专利名称：以端粒酶活性判断卵巢上皮性癌药物敏感性的方法
技术领域：
本发明属于恶性肿瘤诊断领域，特别是一种以端粒酶活性判断卵巢上皮性癌药物敏感性的方法。
背景技术：
细胞减灭术加术后以顺铂为基础的联合化疗是卵巢上皮性癌的一种常规治疗模式。目前临床选择化疗药物仍具有一定盲目性，因为卵巢上皮性癌化疗方案大多是根据临床经验总结出来的，主要针对不同病理类型来选择不同的化疗方案，而不是根据患者肿瘤的生物学本质与特性来选择用药。因此同一种化疗方案将产生不同的疗效。为了克服这一问题，现有技术已对肿瘤进行体外药敏检测做了大量研究，其中的方法有四甲基偶氮唑盐(MTT)检测法、活细胞计数法等，对临床选择敏感化疗药物有一定的指导作用。但在原代细胞培养中，由于细胞成分复杂，在肿瘤细胞中常夹杂许多正常细胞，而以上方法不能区别化疗药物作用于肿瘤细胞与正常细胞间的差异。因此，以其作为药物筛选指标具有较大的局限性。近年来，还有研究发现，90％以上的卵巢上皮性癌中端粒酶活性增强，而在正常卵巢组织中，端粒酶常呈阴性或活性较低，但目前尚未见以端粒酶活性作为检测药物敏感性指标的报道。
发明内容本发明的目的是提供一种以端粒酶活性判断卵巢上皮性癌药物敏感性的方法，它是一种以检测用药前后端粒酶活性变化作为判断卵巢上皮性癌化疗药物敏感性的方法，与MTT法相比具有更广泛的临床应用前景，可以客观地指导临床选择用药。
本发明为实现上述目的所采用的方案，是一种以端粒酶活性判断卵巢上皮性癌药物敏感性的方法，其特征是按以下步骤完成1)取患者卵巢上皮性癌组织进行原代培养；2)取原代培养后肿瘤细胞提取液测定肿瘤细胞原始端粒酶活性；
3)取原代培养后肿瘤细胞加入顺铂或阿霉素继续培养，以胰蛋白酶消化贴壁肿瘤细胞，测定用药后肿瘤细胞端粒酶活性；4)计算用药后端粒酶活性比原始端粒酶活性的下降程度，当端粒酶活性下降超过30％时判断为药物敏感，低于30％时判断为药物不敏感。
本发明的有益效果是本发明依据卵巢上皮性癌中端粒酶活性增强，而在正常卵巢组织中，端粒酶常呈阴性或活性较低的性质。以不同化疗药物处理卵巢上皮性癌原代培养细胞，测定处理前后肿瘤细胞提取液中端粒酶活性的改变，可以客观反映出肿瘤细胞对化疗药物的敏感程度，而正常细胞的存在对端粒酶活性的改变并不产生影响。所以实验结果可靠，特异性强，从而有效地指导临床选择用药。
实验证明耐药肿瘤细胞中端粒酶活性较相应的药物敏感肿瘤细胞中端粒酶活性增高27.68％～69.06％。卵巢癌SKOV3细胞数量与端粒酶活性呈正相关，即卵巢癌活细胞数量越多，端粒酶活性越高。在药物敏感性肿瘤细胞中，用药前后端粒酶活性下降均高于50％，而在相应的耐药肿瘤细胞中，用药前后端粒酶活性下降均低于30％，说明端粒酶活性下降程度与肿瘤药物敏感性有关。
本发明通过端粒酶活性检侧，MTT法测定肿瘤生长抑制率，以及与临床疗效进行对比证明端粒酶活性下降法较MTT法临床符合率高。
在11例卵巢上皮性癌中，分别加入顺铂、阿霉素进行用药前后端粒酶活性检侧，结果表明端粒酶活性下降在30％以上者分别有9例(81.82％)、9例(81.82％)，端粒酶活性下降低于30％者分别有2例(18.18％)、2例(18.18％)。
以MTT法测定肿瘤生长抑制率，在11例患者中，顺铂、阿霉素生长抑制率在30％以上者分别有4例(36.36％)、7例(63.64％)，而生长抑制率低于30％者分别有7例(63.64％)、4例(36.36％)。
与临床疗效相比，以端粒酶活性下降法及MTT法测定卵巢上皮性癌对顺铂及阿霉素敏感性与临床疗效符合率分别为90.91％、63.64％及90.91％、72.73％。
具体实施方式以端粒酶活性判断卵巢上皮性癌药物敏感性的方法，首先要对患者卵巢上皮性癌组织进行原代培养，然后取原代培养后肿瘤细胞提取液测定肿瘤细胞原始端粒酶活性，另取原代培养后肿瘤细胞加入顺铂或阿霉素后继续培养72小时，测定用药后肿瘤细胞端粒酶活性，再用公式ΔA＝1-用药后端粒酶活性/用药前端粒酶活性，计算用药后端粒酶活性比原始端粒酶活性的下降程度。当端粒酶活性下降超过30％时判断为药物敏感，低于30％时判断为药物不敏感。
本发明采用的卵巢上皮性癌组织原代培养方法是将卵巢上皮性癌患者手术中切除的癌组织立即放入含有RPMI1640培养基的无菌培养瓶中，于超净台中打开放入无菌培养皿内，以生理盐水反复冲净血液后用剪刀将组织剪碎，并以RPMI1640反复冲洗。然后以0.125％～0.25％胰蛋白酶在37℃下消化10～20分钟，以胎牛血清灭活后反复吹打制成单细胞悬液，1500bpm离心，弃上清液，以RPMI1640加10％胎牛血清将细胞沉淀旋起，调整细胞浓度为1×106/ml接种于培养皿中，在37℃、5％CO2培养箱中培养。
本专利采用的端粒酶检测法TRAP-PCR-ELISA法检测端粒酶活性，为半定量方法。其中1)首先通过Folin-酚试剂法(Lowry法)测定卵巢上皮性癌组织提取液中蛋白质含量①制定标准曲线取人血清白蛋白5mg溶于5ml双蒸水中，再制成浓度为250μg/ml的工作液。分别取工作液0ml、0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml和1.0ml，用水补足到1.0ml。每个浓度各取3组。在各试管中加入5ml试剂甲，混匀，于20～25℃放置10分钟，再加入0.5ml试剂乙(Folin氏试剂)，立即振荡摇匀，在20～25℃保温30分钟，然后于500nm处比色。以1ml蒸馏水代替样品作为空白对照。绘制标准曲线，计算回归方程；②将待测样品卵巢上皮性癌组织提取液以相同方法进行上述检测比色，并于每次行0.4ml工作液做对照，将结果带入直线回归方程，计算样品中蛋白质含量；2)进行无RNA酶(RNase)实验条件的制备以0.1％焦碳酸乙二脂(DEPC)处理Eppendorf管、薄壁PCR管及各种吸头，并以0.1％DEPC处理的双蒸水配制磷酸缓冲液(PBS)，再以15磅20分钟高压灭菌，同时去除残留的DEPC。
3)TRAP-PCR-ELISA检测收集消化后离心沉淀的肿瘤细胞，将其置于Eppendorf管中，加入裂解液200μl，冰浴30分钟。4℃，13000g离心20分钟，取上清液移入另一管中。以上述方法测定组织提取液中蛋白含量后取6μg蛋白进行PCR，反应体系为50μl，其中包括端粒酶底物、端粒序列特异性引物P1-TS标记生物素引物及P2扩增引物等。
然后，分别取阳性对照液与阴性对照液3μl作为对照。加变性反应液20μl及PCR扩增产物5μl，室温放置10分钟。加杂交缓冲液225μl，取100μl转入微孔板，在37℃、300bpm水浴摇床上杂交2小时。以洗涤缓冲液250μl洗涤2次，加Anti-DIG-POD(结合有过氧化物酶的抗地戈辛抗体)100μl，终浓度10mU/ml，室温下放置30分钟，以洗涤缓冲液250μl洗涤2次。加TMB底物100μl，室温下放置10-20分钟。加入终止液100μl，在波长为450nm、690nm下测定吸光度，根据以下公式计算端粒酶活性。
△A＝标本值(A450-A690)-标准阴性对照值(A450-A690)其中标准阴性对照值(A450-A690)应小于0.25U，标准阳性对照值(A450-A690)应大于1.5U，当△A＞0.2U判断为阳性。
在本发明中测定用药前后肿瘤细胞端粒酶活性，是先将卵巢上皮性癌组织以胰蛋白酶消化法制成单细胞悬液，调整肿瘤细胞浓度为1×106/ml，取2ml测定原始端粒酶活性。然后另取2ml接种培养皿，继续培养12小时，加入顺铂10μg/ml或阿霉素1μg/ml，继续培养72小时终止，以0.25％胰蛋白酶消化贴壁肿瘤细胞，测定用药后端粒酶活性。
例153岁，右卵巢浆液性囊腺癌III期，行细胞减灭术，术后残存病灶为1cm，癌组织以胰蛋白酶消化法行原代培养，由于肿瘤呈菜花状，质糟脆，故胰蛋白酶浓度选择0.125％，37℃下消化10分钟，消化较完全。检测端粒酶活性为2.495U，加用顺铂、阿霉素后检测端粒酶活性分别为1.254U、1.023U，用药前后端粒酶活性分别下降49.74％、59.0％，提示该患者对顺铂、阿霉素均敏感，而MTT法测定顺铂、阿霉素的肿瘤细胞抑制率分别为10.33％、48.67％，提示肿瘤对顺铂不敏感，而对阿霉素敏感，临床随访结果表明，该患者对顺铂、环磷酰胺方案化疗有效。
例2患者58岁，双卵巢浆液性乳头状腺癌III期，行细胞减灭术，术后残存病灶为1cm，癌组织以胰蛋白酶消化法行原代培养，由于肿瘤组织呈结节状，组织较致密，故胰蛋白酶浓度选择0.25％，37℃下消化20分钟，消化较完全。检测端粒酶活性为2.705U，加用顺铂、阿霉素后检测端粒酶活性分别为1.632U、1.569U，用药前后端粒酶活性分别下降39.67％、42.0％，提示该患者对顺铂、阿霉素均敏感，而MTT法测定顺铂、阿霉素的肿瘤细胞抑制率分别为14.45％、34.91％，提示肿瘤对顺铂不敏感，而对阿霉素敏感，临床随访结果表明，该患者对顺铂、环磷酰胺方案化疗有效。但在8个疗程化疗结束后1年患者复发，血CA125再次升高，再次给予顺铂、环磷酰胺方案化疗仍有效。
例3患者49岁，双卵巢浆液性乳头状腺癌IV期，左锁骨上淋巴结活检阳性，行1个疗程顺铂、阿霉素、环磷酰胺先期化疗后手术，术后最大残留病灶2cm，癌组织以胰蛋白酶消化法行原代培养，胰蛋白酶浓度为0.25％，37℃下消化15分钟，消化较完全。检测端粒酶活性为2.879U，加用顺铂、阿霉素后检测端粒酶活性分别为2.133U、2.215U，用药前后端粒酶活性分别下降25.91％、23.06％，提示该患者对顺铂、阿霉素均不敏感，而MTT法测定顺铂、阿霉素的肿瘤细胞抑制率分别为13.33％、10.33％，也提示肿瘤对顺铂、阿霉素均不敏感，临床随访结果表明，在第三疗程顺铂、阿霉素、环磷酰胺化疗后，患者血CA125没有下降反而显著增高，提示患者对顺铂、阿霉素耐药。
例4患者54岁，左卵巢浆液性腺癌III期，细胞减灭术后最大残留病灶小于2cm，癌组织以胰蛋白酶消化法行原代培养，胰蛋白酶浓度为0.125％，37℃下消化15分钟，消化较完全。检测端粒酶活性为1.776U，加用顺铂、阿霉素后检测端粒酶活性分别为0.998U、0.734U，用药前后端粒酶活性分别下降43.81％、58.67％，提示该患者对顺铂、阿霉素均敏感，而MTT法测定顺铂、阿霉素的肿瘤细胞抑制率分别为40.68％、87.33％，也提示肿瘤对顺铂、阿霉素均敏感，临床随访结果表明，患者对顺铂、阿霉素、环磷酰胺方案化疗有效。患者血CA125水平持续下降，至第四疗程化疗后降至正常。
权利要求
1一种以端粒酶活性判断卵巢上皮性癌药物敏感性的方法，其特征是按以下步骤完成1)取患者卵巢上皮性癌组织进行原代培养；2)取原代培养后肿瘤细胞提取液测定肿瘤细胞原始端粒酶活性；3)取原代培养后肿瘤细胞加入顺铂或阿霉素继续培养，以胰蛋白酶消化贴壁肿瘤细胞，测定用药后肿瘤细胞端粒酶活性；4)计算用药后端粒酶活性比原始端粒酶活性的下降程度，当端粒酶活性下降超过30％时判断为药物敏感，低于30％时判断为药物不敏感。
2按照权利要求1所述的方法，其特征在于卵巢上皮性癌组织原代培养的方法是将手术中切下的癌组织放入含有RPMI1640培养基的无菌培养瓶中，于超净台中打开放入无菌培养皿内，以生理盐水反复冲净血液后用剪刀将组织剪碎，并以RPMI1640反复冲洗；然后以0.125％～0.25％胰蛋白酶在37℃下消化10～20分钟，以胎牛血清灭活后反复吹打制成单细胞悬液，1500bpm离心，弃上清液，以RPMI1640加10％胎牛血清将细胞沉淀旋起，后调整细胞浓度为1×106/ml，接种于培养皿中，在37℃、5％CO2培养箱中培养。
3按照权利要求1或2所述的方法，其特征在于应用TRAP-PCR-ELISA法检测用药前端粒酶活性，是以胰蛋白酶消化法将卵巢上皮性癌组织制成单细胞悬液，调整肿瘤细胞浓度为1×106/ml，取2ml测定原始端粒酶活性。
4按照权利要求1或2所述的方法，其特征在于应用TRAP-PCR-ELISA法检测用药后端粒酶活性，是以胰蛋白酶消化法将卵巢上皮性癌组织制成单细胞悬液，调整肿瘤细胞浓度为1×106/ml，取2ml接种于培养皿中，继续培养12小时，加入顺铂10μg/ml或阿霉素1μg/ml，继续培养72小时终止，以0.25％胰蛋白酶消化贴壁肿瘤细胞，测定端粒酶活性。
全文摘要
本发明是一种以端粒酶活性判断卵巢上皮性癌药物敏感性的方法，首先对患者卵巢上皮性癌组织进行原代培养，然后取原代培养后肿瘤细胞提取液测定肿瘤细胞原始端粒酶活性，另取原代培养后肿瘤细胞加入顺铂或阿霉素后继续培养，测定用药后肿瘤细胞端粒酶活性，最后计算用药后比原始端粒酶活性的下降程度，并判断药物是否敏感。本发明以不同化疗药物处理卵巢上皮性癌原代培养细胞，测定处理前后肿瘤细胞提取液中端粒酶活性的改变，可以客观反映出肿瘤细胞对化疗药物的敏感程度，而正常细胞的存在对端粒酶活性的改变并不产生影响。所以实验结果可靠，特异性强，从而可以有效地指导临床选择用药。
文档编号C12Q1/25GK1563412SQ200410018808
公开日2005年1月12日 申请日期2004年3月30日 优先权日2004年3月30日
发明者瞿全新, 糜若然 申请人:天津医科大学总医院