专利名称：植物表皮毛控制基因的制作方法
技术领域：
本发明属于农业科学和植物改良基因工程领域。具体地说，本发明涉及新的植物表皮毛控制基因GaMYB2及其编码蛋白。本发明还公开了GaMYB2基因的用途，尤其在改良棉纤维基因工程中的应用。
背景技术：
植物表皮毛是单细胞水平上研究细胞分化、极性生长和形态建成的一个模式系统(Hulskamp，2004，Nat.Rev.Mol.Cell Biol.5，471-480)。植物表皮毛分为腺毛和非腺毛，主要的功能是保护植物，如抵御虫害、减少蒸发、提高抗冻力和防紫外线等(Marks等，1997，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.48，137-163)。其中，棉纤维和腺毛还具有重要的经济价值(Wilkins等，2000，Crit.Rev.Plant Sci.19，511-550；Wagner等，2004，Ann.Bot.(Lond)93，3-11)。
棉纤维是棉花种子的表皮毛，它是纺织工业最重要的天然纤维原料。棉纤维是一个单细胞，是已知的最长的植物细胞，一般长2.2～3.0cm；棉纤维细胞不含木质素，纤维素占细胞干重的95％(Kim和Triplett，2001，Plant Physiol.1271361-1366)。棉纤维发育研究的进展主要是分离了一些棉纤维优势或特异表达基因(John&Crow，1992，Proc.Natl.Acad.Sci USA 895769-5773；Li等，2002，Biochim.Biophys.Acta 1487106-111；Ji等，2003，Nucleic.AcidsRes.312534-2543；Ruan等，2003，Plant Cell 15952-964)。植物纤维素合成酶的第一个亚基CesA1/CesA2首先克隆于棉花(Pear等，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9312637-12642)。
MYB类基因是克隆棉纤维发育关键基因的焦点，一些自棉纤维中分离的MYB基因的表达特征和进化关系受到重视(Cedroni等，2003，Plant Mol.Biol.51313-325)。迄今为止，只有棉花蔗糖合成酶基因Sus(sucrose synthase gene)在棉花植物中证实与棉纤维发育相关。反义RNA分析表明，Sus参与棉纤维伸长(Ruan等，2003，Plant Cell 15952-964)。
综上所述，目前位置对调控植物表皮毛的基因还知之甚少，因此为了调控植物表皮发育，尤其是改良棉纤维的品质性状，本领域迫切需要开发新的植物表皮毛调控基因。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的植物表皮毛调控蛋白GaMYB2蛋白以及其活性片段、类似物和衍生物。
本发明的另一目的是提供编码这些多肽的多核苷酸。
本发明的另一目的是提供生产这些多肽的方法以及该多肽和编码序列的用途。
在本发明的第一方面，提供新颖的分离出的GaMYB2多肽，它包括具有SEQ IDNO2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
较佳地，该多肽选自下组(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽；(b)将SEQ ID NO2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有调控表皮毛发育的功能的由(a)衍生的多肽；(c)具有SEQ ID NO2中第12-117位所示的R2R3MYB结构域和第171-197位所示的激活域，且具有调控表皮毛发育的功能的由(a)衍生的多肽。
更佳地，该多肽是具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽。
在本发明的第二方面，提供编码分离的这些多肽的多核苷酸，该多核苷酸包含—核苷酸序列，该核苷酸序列与选自下组的—种核苷酸序列有至少70％(更佳地至少80％，最佳地至少90％)相同性(a)编码上述棉花GaMYB2多肽的多核苷酸；和(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。较佳地，该多核苷酸编码具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽。更佳地，该多核苷酸的序列是选自下组的一种(a)具有SEQ ID NO1中74-745位的序列；(b)具有SEQ ID NO1中1-818位的序列；或(c)具有SEQ ID NO3中1-594位的序列；(d)具有SEQ ID NO3中1-597位的序列。
在本发明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的载体，以及被该载体转化或转导的宿主细胞或者被上述多核苷酸直接转化或转导的宿主细胞，尤其是植物细胞。还提供了由转化的植物细胞所再生的植株。
在本发明的第四方面，提供了制备棉花GaMYB2多肽的方法，该方法包含(a)在适合表达的条件下，培养上述被转化或转导的宿主细胞；(b)从培养物中分离出棉花GaMYB2多肽。
在本发明的第五方面，提供了与上述的棉花GaMYB2多肽特异性结合的抗体。
在本发明的第六方面，提供了一种改变植物表皮毛的方法，其特征在于，它包括步骤(1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有GaMYB2多肽的DNA编码序列，所述的GaMYB2多肽的选自下组(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽；(b)将SEQ ID NO2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有调控表皮毛发育的功能的由(a)衍生的多肽；(c)具有SEQ ID NO2中第12-117位所示的R2R3MYB结构域和第171-197位所示的激活域，且具有调控表皮毛发育的功能的由(a)衍生的多肽；(2)将植物细胞或组织或器官与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使GaMYB2多肽的DNA编码序列转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；(3)选择出转入GaMYB2多肽的DNA编码序列的植物细胞或组织或器官；(4)将步骤(3)中的植物细胞或组织或器官再生成植株。
在另一优选例中，所述的植物是拟南芥或棉花。
在本发明的第七方面，提供了一种GaMYB2多肽的用途，其特征在于，它用于改变植物的表皮毛。
本发明的其它方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
图1显示了GaMYB2基因的序列。下划线的序列为编码区，方框中的序列为内含子。
图2显示了GaMYB2基因编码的蛋白序列。下划线的序列为R2R3MYB结构域，方框中的序列为激活域。
图3显示了GaMYB2基因在棉花中的表达特征。DPA代表开花后的天数(dayspost-anthesis)。His代表histone3基因。
图4显示了GaMYB2基因对拟南芥表皮毛发育的调控。
具体实施例方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次从亚洲棉(Gossypium arboreum)(也称为木本棉)中分离到一个植物表皮毛调控基因，命名为GaMYB2。原位杂交和RT-PCR分析分析表明GaMYB2是一个棉纤维高表达的基因。酵母单杂交和拟南芥植物分析实验表明，GaMYB2调控棉纤维特异表达启动子GaRDL1。GaMYB2能控制拟南芥表皮毛的发育，不仅GL1∷GaMYB2完全互补拟南芥gl1突变体，而且35S∷GaMYB2可促使拟南芥种子产生表皮毛。因此，GaMYB2是一个控制棉纤维发育的关键基因，调控表皮毛发育。
在本发明中，术语“GaMYB2蛋白”、“GaMYB2多肽”或“植物表皮毛调控蛋白GaMYB2”可互换使用，都指具有植物表皮毛调控蛋白GaMYB2氨基酸序列(SEQ IDNO2)的蛋白或多肽。它们包括含有或不含起始甲硫氨酸的植物表皮毛调控蛋白GaMYB2。
如本文所用，术语“GaMYB2”是Gossypium arboreum MYB 2的缩写。
如本文所用，术语“内含子”是指基因上一些DNA序列，它们能被转录，但在翻译前即被加工剪切除去了。
如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。
如本文所用，“分离的GaMYB2蛋白或多肽”是指GaMYB2多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化GaMYB2蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。GaMYB2多肽的纯度能用氨基酸序列分析。
本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
本发明还包括棉花GaMYB2蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然棉花GaMYB2蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
在本发明中，术语“棉花GaMYB2多肽”指具有棉花GaMYB2蛋白活性的SEQ IDNO2序列的多肽。该术语还包括具有与棉花GaMYB2蛋白相同功能(即调控表皮毛发育功能)的、SEQ ID NO2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括棉花GaMYB2蛋白的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与棉花GaMYB2DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗棉花GaMYB2多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含棉花GaMYB2多肽或其片段的融合蛋白(如与GST形成的融合蛋白)。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了棉花GaMYB2多肽的片段。通常，该片段具有棉花GaMYB2多肽序列的至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
发明还提供棉花GaMYB2蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然棉花GaMYB2多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
在本发明中，“棉花GaMYB2蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID NO2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。
表1
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO3所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQID NO2的蛋白质，但与SEQ ID NO3所示的编码区序列有差别的核酸序列。
编码SEQ ID NO2的成熟多肽的多核苷酸包括只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0。1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码GaMYB2蛋白的多聚核苷酸。
本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。
本发明的棉花GaMYB2核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或GaMYB2蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。
通过常规的重组DNA技术(Science，1984；2241431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的GaMYB2多肽。一般来说有以下步骤(1).用本发明的编码棉花GaMYB2多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
本发明中，棉花GaMYB2多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含棉花GaMYB2编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等(Sambroook，et al.Molecular Cloning，a Laboratory Manual，cold Spring Harbor Laboratory.New York，1989)。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有大肠杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞等。
本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。
本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得表皮毛改变的植物。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
重组的棉花GaMYB2蛋白或多肽有多方面的用途。这些用途包括(但不限于)用于筛选促进或对抗GaMYB2蛋白功能的抗体、多肽或其它配体。
另一方面，本发明还包括对棉花GaMYB2DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于棉花GaMYB2基因产物或片段。较佳地，指那些能与棉花GaMYB2基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制棉花GaMYB2蛋白的分子，也包括那些并不影响棉花GaMYB2蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的棉花GaMYB2基因产物结合的抗体。
本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段。
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的棉花GaMYB2基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达棉花GaMYB2蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备。本发明的抗体包括能阻断棉花GaMYB2蛋白功能的抗体以及不影响棉花GaMYB2蛋白功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用棉花GaMYB2基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与棉花GaMYB2基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。
抗棉花GaMYB2蛋白的抗体可用于检测样品中是否存在棉花GaMYB2蛋白。一种检测检测样品中是否存在GaMYB2蛋白的方法是利用GaMYB2蛋白的特异性抗体进行检测，它包括将样品与GaMYB2蛋白特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在GaMYB2蛋白。
在本发明的一个实例中，提供了一种分离的多核苷酸，它编码具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽。本发明的多核苷酸是从亚洲棉中分离出的。其基因组序列如SEQ ID NO1所示，它包含的多核苷酸序列全长为818个碱基，包含2段CDS(即74-209和288-745位)；相应的cDNA序列列于SEQ ID NO3，其中开放读框位于1-594位(其中)，编码全长为198个氨基酸的棉花GaMYB2蛋白(SEQ ID NO2)。GaMYB2为改良植物的表皮毛(尤其是棉花的棉纤维)的提供了新的途径，因而具有巨大的潜在应用前景。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如分子克隆实验手册(Molecular cloningA laboratorymanual，3rd ed.，Sambrook等，Cold Spring Harbor Laboratory，2001)和植物分子生物学实验手册(Plant Molecular Biology-A Laboratory Mannual，Clark等，Springer-Verlag，1997)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1 GaMYB2基因的分离棉花DNA提取采用冷酚法。2g材料(亚洲棉(Gossypium arboreum)的棉纤维)，在液氮中磨成粉末，转移到50ml离心管中，加入8ml提取缓冲液(1M Tris·HCl，50mM EDTA，1％SDS，pH9.0)和等体积的水饱和酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，震荡混匀，冰上放置1小时，每隔10分钟混匀一次。4℃，13000g离心20分钟。重复酚∶氯仿∶异戊醇抽提2～4次，最后用氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提一次。取上清夜，加入1/2体积的高盐溶液(0.8M柠檬酸钠，1.2M NaCl)和1/2体积异丙醇，混匀，-70℃放置1小时。4℃，13000g离心20分钟。以下根据提取DNA和RNA而采取相应的操作。去上清液，用1ml 70％乙醇清洗沉淀2次，室温吹20分钟，沉淀溶于1ml无菌水。4℃，13000g离心10分钟。取上清液，加5～10μl RNase(10mg/ml)，37℃，30分钟。
用以下引物GaMYB2-F 5’-CCTTCCCT TGTTTCTCACTAATC-3’(SEQ ID NO4)和GaMYB2-R 5’-CACACCAATAATTGTTGTTTTTTT CTTC-3’(SEQ ID NO5)。PCR反应条件94℃预变性5分钟；然后94℃预变性30秒钟，60℃复性30秒钟，72℃延伸30秒钟，共35个循环；最后72℃延伸10分钟。亚克隆后测序，确认序列是否正确。
测序结果如SEQ ID NO1和图1所示，这是一基因组序列，它包含的多核苷酸序列全长为818个碱基，包含2段CDS(即74-209和288-745位)；相应的cDNA序列列于SEQ ID NO3，其中开放读框位于1-594位(其中)，编码全长为198个氨基酸的棉花GaMYB2蛋白(SEQ ID NO2和图2)。
用上述相同方法抽提棉花的各种组织的DNA，用相同引物进行常规的RT-PCR。还用基于SEQ ID NO1的探针进行原位杂交试验，结果表明GaMYB2是一个棉纤维高表达的基因(图3)。
实施例2载体构建和农杆菌转化根据GaMYB2基因的全长编码序列，设计扩增出完整编码阅读框的引物(对应于SEQ ID NO3中最前20bp和最后20bp)，经PCR扩增后，将GaMYB2的基因组DNA克隆至中间载体pBluescript(购自Stratagene公司)，进一步克隆到双元表达载体pBI121(购自Clontech公司)，在保证阅读框的前提下鉴定好的表达载体，在将其转入农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)中，获得阳性克隆，用于转化棉花等植物。
农杆菌的转化采用冻融法。将单菌落LBA4404或GV3101(Invitrogen)，3mlLB培养基(25μg/ml利福霉素Rif和50μg/ml卡拉霉素Kan或庆大霉素Gen)，28℃，220rpm，过夜培养。2ml菌液，50ml LB培养基(25μg/ml Rif和50μg/mlGen)，28℃，220rpm，培养到OD600＝0.5(约6小时)。在冰上放置30分钟，4℃，5000g离心5分钟。重悬于10ml 0.15M NaCl。4℃，5000g离心5分钟。重悬于1ml 20mM CaCl2，50μl/管分装，液氮速冻，-70℃保存感受态细胞。混合含目的基因双元载体和50μl/管感受态细胞，在冰上放置30分钟，液氮速冻1分钟。在37℃水浴中5分钟使菌液融化，加1ml LB培养基，28℃，220rpm，培养2～4小时。取50～100μl涂LB培养基平板(25μg/ml Rif、50μg/ml Gen和50μg/ml卡拉霉素Kan或潮霉素Hyg)。
实施例3植物转化以及转基因后代的筛选在本实施例中，以棉花和拟南芥的转基因为例，其他植物的转化可以此为参照。
a.棉花的转基因采用农杆菌介导的方法转化棉花。
取5日龄的无菌苗下胚轴上部切段(0.5cm)预培养36小时。培养基SH+2，4-D 0.1mg/L+KT 0.1mg/L。
下胚轴切段于农杆菌菌液(SH+2，4-D 0.1mg/L+KT 0.1mg/L+乙酰丁香酮100μmol/L)中浸泡20分钟。
共培养3天。培养基SH+2，4-D 0.1mg/L+KT 0.1mg/L+乙酰丁香酮100μmol/L。
愈伤组织起始诱导25～30天。培养基SH+2，4-D 0.1mg/L+KT 0.1mg/L+Km50mg/L+头孢霉素(cef)300mg/L或MSB+2，4-D 0.1mg/L+IAA0.1mg/L+ZT0.1mg/L+Km 50mg/L+cef 300mg/L。
胚性愈伤组织诱导及继代筛选，每15天增殖一次。挑选松软、淡绿色或灰色的愈伤组织用于胚性愈伤的诱导；挑选新鲜、黄色、致密、颗粒状的胚性愈伤组织继代增殖。培养基SH或MSB(NH4NO3为0.3mg/L)+IAA 0.5mg/L+KT 0.5mg/L+Km75mg/L+Cef 300mg/L。
胚状体形成和成熟。培养基MSB(KNO3加倍无激素)+Km 75mg/L+Cef 300mg/L。
胚状体(萌发)伸长、生长。培养基MSB(无激素)+活性炭250mg/L+Km75mg/L+Cef 300mg/L。
胚状体真叶生长。培养基MSB+IBA0.4mg/L+KT0.1mg/L+Km75mg/L+Cef300mg/L。部分成正常小植株；部分采取嫁接。
结果提示，GaMYB2调控棉纤维特异表达启动子GaRDL1(以下简称为GL1)(SEQID NO6)，调控棉花的表皮毛发育。
b.拟南芥的转基因拟南芥植物的转化采用花芽浸泡法(floral dip)(方法按Clough和Bent，1998，Plant J.16，735-743进行)。将含双元载体的单菌落GV3101(Invitrogen)，3ml LB培养基(25μg/ml Rif、50μg/ml Gen和50μg/ml Kan或Hyg)，28℃，220rpm，12小时。2ml菌液，50ml LB培养基(25μg/ml Rif、50μg/ml Gen和50μg/ml Kan或Hyg)，28℃，220rpm，12小时。50ml菌液，250ml LB培养基(50μg/ml Gen和50μg/ml Kan或Hyg)，28℃，220rpm，12小时。4200rpm(2900g)，15分钟。菌体重悬于500ml含0.02％Silwet L-77的5％蔗糖溶液中。植株地上部分在菌液中浸泡5sec，平放于塑料盆内，保湿，避光，16～24小时。T0代种子在4℃春化2～4d，用20％漂水处理15分钟，无菌水清洗3～4遍。悬于0.5％的琼脂糖(55℃)，铺在0.6％琼脂的LB培养基(50μg/ml Kan或Hyg)，22℃，连续光照，约一周后，绿色抗性苗移栽到营养土(泥炭∶蛭石∶珍珠岩1∶1∶1)中生长。
结果见图4。图4表明，转入拟南芥后，GL1∷GaMYB2使野生型表皮毛减少。此外，GL1∷GaMYB2完全互补拟南芥gl1突变体，使gl1无毛突变体的体毛恢复。此外，35S∷GaMYB2可促使拟南芥种子产生表皮毛。这些结果表明，GaMYB2能控制拟南芥表皮毛的发育。
实施例4转基因植物的分子生物学鉴定在本实施例中，选取实施例3获得的拟南芥T3代纯合株系，采用抗生素筛选、PCR、GUS染色和Southern杂交分析等方法对转基因植株进行验证。
a.PCR分析DNA提取方法和PCR反应条件见实施例1。引物为SEQ ID NO4和5。
b.GUS染色分析GUS染色液浸泡植物材料，37℃，12～24小时。70％乙醇脱色，样品在70％乙醇中保存。GUS染色液(100mM pH7.0磷酸缓冲液，50mM K3[Fe(CN)6]，50mMK4[Fe(CN)6]，10mM EDTA，1mM X-gluc，0.1％Triton X-100)。
c.Southern杂交分析10μg DNA，选3～5种限制酶，完全酶切(过夜)。0.7％琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后切去凝胶的无用部分。在变性液(1.5M NaCl，0.5M NaOH)中浸泡45分钟，温和摇动。去离子水漂洗，在中和液(1.5M NaCl，1M Tris·HCl，pH7.4)中浸泡45分钟，温和摇动。
采用毛细管转移法将DNA转移到尼龙膜Hybond-XL(Amersham-PharmaciaBiotech)，转移缓冲液为20XSSC(3M NaCl，0.3M柠檬酸钠)，转移时间为12-18小时。用6XSSC漂洗尼龙膜，夹在滤纸中间，压在玻璃板之间，80℃烘2小时。
25ng经割胶醇化的PCR产物，采用Primer-a-Gene Labeling System(Promega)标记探针。α-32P-dCTP，50μl反应体系，37℃，1小时。采用QIAquick NucleotideRemoval Kit(QIAGEN)纯化探针。沸水浴中10分钟，放置冰上。
将尼龙膜放入杂交管中，加10ml预杂交液(50％甲酰胺，5XSSC，5XDenhardt，1％SDS，100μg/ml变性鱼精DNA)，42℃，2～4小时。加入变性的探针，杂交16～24小时。
去杂交液，在室温用含0.1％SDS的2XSSC洗膜2次，每次5分钟。在室温用含0.1％SDS的0.2XSSC洗膜2次，每次5分钟。在42℃用含0.1％SDS的0.2XSSC洗膜2次，每次15分钟。在室温用2XSSC洗膜2次。取出尼龙膜，滴干杂交液，用保鲜膜包裹，胶带固定，压增感屏和X-ray胶片，-70℃，2d。胶片用D-72液显影。
试验结果表明，转基因的拟南芥植株中的确转入了棉花的GaMYB2基因，而对照的拟南芥植株则不含GaMYB2基因。
实施例5GaMYB2蛋白的表达(1)表达载体构建根据GaMYB2基因的全长编码序列(SEQ ID NO3)，设计扩增出完整编码读框的引物。GaMYB2基因的全长基因经PCR扩增后，克隆至表达载体pRS426-CUP(购自Clontech公司)，在保证阅读框正确的前提下鉴定表达载体，将其转入模式生物酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
(2)电转化法转化酿酒酵母A.用无菌牙签挑取YEPD平板中酿酒酵母单菌落于2mL液体YEPD培养基中，28℃，200rpm振荡培养过夜。
B.次日转入200mLYEPD培养基中28℃，200rpm振荡培养直至OD600＝1.0～1.3之间。
C.将细胞转移至50mL离心管中4000rpm，4℃离心10min，弃取上清。
D.将等体积的去离子水加入离心管中，重悬细胞，4000rpm，4℃离心10min。弃取上清。
E.将一半体积的去离子水加入离心管中，重悬细胞，4000rpm，4℃离心10min。弃取上清。
F.将一半体积的1M山梨醇加入离心管中，重悬细胞，4000rpm，4℃离心10min。弃取上清。
G.将500μL的1M山梨醇加入离心管。
H.将100μL感受态酵母细胞与100ng质粒DNA混匀，加入至0.1cm电击杯中冰浴20min，放置于BioRed电穿孔仪中按25μF，1500V电击。
I.然后迅速加入1mL 1M山梨醇，混匀后将部分细胞涂布于选择平板上(无尿嘧啶培养基)30℃培养3～6天，从而获得转入GaMYB2蛋白的酵母菌株。
转入GaMYB2蛋白的酵母菌株的细胞裂解物在对应于约20KDa处有一明显的GaMYB2蛋白条带。
实施例6抗GaMYB2蛋白抗体的产生将实施例5中获得的重组棉花GaMYB2蛋白用来免疫动物以产生抗体，具体方法如下。重组分子用层析法进行分离后备用。也可用SDS-PAGE凝胶电泳法进行分离，将电泳条带从凝胶中切下，并用等体积的完全Freund’s佐剂乳化。用50-100μg/0.2ml乳化过的蛋白，对小鼠进行腹膜内注射。14天后，用非完全Freund’s佐剂乳化的同样抗原，对小鼠以50-100μg/0.2ml的剂量进行腹膜内注射以加强免疫。每隔14天进行一次加强免疫，至少进行三次。获得的抗血清的特异反应活性用它在体外沉淀棉花GaMYB2蛋白基因翻译产物的能力加以评估。结果发现，抗体可特异性地与GaMYB2蛋白发生结合。
实施例7GaMYB2的突变体用常规的定点诱变方法，对SEQ ID NO3的核苷酸序列进行取代或添加，从而使SEQ ID NO2的195位的Leu变为Ile(突变体1)，SEQ ID NO2的195位的Leu变为ala(突变体2)、和在SEQ ID NO2的198位之后添加一个Ala(突变体3)。然后按实施例3b中相同的方法转化拟南芥。
结果表明，在启动子GL1控制下的这三种突变体同样可以互补拟南芥gl1突变体，使gl1无毛突变体的体毛恢复。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表<110>中国科学院上海生命科学研究院<120>植物表皮毛控制基因<130>044446<160>6<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>818<212>DNA<213>棉花(Gossypium arboreum)<220>
<221>CDS<222>(74)..(209)<223>
<220>
<221>CDS<222>(288)..(745)<223>
<400>1ccttcccttg tttctcacta atcatctctg tcttcccttc tcactctttg cctcttctca 60ctgtcggcta ata atg gct cca aag aag gat gga gtg agc aaa agg gtt 109Met Ala Pro Lys Lys Asp Gly Val Ser Lys Arg Val1 5 10ttt aac aaa ggt tct tgg aca gct gag gaa gat aga aga ttg gct aaa157Phe Asn Lys Gly Ser Trp Thr Ala Glu Glu Asp Arg Arg Leu Ala Lys15 20 25tat att gag att cat ggc gca aag aga tgg aaa aca atc gcc att aaa205Tyr Ile Glu Ile His Gly Ala Lys Arg Trp Lys Thr Ile Ala Ile Lys30 35 40tca g gtaatttact ttctgttgaa gagaaactcc attttttgga gcattggaat 259Ser45
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<210>2<211>198<212>PRT<213>棉花(Gossypium arboreum)<400>2Met Ala Pro Lys Lys Asp Gly Val Ser Lys Arg Val Phe Asn Lys Gly1 5 10 15Ser Trp Thr Ala Glu Glu Asp Arg Arg Leu Ala Lys Tyr Ile Glu Ile20 25 30His Gly Ala Lys Arg Trp Lys Thr Ile Ala Ile Lys Ser Gly Leu Asn35 40 45Arg Cys Gly Lys Ser Cys Arg Leu Arg Trp Leu Asn Tyr Leu Arg Pro50 55 60Asn Ile Lys Arg Gly Asn Ile Ser Asp Glu Glu Glu Asp Leu Ile Ile65 70 75 80Arg Leu His Lys Leu Leu Gly Asn Arg Trp Ser Leu Ile Ala Gly Arg85 90 95Leu Pro Gly Arg Thr Asp Asn Glu Ile Lys Asn Tyr Trp Asn Ser His100 105 110Leu Ser Lys Lys Ile Ile Asn His Asp Val Arg Thr Glu Gln Thr Ser115 120 125Ser Ser Glu Gln Ile Val Pro His Lys Ala Trp Glu Thr Val His Met130 135 140Glu Glu Glu Glu Val Val Lys Gly Ser Asp Glu Ile Glu Asn Ser Glu145 150 155 160Phe Ser Ile Asp Val Asp Glu Phe Phe Asp Phe Thr Thr Glu Gly Cys165 170 175Phe Thr Leu Asp Trp Val Ash Lys Phe Leu Glu Leu Asp Asp Gln Gln180 185 190Asp Pro Leu Ala Met Val195<210>3<211>597<212>DNA<213>棉花(Gossypium arboreum)<400>3atggctccaa agaaggatgg agtgagcaaa agggttttta acaaaggttc ttggacagct60gaggaagata gaagattggc taaatatatt gagattcatg gcgcaaagag atggaaaaca120atcgccatta aatcaggttt gaatcgatgc ggcaagagtt gcaggttgag atggttgaac180tacttgagac ctaacattaa gagaggcaac atatcagatg aagaagagga cttaattatt240aggcttcata aactgctggg gaacaggtgg tctttgattg ctgggagact tccagggcga300acagacaatg aaattaagaa ctactggaat tcccatttga gcaagaaaat aataaaccat360
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1.一种分离的GaMYB2多肽，其特征在于，该多肽选自下组(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽；(b)将SEQ ID NO2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有调控表皮毛发育的功能的由(a)衍生的多肽；(c)具有SEQ ID NO2中第12-117位所示的R2R3MYB结构域和第171-197位所示的激活域，且具有调控表皮毛发育的功能的由(a)衍生的多肽。
2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，该多肽是具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽。
3.一种分离的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列选自下组(a)编码如权利要求1所述多肽的多核苷酸；(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。
4.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸编码具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽。
5.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸的序列选自下组的一种(a)具有SEQ ID NO1中74-745位的序列；(b)具有SEQ ID NO1中1-818位的序列；(c)具有SEQ ID NO3中1-594位的序列；(d)具有SEQ ID NO3中1-597位的序列。
6.一种载体，其特征在于，它含有权利要求3所述的多核苷酸。
7.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求6所述的载体。
8.一种多肽的制备方法，其特征在于，该方法包含(a)在适合表达的条件下，培养权利要求7所述的宿主细胞；(b)从培养物中分离出GaMYB2多肽。
9.一种能与权利要求1所述的GaMYB2多肽特异性结合的抗体。
10.一种改变植物表皮毛的方法，其特征在于，它包括步骤(1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有GaMYB2多肽的DNA编码序列，所述的GaMYB2多肽的选自下组(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽；(b)将SEQ ID NO2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有调控表皮毛发育的功能的由(a)衍生的多肽；(c)具有SEQ ID NO2中第12-117位所示的R2R3MYB结构域和第171-197位所示的激活域，且具有调控表皮毛发育的功能的由(a)衍生的多肽；(2)将植物细胞或组织或器官与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使GaMYB2多肽的DNA编码序列转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；(3)选择出转入GaMYB2多肽的DNA编码序列的植物细胞或组织或器官；(4)将步骤(3)中的植物细胞或组织或器官再生成植株。
全文摘要
本发明提供了一种新的植物表皮毛调控蛋白－GaMYB2蛋白，编码GaMYB2蛋白的多核苷酸和经重组技术产生这种GaMYB2蛋白的方法。GaMYB2蛋白是一个控制棉纤维发育的关键基因，可控制表皮毛的发育。
文档编号C12N15/29GK1778813SQ200410084399
公开日2006年5月31日 申请日期2004年11月22日 优先权日2004年11月22日
发明者陈晓亚, 王水, 李春红, 王凌健 申请人:中国科学院上海生命科学研究院