专利名称：Rna干扰片段及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于分子遗传和基因治疗学领域，具体地说，本发明是关于一种能抑制β-地中海贫血α-链的RNA干扰片段及其应用。
背景技术：
地中海贫血是由于某种或某些蛋白链合成速率降低，造成一些肽链缺乏，而另一些肽链相对增多，以致出现肽链数量的不平衡而导致的溶血性贫血。β-地中海贫血(β地贫)是其中的一种类型，全世界已有数百种不同的β地贫类型。
大量研究资料表明，β-地中海贫血除少数是由于基因缺失引起外，绝大多数是由于β-珠蛋白基因不同类型的点突变(包括单个碱基的取代，个别碱基的插入或缺失)所致。这些点突变分别导致转录受阻，mRNA前体剪接加工错误，翻译无效，使α/β珠蛋白链不平衡等。β链合成减缺，α链相对过多，多余的α链形成α包涵体。在未分化成熟的红细胞内，α链包涵体可以使细胞膜受到损伤，使之大部分在骨髓内被破坏。部分红细胞虽然能成熟并释放至外周血内，但由于α链包涵体附着在红细胞膜上，使红细胞僵硬，它在通过微循环时，易被撕裂；包涵体脱落则红细胞形成泪滴状，这种红细胞寿命短，易被破坏引起贫血、肝脾大等症状，目前该病无特异治疗，终因输血过多，铁质沉积、心脏衰竭致死。
目前，β地贫的治疗主要有药物治疗，如羟基脲、丁酸等诱导HbF(胎儿型血红蛋白)增多以取代β珠蛋白基因合成不足；骨髓移植疗法(但缺乏有效的供体)；转基因治疗(如β-珠蛋白基因)；反义基因纠正异常β链的方法等。但是上述的方法都有缺陷，不能达到满意的治疗效果。
发明内容
本发明的目的就在于克服现有β地贫治疗方法的上述缺点和不足，从而提供一种基于RNA干扰(RNAi)技术的针对β地贫的RNA干扰片段。
本发明的另一个目的在于提供一种以针对β地贫的RNAi片段构建的表达载体。
人α珠蛋白基因的cDNA序列在GeneBank已有公布，应用RNAi设计中的一些原则，如GC碱基含链大于45％，寻找AA序列之后的序列为靶位点，长度19-23个bp等，人工设计针对α链的RNAi片段3个，两端设计酶切位点，Blast比对序列的特异性较好，序列为α1GAC CTA CTT CCC GCA CTT Cα2GTT CCT GGC TTC TGT GAG Cα3ATA CCG TTA AGC TGG AGC C以上述α1、α2和α3的RNAi片段构建表达载体通过巢式PCR从人胚肾293T细胞中扩增得到依赖RNA聚合酶III的H1启动子，PCR引物为1、5’-TATCTAGAGAATTCGAACGCTGACG-3’；2、5’-TGAAGCTTGTGGTCTCATACAGAAC-3’3、5’-TCTAGACTGACGTCATCAACCCGCTCCA-3’(反义链)。
其中引物2、3分别具有XbaI和HindIII酶切位点。
将得到的H1启动子克隆至pREP4载体上(invitrogen)，得到PH载体；之后通过HindIII和NheI酶切位点，将上述RNAi片段退火后，连至PH载体上，分别构建成Pα1、Pα2、Pα3三种载体，并经测序正确。
以上述构建得到的表达载体，转染人红白血病细胞系(K562)，并建立混合克隆细胞株1、转染K562细胞(购自中科院上海细胞所)用15％胎牛血清的DMEM培养基(GIBCO)，于37℃、5％CO2条件培养。采用脂质体2000(Invitrogen)进行细胞转染。转染时，用1μg RNAi载体转染K562细胞(105/孔，24孔培养板)；2、建立混合克隆细胞株由于转染效率低，为了排除阴性细胞(未转染干扰质粒)的细胞影响，于转染48小时后，加入浓度为800μg/ml的hygromycin(潮霉素，sigma公司)进行筛选，约两周建立混合克隆细胞株。
经实验证明，本发明设计的三种干扰质粒都能降低K562细胞中α链的表达，各干扰链减低α链表达量约30％以上。由于α珠蛋白表达量下降，合成α珠蛋白四聚体的量减低，这样就减少了α包涵体的产生，可解决α/β链的不平衡问题，使正常α/β相对比例升高、溶血症状减轻，并有可能刺激病人造血系统代偿机理，使HbF增多，治疗或缓解病人的临床症状。
图1为本发明的RNAi载体的构建示意图；图2为本发明的定量RT-PCR结果示意图；具体实施方式
以下通过具体实施例对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明，而不用于限定本发明的范围。
以下实施例中所使用的技术，包括基因测序、PCR扩增与检测、细胞转染、载体构建等分子生物学技术，以及细胞培养、检测技术等，除非特别说明，均为本领域内的技术人员已知的常规技术；所使用的仪器设备、试剂、质粒和载体、细胞系等，除非是本说明书特别注明，均为一般本领域的研究和技术人员可以通过公共途径获得的。
实施例1RNAi片段的设计应用RNAi设计中的一些原则(Berns K，Nature.2004；428(6981)431-7)(1)从转录本(mRNA)的AUG起始密码开始，寻找“AA”二连序列，并记下其3′端的19-23个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点。(2)将潜在的序列和相应的基因组数据库(人或小鼠、大鼠等等)进行比较，排除那些和其他编码序列/EST同源的序列，例如使用BLAST(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)；(3)选出合适的目标序列进行合成，人工设计针对α链的三个RNAi片段α1GAC CTA CTT CCC GCA CTT Cα2GTT CCT GGC TTC TGT GAG Cα3ATA CCG TTA AGC TGG AGC C这三个RNAi片段长度均为19bp，鉴于现有技术中对于这样的短片段的合成很容易做到，故此处不再赘述。
实施例2构建表达载体分别以上述设计的α1、α2和α3三个RNAi片段构建表达载体，具体步骤如下1、PH载体的获得通过巢式PCR从人胚肾293T细胞(中科院上海细胞所)中扩增得到依赖RNA聚合酶III的H1启动子，具体如下
PCR引物15’-TATCTAGAGAATTCGAACGCTGACG-3’；25’-TGAAGCTTGTGGTCTCATACAGAAC-3’；35’-TCTAGACTGACGTCATCAACCCGCTCCA-3’(反义链)。
其中引物2、3分别具有XbaI和HindIII酶切位点。
扩增条件一扩94℃4min，1个循环；94℃30second，53-57℃45second，72℃30second，30个循环；72℃10min，1个循环；二扩94℃4min，1个循环；94℃30second，55℃45second，72℃30second，32个循环；72℃10min，1个循环。
将得到的H1启动子克隆至T载体(Invitrogen公司)上，得到对照载体TH1。经测序显示H1启动子序列正确。然后通过XbaI和SalI双酶切载体TH1，将H1启动子克隆至pREP4载体上(invitrogen)，得到PH载体。
2、表达载体的构建以Hind III和NheI酶切PH载体，将上述RNAi片段α1(含有Hind III和NheI酶切位点)两条链退火后，应用T4连接酶连至PH载体上，构建成Pα1表达载体(如图1所示)，并经测序鉴定为正确，其序列如SEQ ID NO1所示。
用相同的方法以α2和α3构建表达载体Pα2和Pα3，并经测序鉴定，其序列分别如SEQ ID NO2和3所示。
实施例3转染人红白血病细胞系K562，并建立混合克隆株1、转染K562细胞(购自中科院上海细胞所)用15％胎牛血清的DMEM培养基(GIBCO)，于37℃、5％CO2条件培养。采用脂质体2000(Invitrogen)进行细胞转染，方法可完全根据厂家说明。转染时，分别用1μg RNAi载体Pα1、Pα2和Pα3转染K562细胞(105/孔，24孔培养板)，质粒与脂质体比例为1ug∶2.5ul。
2、建立混合克隆细胞株由于转染效率低，为了排除阴性细胞(未转染干扰质粒)的细胞影响，于转染48小时后，加入浓度为用600～800μg/ml的hygromycin(潮霉素，sigma公司)进行筛选两周以上，得到阳性细胞克隆，大约两周后建立混合克隆细胞株，并提取细胞的RNA进行分析，以保证RNA的纯度(如有DNA污染，需以DNA酶处理)。
实施例4干扰效果检测1、半定量RT-PCR分析提取应用Pα1、Pα2和Pα3转染后建立的混合K562细胞克隆中的RNA(Gentra公司RNA提取试剂盒)，逆转录后进行PCR反应。
逆转录条件为将RNA、RNase inhibitor、Oligo dT 70℃，10min；冰浴2min后，加入dNTP、逆转录酶和buffer，37℃，1hr。
PCR条件为94℃4min，1个循环；94℃1min，55℃45second，72℃1min，23～29个循环；72℃10min，1个循环，同时扩增α链、γ链(因为α链、γ链在K562细胞中的比例约为1，故同时扩增α链、γ链，并用γ链作为内参)。
引物为α链正向，5’CCACCACCAAGACCTACTTC3’反向，5’TACCGAGGCTCCAGCTTAAC3’γ链正向，5’GTATCTGGAGGACAGGGCACT3’反向，5’ACTCGCTTCTGGAACGTCTGA3’扩增产物于1.5％的琼脂凝胶电泳(80V)2小时后，用Qscan软件(STRATAGENE公司)进行光密度分析，根据α链光密度带与γ链的光密度带的光密度比，计算mRNA的相对含量。电泳结果如表1所示。可见，各干扰组α链mRNA的量、光密度比值(α链/γ链)都明显低于正常对照组。
表1干扰组α链mRNA的量、光密度比值(α链/γ链)
2、实时定量RT-PCR检测提取总RNA，逆转录后进行PCR反应，具体如下提取总RNA提取应用Pα1、Pα2和Pα3转染后建立的混合K562细胞克隆中的RNA，步骤参考Gentra公司RNA提取试剂盒说明。
逆转录将RNA、RNase inhibitor、Oligo dT 70℃，10min；冰浴2min后，加入dNTP、逆转录酶和Buffer，42℃，1hr。
PCR各取4μl作为PCR模板，使各组RNA总量一致，向反应体系中加入引物(1CCACCACCAAGACCTACTTC；2TACCGGAGGCTCCAGCTTAAC)2μl，ddH2O 9μl，10μl SYBRRGreen(GENE公司，用于检测DNA的量)定量PCR体系，总体系25μl。每个样品分别扩增α链、γ链。反应条件为95℃预变性3min，95℃变性30s，59℃退火、延伸30s，共25个循环。59℃时采集荧光。反应结束后用定量PCR仪(CORBETTRESEARCH，RG3000)的分析软件(comparative quantity)对实验结果进行分析。实验中，我们以γ珠蛋白链作为内参，结果如图2所示。
可见各干扰组(α1、α2、α3)由于RNAi的作用，使α链的合成相对减少，各干扰链减低α链表达量约30％以上，α/γ链mRNA的比值比对照组N都有明显的减少。
序列表<110>上海交通大学附属儿童医院<120>RNA干扰片段及其应用<130>041382C<160>3<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>700<212>RNA<213>unsure<220>
<221>plasmid<222>(1)..(700)<223>
<400>1tggtaccagc tgctagcttt ccaaaaagac ctacttcccg cacttctctc ttgaagaagt 60gcgggaagta ggtcgggagc ttgtggtctc atacagaact tataagattc ccaaatccaa 120agacatttca cgtttatggt gatttcccag aacacatagc gacatgcaaa tattgcaggg 180cgccactccc ctgtccctca cagccatctt cctgccaggg cgcacgcgcg ctgggtgttc 240ccgcctagtg acactgggcc cgcgattcct tggagcgggt tgatgacgtc agtctagagg 300atcgatcccc gccccggacg aactaaacct gactacgaca tctctgcccc ttcttcgcgg 360ggcagtgcat gtaatccctt cagttggttg gtacaacttg ccaactgggc cctgttccac 420atgtgacacg gggggggacc aaacacaaag gggttctctg actgtagttg acatccttat 480aaatggatgt gcacatttgc caacactgag tggctttcat cctggagcag actttgcagt 540ctgtggactg caacacaaca ttgcctttat gtgtaactct tggctgaagc tcttacacca 600atgctggggg acatgtacct cccaggggcc caggaagact acgggaggct acaccaacgt 660caatcagagg ggcctgtgta gcttccgata agcggaccct 700
<210>2<211>680<212>RNA<213>unsure<220>
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权利要求
1.一种针对β-地中海贫血的RNA干扰片段，其特征在于，具有以下任一序列α1GAC CTA CTT CCC GCA CTT Cα2GTT CCT GGC TTC TGT GAG Cα3ATA CCG TTA AGC TGG AGC C。
2.一种RNA干扰片段的表达载体，其特征在于，该表达载体克隆有权利要求1所述的任一RNA干扰片段。
3.如权利要求2所述的表达载体，其特征在于，该表达载体具有SEQ ID NO1、2或3所示的序列。
4.权利要求1所述的RNA干扰片段用于制备治疗β-地中海贫血的药物的用途。
5.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述治疗β-地中海贫血的药物是抑制α-珠蛋白链的表达。
全文摘要
本发明公开了一种针对人β－地中海贫血α－珠蛋白mRNA的RNA干扰(RNAi)片段，由其构建的载体、以及产生的K562混合细胞系，通过半定量RT－PCR分析、实时定量RT－PCR检测发现各干扰片段载体能使α珠蛋白表达量降低约30％以上。因此，本发明的RNAi片段及其表达载体应用于临床基因治疗具有重要价值。
文档编号C12N15/63GK1778917SQ20041008466
公开日2006年5月31日 申请日期2004年11月26日 优先权日2004年11月26日
发明者曾溢滔, 谢书阳, 张敬之, 黄淑帧 申请人:上海交通大学附属儿童医院