专利名称：大菱鲆红体病虹彩病毒聚合酶链反应检测法的制作方法
技术领域：
本发明属于鱼类病毒检测技术，是涉及用聚合酶链反应检测大菱鲆红体病虹彩病毒的一种分子生物学方法。
背景技术：
大菱鲆是于1992年引进我国的优质海水鱼类养殖品种，目前已成为我国北方沿海地区最重要的工厂化海水养殖鱼类之一。但近年来我国养殖大菱鲆疾病流行日益严重，特别是由大菱鲆红体病虹彩病毒(turbot reddish bodyiridovirus，简称TRBIV)引起的病毒性红体病，已严重威胁着该养殖产业的健康发展。
大菱鲆红体病虹彩病毒是一种鱼类虹彩病毒，是我国养殖大菱鲆最主要的病毒性病原。中国水产科学研究院黄海水产研究所的史成银等人在国际上率先发现了该病毒，并开展了该病毒的特征、精细结构、致病性、分类鉴定、基因克隆和检测技术的研究，证明该病毒是一种新的鱼类虹彩病毒(Shi etal.，2004)。大菱鲆红体病虹彩病毒近年来在我国养殖大菱鲆中迅速流行，导致患病大菱鲆大量死亡，损失巨大。鉴于TRBIV对我国大菱鲆养殖产业造成的巨大威胁，采用新方法新技术快速、准确、灵敏地检测TRBIV，加强病毒的检测和鱼体的检疫，从而积极预防病毒的感染，对我国大菱鲆养殖业的健康发展具有重要意义。
在感染大菱鲆的虹彩病毒方面，丹麦的Bloch等人曾于1993年报道过虹彩病毒引起丹麦大菱鲆鱼苗大量死亡的病例(Bloch et al.，1993)。但Bloch等人报道的大菱鲆虹彩病毒与我国大菱鲆红体病虹彩病毒在病毒大小、靶组织、易感鱼的大小、所致疾病的外观表现等各方面都有显著差异，因此这是两种不同的感染大菱鲆的虹彩病毒。此外，Bloch等未纯化出丹麦大菱鲆虹彩病毒，在检测技术方面也仅仅通过电镜对该病毒进行了观察，未能建立起病毒的快速检测技术(Bloch et al.，1993)。
由于大菱鲆红体病虹彩病毒是一种新发现的鱼类虹彩病毒，目前对该病毒的检测手段还十分有限，文献中公开报道的仅有中国水产科学研究院黄海水产研究所的史成银等人应用组织病理学方法和电子显微镜技术来检测该病毒(Shi et al.，2004)，以及中国水产科学研究院黄海水产研究所的陈松林等人采用接种培养的牙鲆胚胎细胞的方法来分离和鉴定该病毒(Chen et al.，2004)。在这些方法中，传统的组织病理学方法只能对大菱鲆的病理状态做出初步判断，不能直接检测到大菱鲆红体病虹彩病毒的存在与否，特异性差。电子显微镜观察法虽然可以直接观察到病毒粒子的存在，但操作复杂、样品处理时间过长、不能用于大菱鲆红体病虹彩病毒的快速诊断及大量样品的检测。细胞培养方法可靠性虽较高，但检测灵敏度低，操作繁琐，一般需要一周左右的时间才能得到病毒检测结果。因此，上述病毒检测方法都有明显的缺点，不适合于快速、准确、灵敏地检测大菱鲆红体病虹彩病毒。
聚合酶链反应(polymerase chain reaction，简称PCR)技术是一种现代分子生物学技术，可以在体外快速、大量扩增病毒特异性DNA片段，具有快速、灵敏、准确的特点，可以克服上述检测方法的缺点，已成功地用于多种病毒的检测。文献中已有应用PCR扩增来检测虹彩病毒科病毒的报道，如中山大学的邓敏等人曾通过PCR扩增病毒核苷酸还原酶小亚单位(RNRS)来检测鳜鱼虹彩病毒，台湾国立中山大学的Chao等人曾通过PCR扩增来检测台湾石斑鱼虹彩病毒(邓敏等，2000；Chao et al.，2002)。上述鳜鱼虹彩病毒和台湾石斑鱼虹彩病毒与大菱鲆红体病虹彩病毒同属虹彩病毒科，但属于不同的病毒种，其基因组之间有较大的差异，因此已报道的PCR检测技术并不能用于大菱鲆红体病虹彩病毒的检测。迄今为止，未见有应用PCR扩增来检测大菱鲆红体病虹彩病毒的报道。
参考文献1、邓敏，何建国，左涛，翁少萍，曾慷，吕玲，周松裕，龙綮新，2000。鳜鱼传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)PCR检测方法的建立及虹彩病毒新证据。病毒学报，16365-369。
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发明内容
本发明的目的是提供一种聚合酶链反应(PCR)检测方法，快速、灵敏、简便、准确地对大菱鲆红体病虹彩病毒(TRBIV)进行检测，该方法的检测灵敏度高，效果好，可以替代电子显微镜和细胞培养检测法。
本发明是按以下技术方案实现的本发明的发明人在对TRBIV及其它鱼类虹彩病毒的研究中发现，TRBIV的主要衣壳蛋白基因及其附近的核苷酸序列与其它虹彩病毒的相应序列有明显的差异，根据TRBIV的该段核苷酸序列，可以设计出相应的PCR引物，建立快速、准确、灵敏的检测TRBIV的分子生物学方法。
本发明提供大菱鲆红体病虹彩病毒一种聚合酶链反应检测方法，具体包括三部分1、TRBIV特异性的核苷酸序列；2、TRBIV的PCR检测引物；3、TRBIV的PCR检测方法。
本发明三部分的内容是1.TRBIV特异性的核苷酸序列本发明提供的TRBIV特异性核苷酸序列来源于TRBIV的主要衣壳蛋白基因及其附近的核苷酸序列，为全长1581个核苷酸的线性双链DNA序列(如图1和序列表第1号序列所示)。该TRBIV特异性核苷酸序列的第58个核苷酸至第1419个核苷酸编码一个含453个氨基酸的蛋白质，即TRBIV的主要衣壳蛋白(如序列表第2号序列所示)。
该TRBIV特异性核苷酸序列可以使用两个长度分别为18和19个核苷酸的线性单链DNA(如序列表第3号序列和序列表第4号序列所示)作为寡聚核苷酸引物(以下分别简称为iridoF和iridoR)，通过同源分子克隆的方法得到(如实施例3所示)，或者按已知的该序列的核苷酸组成和排列，在商业化的DNA自动合成仪上按常规方法合成而得到。
2.TRBIV的PCR检测引物本发明用于TRBIV PCR检测的引物是两个长度分别为18和20个核苷酸的线性单链DNA(如序列表第5号序列和序列表第6号序列所示，以下分别简称为MCP-TRBIVF和MCP-TRBIVR)，它们分别与TRBIV主要衣壳蛋白基因及其附近的1581bp的核苷酸片段的304bp-321bp和1084bp-1065bp处的核苷酸序列相同或互补，其核苷酸序列分别为MCP-TRBIVF5’CGTGTTAAGATCCCCTCC 3’和MCP-TRBIVR5’TCTCGTAAATGAGTGACACC 3’。它们是在上述的TRBIV主要衣壳蛋白基因及其附近的核苷酸序列基础上，通过Omiga 2.0软件(Oxford Molecular Ltd.)设计出来的(如实施例4所示)。
本发明的上述PCR引物，可按照已知的该序列的核苷酸组成和排列，通过常规的DNA合成方法合成而得到(例如可以使用商业化的DNA自动合成仪进行合成)。
本发明的上述PCR引物(MCP-TRBIVF和MCP-TRBIVR)，能对TRBIV特异性扩增，但不能对大菱鲆组织DNA进行扩增，也不能扩增淋巴囊肿病毒(虹彩病毒科的一个成员，不同于TRBIV)的DNA。所以，利用上述PCR引物，通过PCR方法可以快速、准确、灵敏的检测TRBIV。
3.TRBIV的PCR检测方法本发明所提供的TRBIV检测方法，包括从待测样品中制备PCR模板，再在适当的反应体系中以上述PCR引物(MCP-TRBIVF和MCP-TRBIVR)进行PCR扩增，扩增结束后进行电泳检测，如果出现特异性目标条带(780bp长的DNA片段)，则该样品的TRBIV检测结果为阳性。具体包括以下步骤(1)PCR检测反应模板的制备取待测样品适量，采用罗氏诊断公司(Roche Diagnostics Ltd.)商品化的“高纯度PCR模板制备试剂盒”(High Pure PCR Template Preparation Kit)进行组织核酸的提取和纯化，作为PCR检测反应的模板，详细操作参见实施例1或该试剂盒使用说明书。
(2)PCR反应体系和PCR反应程序取上述制备的PCR反应模板，连同TRBIV的PCR检测引物MCP-TRBIVF和MCP-TRBIVR，在PCR反应体系中进行循环扩增。该PCR反应体系包括模板DNA溶液1-2μl，Taq DNA聚合酶1U，四种dNTP各250μM，Tris-HCl(pH9.0)10mM，KCl 40mM，MgCl21.5mM，引物MCP-TRBIVF和MCP-TRBIVR各10pmol，最后反应体系的总体积为20μl。PCR反应程序为94℃5分钟，1个循环；然后94℃2分钟，59℃1分钟，72℃1分钟，30个循环；最后72℃7分钟，1个循环。
(3)扩增产物的电泳检测和结果判断上述PCR反应程序结束后，在反应管中加入2μl 10×上样缓冲液(EDTA 50mM，60％甘油，0.1％二甲苯腈蓝FF，0.1％溴酚蓝)，混匀。取少量扩增产物在含0.5μg/ml溴化乙啶的1％琼脂糖凝胶上电泳，观察目的片段的扩增情况。待测样品经PCR反应和琼脂糖凝胶电泳后，若在780bp处出现明亮的DNA条带，则为TRBIV阳性，说明该样品携带大菱鲆红体病虹彩病毒；否则检测结果为阴性。
以上TRBIV的PCR检测方法，从制备反应模板开始，经过配制反应体系、扩增目标核酸等步骤，直至电泳检测扩增产物从而获得检测结果，整个检测过程仅需4-8个小时，十分便捷、快速。
本发明所提供的TRBIV检测方法的灵敏度，可以通过如下方法进行测定取感染了TRBIV的大菱鲆脾组织样品，匀浆后作梯度稀释，然后使用罗氏诊断公司的高纯度PCR模板制备试剂盒制备PCR反应模板(如实施例1所示)，再采用引物MCP-TRBIVF和MCP-TRBIVR分别进行PCR扩增和凝胶电泳检测(如实施例6所示)。测定结果表明，本发明提供的PCR检测方法可以从低至10-7g的病鱼脾组织中检测到TRBIV的存在，具有极高的灵敏度(如图5所示)。
本发明所提供的TRBIV检测方法具有如下优点(1)简便快速。利用已有技术检测TRBIV，通常需要数天至数周的时间，而本方法可以在一天的时间内，得到TRBIV的检测结果，并且可以对数十个样品同时进行检测。
(2)样品用量少，仅需数十毫克样品即可完成检测，不影响样品的完整性。
(3)准确，灵敏度高，对低至10-7g样品中的TRBIV亦可检出。
(4)不使用有毒试剂。
本发明具有如下有益效果利用本发明提供的TRBIV特异性核苷酸序列及依据该序列设计的PCR引物，通过本发明提供的PCR方法，经简单操作，即可对样品中的TRBIV进行快速、灵敏、准确的检定。应用上述方法已完成近100个大菱鲆样品和TRBIV样品的检测，结果准确，且可在一天之内得到检测结果，灵敏度达10-7g鱼体组织，并可以同时检测多个样品。
通过电镜检查，可以在病鱼样品的超薄切片中观察到大菱鲆红体病虹彩病毒的形态结构(如图2所示)。对比检测发现与电镜检查方法相比，电镜检查观察到病毒的阳性样品，PCR检测结果均为阳性，符合率为100％；而PCR检测结果为阳性的样品，有时电镜检查未观察到病毒，说明电镜检查法存在漏检；未发现电镜检查结果为阳性，而PCR检测结果为阴性的样品，说明该PCR方法可靠性高。以上对比检测结果见表1。
因此，PCR法用于TRBIV的检测具有重要的实际意义，它可以快速、准确、灵敏地检测TRBIV，可以加强病毒的检测和鱼体的检疫，从而积极预防病毒的感染。此外，该方法还可应用于TRBIV的临床诊断，实验室诊断及流行病学调查。
表1 TRBIV的PCR检测及电镜检查结果对比
图1大菱鲆红体病虹彩病毒主要衣壳蛋白基因及其附近的核苷酸序列结构示意图，其中带下划线的黑体部分(304bp-321bp和1084bp-1065bp)分别为本发明中用于检测大菱鲆红体病虹彩病毒的PCR引物MCP-TRBIVF和MCP-TRBIVR(互补序列)。
图2超薄切片中大菱鲆红体病虹彩病毒形态结构的电镜观察。
图3从大菱鲆组织中纯化的大菱鲆红体病虹彩病毒的电镜负染观察。
图4本发明PCR检测的特异性测试，即实施例5的PCR扩增结果电泳图，其中1为宝生物工程(大连)有限公司的DL2000DNA分子量标准，2为未感染TRBIV的健康大菱鲆脾脏组织，3为感染了TRBIV的大菱鲆脾脏组织，4为感染了TRBIV的大菱鲆肾脏组织，5为淋巴囊肿病毒DNA。右侧箭头所指为PCR扩增目标条带。
图5本发明PCR检测的灵敏度测试，即实施例6的PCR扩增结果电泳图，其中1为10-3g未感染TRBIV的健康大菱鲆脾脏组织，2为宝生物工程(大连)有限公司的DL2000DNA分子量标准，3-8分别为10-4G、10-5g、10-6g、10-7g、10-8g、10-9g感染了TRBIV的大菱鲆脾组织。右侧箭头所指为PCR扩增目标条带。
具体实施例方式
下面通过实施例结合附图详细叙述本发明的技术内容本发明是在如下科学发现的基础上完成的从2001年开始，在我国养殖大菱鲆中流行一种可导致养殖鱼大量死亡的大菱鲆红体病。通过对该病的流行病学、组织和细胞病理学、病原人工感染和细胞接种实验、病毒的纯化和分子生物学分类鉴定等研究，本发明人在国内外首次发现该病的病原是一种新的鱼类虹彩病毒，并将其命名为“大菱鲆红体病虹彩病毒”(TRBIV)。在克隆并测序了TRBIV的两个重要基因之后，本发明人发现，在病毒主要衣壳蛋白基因及其附近的核苷酸序列中，TRBIV具有与其它虹彩病毒显著不同的组成和排列，因此可作为TRBIV特征性核苷酸序列，用于TRBIV的鉴定和检测。本发明人根据该特征性核苷酸序列，设计制备了TRBIV的PCR引物，建立了TRBIV的PCR检测方法，并在此基础上完成了本发明。该方法可以快速检测样品中的TRBIV，且具有极高的灵敏度和准确性。
为了建立TRBIV的PCR检测方法，首先需要获得TRBIV特异性的核苷酸序列。这通常包括TRBIV的分离纯化、TRBIV的主要衣壳蛋白基因及其附近核苷酸的克隆和测序、TRBIV特异性核苷酸序列的鉴定等内容。
本发明采用超速离心的方法来分离TRBIV，即收集感染了TRBIV的大菱鲆脾脏和肾脏组织，加入磷酸缓冲液，经匀浆、差速离心及20％-60％的蔗糖密度梯度超速离心后，取中间部分，再离心浓缩，可以得到较纯的TRBIV制剂，图3是电镜下观测到的纯化的病毒照片。
为了获得TRBIV的主要衣壳蛋白基因及其附近的核苷酸序列，可以采用多种分子克隆技术。本发明采用了同源分子克隆技术来克隆TRBIV的主要衣壳蛋白基因及其附近的核苷酸序列。即首先根据鱼类虹彩病毒主要衣壳蛋白基因附近的核苷酸序列保守区，以虹彩病毒主要衣壳蛋白基因为目标区，设计合成如下PCR引物，它们为序列表第3号序列和序列表第4号序列所示的两个寡聚核苷酸序列(iridoF和iridoR)。应用PCR引物iridoF和iridoR对纯化的TRBIV DNA进行PCR扩增，得到1600bp左右的目标DNA片段。通过凝胶电泳分离、纯化并回收该片段后，再与pUCm-T克隆载体(购自上海生工生物工程技术服务有限公司)混合，在连接酶作用下连接过夜，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，通过蓝白斑反应和酶切反应对转化子进行筛选和鉴定，挑取含TRBIV DNA片段(约1600bp)的白色克隆在含100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基(1％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl)上培养过夜，使用ABI PRISM TM377型DNA测序仪测序，得到1581bp的TRBIV核苷酸序列。图1是该核苷酸序列的结构示意图。
为了鉴定该核苷酸序列是TRBIV的特异性序列，将该TRBIV核苷酸序列输入到公共数据库GenBank中，运用BlastN程序进行核苷酸序列的搜索和比对，发现该序列是TRBIV主要衣壳蛋白基因及其附近的核苷酸序列，而且该序列与所有已公开DNA序列都不相同，因此该序列是TRBIV特异性的核苷酸序列。序列表第2号序列所示的即为该基因编码的TRBIV主要衣壳蛋白的氨基酸序列。
该TRBIV特异性的核苷酸序列也可以按已知的该序列的核苷酸组成和排列，在商业化的DNA自动合成仪上按常规方法合成而得到。
在获得了TRBIV主要衣壳蛋白及其附近的核苷酸序列之后，就可以根据该TRBIV特异性的核苷酸序列，以TRBIV主要衣壳蛋白基因为目标区，设计并制备TRBIV的PCR检测引物。通常可以使用常用的生物信息分析软件按常规方法来设计PCR引物，如Omiga 2.0和Primer Primier 5.0软件。较佳地，可使用Omiga 2.0软件。引物MCP-TRBIVF(5’CGTGTTAAGATCCCCTCC 3’)和MCP-TRBIVR(5’TCTCGTAAATGAGTGACACC 3’)即是使用Omiga 2.0软件设计出来的TRBIV的PCR检测引物，它们是序列表第5号序列和序列表第6号序列所示的两个寡聚核苷酸序列，分别位于TRBIV主要衣壳蛋白基因及其附近核苷酸序列的304bp-321bp和1084bp-1065bp处。
该TRBIV的PCR检测引物(MCP-TRBIVF和MCP-TRBIVR)可以按本发明的实施例4所述的方法得到，也可以按已知的该引物的核苷酸组成和排列通过常规的DNA合成方法合成而得到(例如可以使用商业化的DNA自动合成仪进行合成)。
在制备了TRBIV的PCR检测引物之后，就可以开展TRBIV的PCR检测。该PCR检测方法通常包括反应模板的制备、PCR反应体系、PCR反应程序、扩增产物的电泳检测和结果判断等内容。
为了成功地进行TRBIV的PCR检测，反应模板的制备即样品组织DNA的提取和纯化很关键。通常要求制备的反应模板纯度高，不含阻碍PCR反应的抑制物。在本发明的实施例1中，采用罗氏诊断公司(Roche Diagnostics Ltd.)商品化的“高纯度PCR模板制备试剂盒”(High Pure PCR TemplatePreparation Kit)进行组织核酸的提取和纯化，作为PCR检测反应的模板，更详细的操作可以参见该试剂盒说明书。纯化的样品组织DNA可冻存于-20℃冰箱中，在数月内使用。
在本发明中，可供使用的制备反应模板的方法或试剂盒可以是任何纯化样品组织DNA的方法或试剂盒，它们包括(但并不限于)罗氏诊断公司的高纯度PCR模板制备试剂盒，多种国产或进口的DNA纯化试剂盒和常规的酚/氯仿抽提法制备组织DNA方法。较佳地，是罗氏诊断公司的高纯度PCR模板制备试剂盒。
上述用于纯化样品组织DNA的试剂盒可以购买得到。
本发明采用如下的反应体系进行TRBIV的PCR检测在获得了纯化的样品组织核酸溶液之后，取1-2μl上述溶液，在冰浴上操作，加入到如下PCR反应混合液中Taq DNA聚合酶1U，四种dNTP各250μM，Tris-HCl(pH9.0)10mM，KCl 40mM，MgCl21.5mM，引物MCP-TRBIVF和MCP-TRBIVR各10pmol，最后反应体系的总体积为20μl(详见本发明的实施例5)。
在进行TRBIV的PCR检测时，可以在一定范围内调整反应体系的总体积，例如可以将反应体系的总体积调整为10-40μl，但应保持上述反应体系中各组分的浓度不变。通常20μl的反应体系足以适合常规的检测。
本发明采用如下的扩增方法进行TRBIV的PCR检测在进行PCR反应时，将以上反应混合物离心数秒，顶部覆盖液体石蜡，置于PCR仪上，运行如下反应程序94℃5分钟，1个循环；然后94℃2分钟，59℃1分钟，72℃1分钟，30个循环；最后72℃7分钟，1个循环(详见本发明的实施例5)。
本发明采用如下方法进行扩增产物的检测和检测结果的判定PCR反应程序结束后，取10μl PCR扩增产物在含0.5μg/ml溴化乙啶的1.0％琼脂糖凝胶上电泳，观察目的片段扩增情况。待测样品经PCR反应和琼脂糖凝胶电泳后，若在780bp处出现明亮的DNA条带，则为TRBIV阳性，说明所测样品携带大菱鲆红体病虹彩病毒；否则检测结果为阴性(详见本发明的实施例5和图4所示)。
为了更准确地检测TRBIV，可同时进行阳性和阴性对照反应。取TRBIV感染的大菱鲆脾脏组织和未感染TRBIV的健康大菱鲆脾脏组织，使用罗氏诊断公司的高纯度PCR模板制备试剂盒纯化样品组织DNA，分别作为阳性对照样品和阴性对照样品。阳性对照样品经PCR反应和琼脂糖凝胶电泳后，应在780bp处出现明亮的DNA条带；阴性对照样品经PCR反应和琼脂糖凝胶电泳后，应没有任何DNA条带出现。
在本发明的实施例6中，采用如下的方法测试TRBIV PCR检测方法的灵敏度首先取感染了TRBIV的大菱鲆脾组织样品1g置于10ml磷酸缓冲液中充分匀浆，并将匀浆液10倍梯度稀释；在按实施例1所述方法分别制备PCR反应模板之后，使用引物MCP-TRBIVF和MCP-TRBIVR，按上述PCR反应体系和反应程序进行TRBIV的PCR检测；最后分别取适量扩增产物在含0.5μg/ml溴化乙啶的1.0％琼脂糖凝胶上电泳，观察目的片段的扩增情况。
图5是本发明PCR检测方法灵敏度测试的结果，可以清楚地看出采用引物MCP-TRBIVF和MCP-TRBIVR进行TRBIV的PCR检测，10-4g、10-5g、10-6g、10-7g感染了TRBIV的大菱鲆脾组织样品都呈明显的阳性反应，即该检测方法的灵敏度可达10-7g病鱼组织。
下面以实施例叙述本发明的技术内容实施例1使用罗氏诊断公司的高纯度PCR模板制备试剂盒提取和纯化样品组织DNA采用罗氏诊断公司的高纯度PCR模板制备试剂盒(High Pure PCRTemplate Preparation Kit)提取和纯化样品组织DNA的具体操作步骤如下(1)取待测样品组织25-50mg(如感染了TRBIV的大菱鲆脾组织50mg)，置于1.5ml无菌离心管中，用眼科剪刀剪碎，各加入组织裂解液(TissueLysis Buffer)200μl和20mg/ml的蛋白酶K 40μl，在55℃水浴中消化1h以上，直至组织被完全消化。
(2)加入吸附缓冲液(Binding Buffer)200μl，充分混合，在72℃水浴中保温10min。
(3)加入异丙醇100μl，充分混合，然后吸去离心管中的不溶物；将高纯度过滤管(High Pure Filter Tube)置于收集管(Collection Tube)上，然后将剩余液体转移到高纯度过滤管中。
(4)在台式高速离心机上以8000rpm离心1min。
(5)弃去滤出液和收集管，将高纯度过滤管置于一个新的收集管上；向高纯度过滤管中加入抑制物去除液(Inhibitor Removal Buffer)500μl，以8000rpm离心1min。
(6)弃去滤出液和收集管，将高纯度过滤管置于一个新的收集管上；向高纯度过滤管中加入清洗液(Wash Buffer)500μl，以8000rpm离心1min。
(7)重复步骤(6)一次。
(8)弃去滤出液，将高纯度过滤管再置于同一个收集管上，以16000rpm离心10s，充分去除残留的清洗液。
(9)弃去收集管，将高纯度过滤管置于一只干净的1.5ml无菌离心管上。
(10)向高纯度过滤管中加入70℃预热的洗脱液(Elution Buffer)40μl，以8000rpm离心1min。
(11)滤出液中含有纯化出的目的核酸样品，将离心管置于-20℃备用。
以上所述组织裂解液、吸附缓冲液、蛋白酶K、高纯度过滤管、抑制物去除液、清洗液、洗脱液、收集管均由罗氏诊断公司的高纯度PCR模板制备试剂盒提供。
实施例2大菱鲆红体病虹彩病毒的分离提纯以下离心均在4℃进行。取被TRBIV感染的大菱鲆病鱼脾脏组织1.7g，用磷酸缓冲液(简称PBS，其组成为2.68mM KCl，1.47mM KH2PO4，0.137MNaCl，8.06mM Na2HPO4，pH7.4)洗涤3次，置于玻璃匀浆器中，加入15mlTEN溶液(0.1mol/L NaCl，10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，pH8.0)，在冰上充分研磨。将匀浆液以1500×g离心15min，弃沉淀；取上清液再以5800×g离心30min(HITACHI P50AT2-721角转子)，弃沉淀；取第二次离心得到的上清液，经36400×g离心2h，弃上清；将沉淀以TEN溶液完全悬浮，平铺于预先制备好的20-60％(w/w)蔗糖浓度梯度上，以HITACHIRPS65T-704水平转子于44000×g超速离心2h。取中间部分，用PBS 10倍稀释，然后于52600×g离心30min，弃上清，将沉淀溶解在0.3ml PBS中，可以得到较纯的病毒制剂。
取一滴纯化的病毒溶液置于覆有formvar膜的铜网上，令其吸附3分钟，然后晾干，再用1％磷钨酸负染，最后置于JEM-1200EX型透射电子显微镜下观察、照相。图3是电镜下观测到的纯化病毒的照片。
实施例3TRBIV主要衣壳蛋白基因及其附近核苷酸序列的制备1.含TRBIV DNA的大菱鲆病鱼脾组织核酸的提取取感染了TRBIV的大菱鲆病鱼脾脏组织50mg，采用罗氏诊断公司的高纯度PCR模板制备试剂盒进行含病毒DNA的病鱼脾组织核酸的提取和纯化，具体操作步骤同实施例1。
2.TRBIV DNA的PCR扩增对提取的TRBIV DNA样品，使用引物iridoF和iridoR进行扩增。取1个200μl无菌离心管，在冰浴上操作，加入如下PCR反应成分PCR反应模板溶液5μl，Taq DNA聚合酶2.5U，四种dNTP各250μM，Tris-HCl(pH9.0)10mM，KCl 40mM，MgCl21.5mM，引物iridoF和iridoR各50pmol，最后反应体系的总体积为100μl。将以上试剂混匀后离心数秒，顶部覆盖50μl液体石蜡，置于PCR仪上，按下列程序进行PCR反应94℃5分钟，1个循环；然后94℃2分钟，57℃1分钟，72℃1分钟，35个循环；最后72℃7分钟，1个循环。PCR扩增使用英国Thermo Hybaid公司的PCR Express仪进行。反应结束后，取10μl反应产物在含0.5μg/ml溴化乙啶的1.5％琼脂糖凝胶上电泳，置于紫外灯下观察PCR扩增结果。
3.TRBIV PCR扩增产物的纯化和回收PCR扩增结束后，除去矿物油，取80μl TRBIy的PCR扩增产物电泳分离目标片段，用上海华舜凝胶回收试剂盒回收1600bp目标片段，具体操作步骤如下(如果没有特别指示，室温离心，离心速度为9000×g)(1)割下含DNA的琼脂糖块，使它尽可能小，放入1.5ml离心管中称重。
(2)按每100mg琼脂糖加入300μl S1液的比例加入S1液，如果琼脂糖块重量小于100mg，用双蒸水补充至100mg，以确保体系总体积不至太小。置50℃水浴10分钟，使琼脂糖块完全溶化，每2分钟颠倒混匀一次。
(3)加入1/3 S1液体积的异丙醇，混匀。50℃水浴1分钟，混匀。
(4)将溶化的琼脂糖液移入吸附柱，静置2min，离心30s。倒掉收集管中的液体，再将吸附柱放入同一个收集管中。
(5)在吸附柱中加入500μl W1液，静置2min，离心15s。倒掉收集管中的液体，再将吸附柱放入同一个收集管中。
(6)重复步骤(5)一次。
(7)离心1min。
(8)将吸附柱放入一个干净的1.5ml的离心管中，在吸附膜中央加入40μl T1液，50℃水浴保温5分钟后，离心3min。离心管中含有回收的目的DNA。
(9)取5μl回收产物电泳定量，计算回收产物的浓度。
以上所述S1液、吸附柱、收集管、W1液、T1液均由上海华舜凝胶回收试剂盒提供。
4.TRBIV PCR扩增产物的克隆和测序PCR扩增产物的克隆采用上海生工生物工程技术服务有限公司的PCR产物克隆试剂盒进行，具体操作步骤如下
(1)连接反应a.在一个标准的10μl连接反应体系中，加入50ng pUCm-T载体、0.2pmol的PCR扩增产物(载体∶目标片段＝1∶10)、1μl 10×连接缓冲液、1μlPEG4000和1μl的T4 DNA连接酶，其余用水补足。
b.反应按以下体系进行10×连接缓冲液1μlPEG4000 1μlpUCm-T载体1μl纯化后的PCR扩增产物 4μl无菌双蒸水2μlT4 DNA连接酶 1μl总体积10μl注意一般最后加入T4 DNA连接酶。
c.16-23℃连接1h至过夜。
(2)转化a.取100μl E.coli DH5α感受态细胞，置于冰上，完全解冻后轻轻将细胞均匀悬浮。
b.加入5μl连接液，轻轻混匀。冰上放置30min。
c.42℃水浴热激35s，冰上放置2min。
d.加400μl SOC培养基(2％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，0.05％NaCl，2.5mmol/L KCl，20mmol/L MgCl2，20mmol/L葡萄糖，pH7.0)，37℃，200-250rpm震荡培养1h。
e.室温下4000rpm离心5min，用微量移液器吸嘴吸掉400μl上清液，用剩余的培养基将细胞悬浮。
f.将细菌涂布在预先用20μl 100mmol/L IPTG和100μl 20mg/mlX-gal涂布的含100μg/ml的氨苄青霉素的SOB平板(2％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，1.5％琼脂，0.05％NaCl，2.5mmol/L KCl，20mmol/L MgCl2，pH7.0)上。
g.平板在37℃正向放置1h以吸收过多的液体，然后倒置培养过夜。
(3)转化子蓝白斑筛选a.当外源DNA片段插入到pUCm-T中后，由于外源DNA的存在改变了LacZ基因的编码，从而影响了其产物β-半乳糖苷酶α片段的活性，因此重组克隆在IPTG/X-gal平板上呈现为白色，而非重组克隆呈蓝色。
b.选择在IPTG/X-gal平板上生长的白色菌落，用牙签挑至含100μg/ml氨苄青霉素的5ml LB液体培养基(1％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl)中，37℃培养过夜。
(4)转化子的酶切鉴定a.将培养过夜的各菌液分别做如下处理取1.5ml菌液置于无菌微量离心管中，4℃暂存供测序之用；取1.0ml菌液置于无菌微量离心管中，加入200μl无菌甘油充分混匀，冷冻于-70℃保种；取1.5ml菌液置于无菌微量离心管中供抽提质粒使用。
b.用碱裂解法小规模制备质粒。12000×g离心30s收集菌体，加入100μl冰冷的溶液I(25mmol/L Tris-HCl，pH8.0，10mmol/L EDTA，50mmol/L葡萄糖)，剧烈震荡。再加入200μl新配制的溶液II(0.2mol/LNaOH，1％SDS)，快速颠倒离心管5次，置于冰上。再加入150μl用冰预冷的溶液III(3mol/L乙酸钾，11.5％冰醋酸)，温和震荡使其充分混匀，冰上放置5min，之后12000×g离心5min。将上清转入新的塑料离心管中，加等量酚∶氯仿(1∶1)，震荡混匀，12000×g离心2min。将上清转入新的塑料离心管中，加2倍体积的乙醇于室温沉淀DNA，震荡混合，室温放置2min。于4℃ 12000×g离心5min，去除上清液，以1ml 70％乙醇于4℃洗涤DNA沉淀，在空气中干燥10min。最后将沉淀溶解在50μl含无DNA酶的胰RNA酶(20μg/ml)的TE缓冲液(10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，pH7.4)中。
c.按以下反应体系使用限制性内切酶Pst I对纯化质粒进行酶切PstI1μl10×H缓冲液 2μl纯化的质粒 3μl无菌双蒸水 14μl总体积 20μld.37℃酶切1.5h。
e.酶切反应结束后，向反应管中加入2μl的10×上样缓冲液(EDTA 50mM，60％甘油，0.1％二甲苯腈蓝FF，0.1％溴酚蓝)，中止反应。各取10μl反应产物在含0.5μg/ml溴化乙啶的1.5％琼脂糖凝胶上电泳，置于紫外灯下观察，挑选出含1600bp左右插入片段的克隆。
(5)插入片段的序列测定和分析将含目的片段的转化菌液提供给上海博亚生物工程有限公司，使用ABIPRISM TM 377型DNA测序仪以M13通用引物和T7启动子引物对PCR产物双向测序并进行序列拼接，得到1581bp的TRBIV核苷酸序列，如图1和序列表第1号序列所示。将该TRBIV核苷酸序列输入到公共数据库GenBank中，运用BlastN程序进行DNA序列的搜索和比对，发现该序列是TRBIV主要衣壳蛋白基因及其附近的核苷酸序列，而且该序列与所有已公开核苷酸序列都不相同，是TRBIV特异性的核苷酸序列。
以上所述pUCm-T载体、10×连接缓冲液、PEG4000、T4 DNA连接酶均由上海生工生物工程技术服务有限公司的PCR产物克隆试剂盒提供；限制性内切酶Pst I、10×H缓冲液购自宝生物工程(大连)有限公司。
实施例4PCR引物MCP-TRBIVF和MCP-TRBIVR的制备在获得TRBIV主要衣壳蛋白基因及其附近的核苷酸序列的基础上，使用Omiga 2.0软件分析该序列，得出MCP-TRBIVF和MCP-TRBIVR的核苷酸组成和排列(如图1所示的带下划线的黑体部分，即304bp-321bp和1084bp-1065bp处)是用于TRBIV扩增的最佳PCR引物序列。根据MCP-TRBIVF和MCP-TRBIVR的核苷酸组成和排列，在商业化的DNA自动合成仪上进行化学合成，即可获得如序列表第5号序列和序列表第6号序列所示的核苷酸序列。
实施例5TRBIV的PCR检测方法1.PCR模板的制备取待测鱼体组织样品各25-50mg，使用罗氏诊断公司的高纯度PCR模板制备试剂盒提取和纯化样品DNA(同实施例1)。
2.PCR反应及电泳检测取4个200μl无菌离心管，在冰浴上操作，配制如下PCR反应体系各样品DNA溶液1-2μl，Taq DNA聚合酶1U，四种dNTP各250μM，Tris-HCl(pH9.0)10mM，KCl 40mM，MgCl21.5mM，引物MCP-TRBIVF和MCP-TRBIVR各10pmol，最后反应体系的总体积为20μl。将以上试剂混匀后离心数秒，顶部覆盖50μl液体石蜡，置于PCR仪上，运行如下PCR反应程序94℃5分钟，1个循环；然后94℃2分钟，59℃1分钟，72℃1分钟，30个循环；最后72℃7分钟，1个循环。程序结束后，除去矿物油，各管中加入2μl 10×上样缓冲液(EDTA 50mM，60％甘油，0.1％二甲苯腈蓝FF，0.1％溴酚蓝)，混匀。取10μl混合物点样于含0.5μg/ml溴化乙啶的1％琼脂糖凝胶上电泳，电泳结果如图4所示。
图4的结果清楚地显示采用引物MCP-TRBIVF和MCP-TRBIVR进行TRBIV的PCR检测，感染了TRBIV的大菱鲆脾脏和肾脏组织都呈阳性反应，而未感染TRBIV的健康大菱鲆脾脏组织和淋巴囊肿病毒(另一种鱼类虹彩病毒)均为阴性反应，说明该检测方法具有特异性，可以清晰、准确、快速地检测TRBIV。
实施例6TRBIV PCR检测的灵敏度测定取感染了TRBIV的大菱鲆脾组织样品1g，置于干净的玻璃匀浆器中，加入10ml磷酸缓冲液(2.68mM KCl，1.47mM KH2PO4，0.137M NaCl，8.06mM Na2HPO4，pH7.4)，在碎冰上充分匀浆，再用磷酸缓冲液10倍梯度稀释。然后取匀浆液和各梯度稀释液200μl以及未被TRBIV感染的健康大菱鲆脾脏组织25-50mg，使用罗氏诊断公司的高纯度PCR模板制备试剂盒分别提取和纯化样品DNA(同实施例1)。
取7个200μl无菌离心管，在冰浴上操作，配制如下PCR反应体系各样品DNA溶液2μl，Taq DNA聚合酶1U，四种dNTP各250μM，Tris-HCl(pH9.0)10mM，KCl 40mM，MgCl21.5mM，引物MCP-TRBIVF和MCP-TRBIVR各10pmol，最后反应体系的总体积为20μl。将以上试剂混匀后离心数秒，顶部覆盖50μl液体石蜡，置于PCR仪上，运行如下PCR反应程序94℃5分钟，1个循环；然后94℃2分钟，59℃1分钟，72℃1分钟，30个循环；最后72℃7分钟，1个循环。程序结束后，除去矿物油，各管中加入2μl上样液(EDTA 50mM，60％甘油，0.1％二甲苯腈蓝FF，0.1％溴酚蓝)，混匀。取10μl混合物点样于含0.5μg/ml溴化乙啶的1％琼脂糖凝胶上电泳，电泳结果如图5所示。
从图5的结果可以清楚地看出采用引物MCP-TRBIVF和MCP-TRBIVR进行TRBIV的PCR检测，10-4g、10-5g、10-6g、10-7g感染了TRBIV的大菱鲆脾组织样品都呈明显的阳性反应；而10-3g未感染TRBIV的健康大菱鲆脾脏组织样品呈阴性反应。以上结果表明该检测方法可以从低至10-7g的病鱼脾组织中检测到TRBIV的存在，具有极高的灵敏度。
序列表<110>中国水产科学研究院黄海水产研究所<120>大菱鲆红体病虹彩病毒聚合酶链反应检测法<160>6<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1581<212>DNA<213>大菱鲆红体病虹彩病毒(turbot reddish body iridovirus)<220>
<221>CDS<222>(58)..(1419)<223>
<400>1gtgcaggttt ccagaagaaa aacgaggctg gtcatatata aaagtatcac cgtcatc 57atg tct gca atc tta ggt gcg aac gta acc agt ggg ttc atc gac atc105Met Ser Ala Ile Leu Gly Ala Asn Val Thr Ser Gly Phe Ile Asp Ile1 5 10 15tcc gct ttc gat gcg atg gag acc cac ttg tac ggc ggc gac aat gcc153Ser Ala Phe Asp Ala Met Glu Thr His Leu Tyr Gly Gly Asp Asn Ala20 25 30gtg aca tac ttt gcc cgc gag acc gtg cgt agt tcc tgg tac agc aaa201Val Thr Tyr Phe Ala Arg Glu Thr Val Arg Ser Ser Trp Tyr Ser Lys35 40 45cta ccc gtc acc ctg tca aaa cag act ggc cat gcc aat ttc ggc cag249Leu Pro Val Thr Leu Ser Lys Gln Thr Gly His Ala Asn Phe Gly Gln50 55 60gag ttt agt gtg acg gtg gcc agg ggt ggc gac tac ctc att aat gtg297Glu Phe Ser Val Thr Val Ala Arg Gly Gly Asp Tyr Leu Ile Asn Val65 70 75 80tgg ctg cgt gtt aag atc ccc tcc atc aca tcc agc aag gaa aac agc345Trp Leu Arg Val Lys Ile Pro Ser Ile Thr Ser Ser Lys Glu Asn Ser85 90 95tac att cgc tgg tgt gat aat ctg atg cac aat ctg gtt gag gag gtg393
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权利要求
1.一种大菱鲆红体病虹彩病毒聚合酶链反应检测法，其特征是它的方法包括下列三部分1).提供一段用于鉴别该病毒的特异性核苷酸序列；2).提供一对用于检测该病毒的PCR引物MCP-TRBIVF和MCP-TRBIVR；3).提供一种该病毒的PCR检测方法，包括反应模板的制备、PCR反应体系、PCR反应程序、扩增产物的电泳检测和结果判断。
2.根据权利要求1所述的大菱鲆红体病虹彩病毒聚合酶链反应检测法，其特征在于所述的用于鉴别该病毒的特异性核苷酸序列，是一段全长为1581个核苷酸的线性双链DNA序列，该序列是大菱鲆红体病虹彩病毒的主要衣壳蛋白基因及其附近的核苷酸序列，该序列的第58个核苷酸至第1419个核苷酸编码一个含453个氨基酸的蛋白质，即该病毒的主要衣壳蛋白；该特异性核苷酸序列为GTGCAGGTTT CCAGAAGAAA AACGAGGCTG GTCATATATA AAAGTATCAC CGTCATCATGTCTGCAATCT TAGGTGCGAA CGTAACCAGT GGGTTCATCG ACATCTCCGC TTTCGATGCGATGGAGACCC ACTTGTACGG CGGCGACAAT GCCGTGACAT ACTTTGCCCG CGAGACCGTGCGTAGTTCCT GGTACAGCAA ACTACCCGTC ACCCTGTCAA AACAGACTGG CCATGCCAATTTCGGCCAGG AGTTTAGTGT GACGGTGGCC AGGGGTGGCG ACTACCTCAT TAATGTGTGGCTGCGTGTTA AGATCCCCTC CATCACATCC AGCAAGGAAA ACAGCTACAT TCGCTGGTGTGATAATCTGA TGCACAATCT GGTTGAGGAG GTGTCGGTGT CATTTAACGA CCTGGTGGCACAGACCCTGA CCAGCGAGTT CCTCGACTTT TGGAACGCCT GCATGATGCC CGGCAGCAAACAGTCTGGCT ATAACAAGAT GATTGGCATG CGCAGCGGCC TGGTCTCCGG TATCACCAACGGTCACACTA TGCCTGCTAC CTACCTCAAT TTGCCCATCC CCCTCTTCTT CACCCGCGACACAGGCCTTG CATTGCCCAC CGTGTCTCTG CCGTACAACG AGGTGCGCAT CCACTTCAAGCTGCGGCGCT GGGAGGACCT GCTCATCAGC CAGAGCACCC AGGCCGACAT GGCCATCTCGACCGTCACCC TGGCCAACAT TAGCAATGTA GCACCCGCGT TGACCAACGT TTCCGTGATGGGCACCTACG CTGTGCTGAC AAGTGAGGAG CGCGAGGTGG TGGCCCAGTC TAGCCGTAGCATGCTCATTG AACAGTGCCA GGTGGCGCCT CGTGTGCCCG TCACACCCGC AGACAATTCCTTGGTGCATC TGGACCTCAG GTTCAGTCAT CCCGTCAAGG CCTTGTTCTT TGCAGTAAAGAACGTCACCC ACCGCAACGT GCAAAGCAAT TACACCGCGG CCAGTCCCGT GTATGTCAACAACAAGGTCA ATCTGCCTTT GCTGGCCACC AATCCCCTGT CCGAGGTGTC ACTCATTTACGAGAACACCC CTCGGCTCCA CCAGATGGGA GTAGACTACT TCACATCCGT CGACCCCTACTACTTTGCGC CCAGCATGCC TGAGATGGAC GGTGTTATGA CCTACTGCTA TACCCTGGACATGGGCAATA TCAACCCCAT GGGCTCGACC AACTACGGCC GCCTGTCCAA CGTCACCCTGTCATGTAAGG TGTCGGACAA CGCCAAGAAA ACAGCAGCGG GCGGCGGAAC CAACGGCAGCGGCTACACGG TCGCCCAAAA GTTTGAACTG GTCGTTATTG CAGTCAACCA CAACATCATGAAGATTGCTG ACGGCGCTGC AGGCTTCCCT ATCCTGTAAG CAATGGACTG CCCAGTGTGTCTGGCAGCCA TGTCGGAGCC GTATGTATTA AATTGCGGCC ATAGCGTATG CAAGGCATGCTGTGATAAGC TTGGGCCCAC GTGTTGTGTG TGCCGCACTG TCATCACAAG CAGAGCCACCAACTATGCGT TACGTACCAT G
3.根据权利要求1所述的大菱鲆红体病虹彩病毒聚合酶链反应检测法，其特征在于所述的用于检测该病毒的一对PCR引物，即MCP-TRBIVF和MCP-TRBIVR，是以该病毒的特异性核苷酸序列为基础设计的，它们是两个长度分别为18和20个核苷段的线性单链DNA，分别与该病毒的主要衣壳蛋白基因及其附近的1581bp的核苷酸片段的304bp-321bp和1084bp-1065bp处的核苷酸序列相同或互补，其核苷酸序列分别为MCP-TRBIVF5’CGTGTTAAGATCCCCTCC 3’和MCP-TRBIVR5’TCTCGTAAATGAGTGACACC 3’。
4.根据权利要求1所述的大菱鲆红体病虹彩病毒聚合酶链反应检测法，其特征在于所述的该病毒PCR检测方法，首先从待测样品中制备反应模板，配制PCR反应体系，利用PCR反应程序对反应模板进行扩增，最后通过电泳检测扩增产物来检测样品中的该病毒，如果出现780碱基对的特异性目标条带，则该样品的大菱鲆红体病虹彩病毒检测结果为阳性。
5.根据权利要求1、4所述的大菱鲆红体病虹彩病毒聚合酶链反应检测法，其特征在于所述的PCR反应体系为模板DNA溶液1-2μl，Taq DNA聚合酶1U，四种dNTP各250μM，Tris-HCl(pH9.0)10mM，KCl 40mM，MgCl21.5mM，引物MCP-TRBIVF和MCP-TRBIVR各10pmol，最后反应体系的总体积为20μl；所述的PCR反应程序为94℃ 5分钟，1个循环；然后94℃2分钟，59℃ 1分钟，72℃ 1分钟，30个循环；最后72℃ 7分钟，1个循环。
全文摘要
一种大菱鲆红体病虹彩病毒聚合酶链反应检测法，属于鱼类病毒检测方法。该方法主要包括以下内容1.一段用于鉴别大菱鲆红体病虹彩病毒的特异性核苷酸序列；2.一对用于检测大菱鲆红体病虹彩病毒的PCR引物MCP－TRBIVF和MCP－TRBIVR；3.一种利用引物MCP－TRBIVF和MCP－TRBIVR检测大菱鲆红体病虹彩病毒的PCR方法，具体步骤包括反应模板的制备、PCR反应体系、PCR反应程序、扩增产物的电泳检测和结果判断。本发明具有方便、快速、准确、灵敏的特点，可对鱼苗、成鱼和饲料中是否存在大菱鲆红体病虹彩病毒进行检定，也可以用于大菱鲆红体病虹彩病毒的流行情况调查。
文档编号C12Q1/68GK1635161SQ200410085399
公开日2005年7月6日 申请日期2004年10月25日 优先权日2004年10月25日
发明者史成银, 王印庚, 黄倢, 王清印 申请人:中国水产科学研究院黄海水产研究所