响核移植的重构胚的分裂及其后的继续发育。
综上所述，克隆技术效率低下的主要原因之一是供核细胞的细胞核与受体细胞质的DNA不相匹配，主要表现在细胞核基因组和细胞胞质基因组的不相容性。其原因是供核细胞的细胞核和受体细胞的胞质来源于遗传背景不同的二个动物个体，结果导致体细胞核移植形成的重构胚能量代谢等方面的紊乱，导致胚胎发育异常，克隆胚胎死亡率高。
发明内容
本发明的目的是提供一种克隆效率高，致畸率低的生物细胞核移植方法，具体涉及一种生物同体细胞核移植方法。
本发明的技术方案是采用生物克隆技术，取同一个、遗传背景清楚的动物个体的供核体细胞和去核卵母细胞，进行同体细胞核移植，制备克隆动物。
所述的动物为哺乳动物，包括，如绵羊、山羊、牛、猪、鼠、猫和兔。
本发明的技术方案通过下述步骤进行，1、准备供核体细胞选遗传背景清楚的青年动物个体，取其耳部皮肤组织，经过处理和培养建立成纤维细胞系，或取卵丘细胞培养建立体细胞系，用作供核细胞；2、准备受体卵母细胞取上述同一动物，用活体取卵(ovum pick up，OPU)方法获得新鲜卵母细胞，作受体细胞；3、去核将应用活体取卵(OPU)的方法获得的新鲜卵母细胞的细胞核去除，留存细胞质，备作接受供体核移植的受体细胞用；4、移核通过胞质内注射法将来自于同一动物的体细胞核注入卵母细胞胞质，或将来自于同一动物的体细胞注入卵母细胞卵周隙，然后再通过融合法融入卵母细胞，形成重构胚；5、活化重构胚；6、培养重构胚，使之发育至囊胚；7、移植克隆囊胚；8、克隆动物的出生。
本发明经动物实验显示，利用来自同一个体的供核细胞和卵母细胞进行核移植克隆动物，其囊胚发育率明显高于已知的异体的核移植克隆技术，表明供核细胞的细胞核与受体细胞质DNA的匹配性以及核、质内环境的相容性均提高。
表1是核、胞质同体与核、胞质同种异体制备克隆牛的比较。
表1制备方法 重构胚数卵裂数(％)囊胚数(％)核胞质同体体细胞克隆牛 59 46(78)21(46)核胞质同种异体体体细胞克隆牛 200126(63) 31(25)用SAS6.12统计软件进行统计，两者囊胚发育率差异极显著(P＜0.001)。
本发明方法利用同体的供核细胞和卵母细胞进行核移植克隆，较好的解决了供核细胞的细胞核与受体细胞质DNA的匹配性以及核质内环境的相容性，能改善克隆胚胎的发育，提高克隆效率。可用于动物克隆获得高产优质家畜，能促进克隆技术在生物学，特别是在农牧业学上的应用，为家畜良种繁育提供新的途径。
具体实施例方式
实施例1 同体体细胞核、质克隆牛1.、准备供核细胞，按已知方法取遗传背景清楚的青年牛的皮肤成纤维细胞或卵丘细胞，用加10％血清的D-MEM/F-12进行培养，用1-5代并0.5％血清饥饿2-4天的细胞进行常规克隆。
2、准备受体卵母细胞，在B型超声监视下，对与供核细胞同一个体的牛进行活体取卵，消毒麻醉母牛，将带有采卵针的B超探头轻缓插到阴道穹隆，隔着直肠壁将卵巢牵引至探头端部，推进采卵针，同时，脚踏开关控制真空泵抽吸卵泡液，压力在95mmHg左右，用含3％BSA和2u/ml肝素的DPBS冲洗液冲洗采卵针和导管，放入收集管。将收集液倒入拣卵杯，用DPBS冲洗，选出卵母细胞复合体(cumulusoocyte complexes，COCs)移入培养皿，加入成熟液(M199+FBS+FSH+LH+E2)培养18-24h。
3、去核与移核用内径约20微米的去核针去除步骤2的卵母细胞的第一极体及附近区域卵胞质，将步骤1的供体细胞核注入步骤2的去核卵母细胞卵周隙，通过融合仪将供核细胞核融入卵母细胞，融合参数为2.5-3.0kV/cm和6-10μs，获得克隆重构胚。
4、将上述重构胚，在M199(含10μg/ml的放线菌酮和5μg/ml的CB)中活化5h。
5、在TcmM199中培养重构胚7天左右，获得囊胚。
6、将上述囊胚移到同步发情的寄母子宫内，寄母妊娠。
7、隆动物的出生妊娠9个月后，克隆牛诞生。
权利要求
1.一种同体细胞核移植方法，其特征在于采用生物克隆技术，取同一个、遗传背景清楚的个体的供核体细胞和去核卵母细胞，进行同体细胞核移植，制备克隆动物。
2.按权利要求1所述的同体细胞核移植方法，其特征是通过下述步骤进行，1)首先获得背景清楚的青年动物，培养建立成纤维细胞系，或取卵丘细胞培养建立体细胞系，作为供核体细胞；2)采用活体取卵方法取步骤1动物的新鲜卵母细胞，去除胞核，作受体细胞；3)将步骤1的供体细胞核移植至步骤2的去核卵母细胞质中，形成重构胚；4)培养步骤3的重构胚并发育成囊胚，移植于寄母动物体内，发育、成熟、分娩出克隆动物。
3.按权利要求2所述的方法，其中所述步骤1的供核体细胞是通过取背景清楚的青年动物的皮肤成纤维细胞或卵丘细胞，用加10％血清的D-MEM/F-12培养，用1-5代并0.5％血清饥饿2-4天的细胞进行克隆。
4.按权利要求2所述的方法，其中所述步骤2的卵母细胞活体取卵后，放入成熟液培养18-24h。
5.按权利要求2所述的方法，其中所述步骤3的重构胚是通过用去核针去除受体卵母细胞的第一极体极其附近区域卵胞质后，注入所述供体细胞核于卵母细胞卵周隙胞质内，融合。
6.按权利要求2所述的方法，其中所述去核针内径为20微米，所述融合参数为2.5-3.0kV/cm和6-10μ。
7.按权利要求1所述的方法，其中所述的动物为哺乳动物，包括绵羊、山羊、牛、猪、鼠、猫和兔。
8.按权利要求1所述的方法，其中所述的动物为哺乳动物牛。
全文摘要
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种生物同体细胞核移植克隆技术。本发明采用生物克隆技术，取遗传背景清楚的同一个体的供核体细胞和去核卵母细胞，进行同体细胞核移植，制备克隆动物。本发明方法较好的解决了供核细胞的细胞核与受体细胞质DNA的匹配性以及核质内环境的相容性，能改善克隆胚胎的发育，提高克隆效率。可用于动物克隆获得高产优质家畜，能促进克隆技术在生物学，特别是在农牧业学上的应用，为家畜良种繁育提供新的途径。
文档编号C12N5/06GK1557946SQ200410016219
公开日2004年12月29日 申请日期2004年2月11日 优先权日2004年2月11日
发明者曾溢滔, 黄淑帧, 杨哓煜, 李华 申请人:上海市儿童医院, 上海滔滔转基因工程股份有限公司