专利名称：一种新型Kunin型多肽及其制备方法
技术领域：
本发明属生物技术领域，涉及一种新型Kunin型多肽，称之为M1型Kunin型多肽(M1 type Kunin polypeptide，M1KP)。具体地说，本发明涉及M1PK的氨基酸序列和基因序列、基因密码子优化、蛋白质表达、蛋白质纯化以及功能测定。
背景技术：
Kunin蛋白家族(Kunins)是抑肽酶(aprotinin)的类似物，又称为胰蛋白酶抑制物或Kunitz蛋白酶抑制物，常由1-3个Kunin型结构域组成。与Kunitz型蛋白酶抑制物不同的是，Kunin型蛋白仅存在于动物中。
每个Kunin型结构域大约有58个左右的氨基酸残基，比丝氨酸蛋白酶抑制物要小许多。不同Kunin型蛋白或多肽的同源性较小，最低达20％。Kunin型蛋白最显著的特点是其丝氨酸残基的组成和由此形成的二硫键。每个Kunin型结构域均含有6个丝氨酸，组成3对二硫键，以保持结构的稳定性。不同的Kunin蛋白或多肽由于氨基酸残基数量和种类的差异，丝氨酸残基和二硫键的部位亦有所不同，这种序列和结构的差异导致了它们功能的区别。
目前已发现人体内存在多种Kunin型蛋白，包括双Kunin蛋白(bikunin)、内α抑制物(inter-α-inhibitor)、前α抑制物(pre-α-inhibitor)、组织因子途径抑制物-1(TFPI-1)和组织因子途径抑制物-2(TFPI-2)等。不同的Kunin型蛋白含有数量不等的Kunin结构域，功能也有差别，甚至差别很大。例如，TFPI-1由3个串联的Kunin结构域组成，每个Kunin结构域含有50个氨基酸残基，结构域1抑制组织因子和因子VIIa，结构域2抑制因子Xa，结构域3与肝素及CD14结合，发挥抗凝和抗炎作用。TFPI-2的结构与TFPI-1类似，但第二结构域的氨基酸残基数量为54个，其结构与功能的关系尚不清楚。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型Kunin型多肽及其制备方法。所述多肽，为M1型Kunin型多肽(M1 type Kunin polypeptide，M1KP)，M1KP具有序列5的氨基酸序列，由68个氨基酸残基组成，其中有6个半胱氨酸残基(C)，组成3对二硫键。
所述6个半胱氨酸残基组成的3对二硫键，其第1个半胱氨酸残基以前的氨基酸残基数量和最后一个半胱氨酸残基以后的氨基酸残基数量可以发生任何数量上的变动。
所述6个半胱氨酸残基的位置分别是C1/14、C2/23、C3/39、C4/47、C5/60和C6/64，所述位置可以随前13个氨基酸残基数量的多寡而相应变化。
所述6个半胱氨酸残基组成3对二硫键的配对关系是C1-C6、C2-C4和C3-C5。
本发明多肽M1KP经密码子偏好设计后，利用PCR方法合成经过优化后的M1KP的基因片段，然后与表达载体重组，转化相应的表达细胞，筛选高表达工程菌或工程细胞。工程菌或工程细胞经扩增，收集表达相，应用分离纯化方法获得高纯度目的蛋白。
所述编码M1KP的密码子，其中真核细胞中编码M1KP的密码子具有序列1的核苷酸序列，酵母中编码M1KP的密码子具有序列2的核苷酸序列，其它细胞中编码M1KP的密码子序列是能编码相应氨基酸残基的任何密码子。
将本发明的M1KPcDNA片断与表达载体重组，形成重组表达质粒。本发明所述的表达载体是原核或真核表达载体。在一优选实施方案中，本发明使用真核表达载体，例如pPIC9K等。
上述重组表达载体可按常规方法导入适宜宿主细胞。本发明所述的表达细胞是原核或真核表达细胞，能够表达所述重组表达载体。在一优选实施方案中，本发明使用毕赤酵母菌GS115等。
本发明的表达产物以具有活性的可溶性形式存在于培养基上清中，培养基上清经超滤浓缩、分子筛、离子交换后进行纯化即获得有活性的M1KP。
本发明从人cDNA文库中或人胎盘组织中获取M1KP基因。为了实现M1KP的高效表达，本发明对其cDNA序列进行优化，从而实现了M1KP在不同表达系统中的高效表达。纯化后的M1KP显示出良好的抗纤溶酶、抗胰蛋白酶、抗基质金属蛋白酶和抗恶性肿瘤侵袭转移等作用。本发明新型kunin型多肽还可用于防止动脉粥样硬化斑块破裂。
以上技术方案中所有基本分子生物学操作均参照《分子克隆实验指南》。
图1是M1KP的二级结构，其中，共68个氨基酸残基，方向如箭头所指，半胱氨酸残基的顺序按C1-C6排列。
图2是胎盘总RNA甲醛变性琼脂糖凝胶电泳图。
图3是M1KP对纤溶酶和胰蛋白酶活性的影响，M1KP明显抑制胰蛋白酶和纤溶酶活性。
图4显示M1KP能够明显抑制MMP2和MMP9的活性。
图5显示M1KP明显抑制HT-1080纤维肉瘤转移。
具体实施例方式
实施例1 M1KP基因的获取(1)胎盘总RNA的提取利用invitrogen公司组织RNA提取试剂提取人胎盘组织总RNA，经甲醛变性琼脂糖凝胶电泳证明所提总RNA符合逆转录要求，结果见图2。
(2)RT-PCR总RNA用寡聚脱氧胸腺嘧啶核苷做引物经MMLV逆转录后，PCR方法扩增M1KP的目的基因。PCR所用引物为sense primer5’-GCC GAA TTC GAT GCT GCT CAG GAG CCA ACA-3’antisense primer5’-AGG TGC GGC CGC TTA TTC TAT CCT CCA GCA AGC-3’反应条件为94℃4min，94℃30sec、46℃30sec、72℃30sec 8cycles，94℃30sec、55℃30sec、72℃30sec 22cycles，72℃7min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分析，并测序验证PCR产物的序列，人体内M1KP的基因序列见序列表。
MMLV、oligodT购自TAKARA公司。
实施例2 M1KP基因的优化和制备(1)M1KP基因的优化及真核表达质粒rpPIC9K/M1KP的构建M1KP基因的优化方法为按照毕赤酵母密码子使用的偏好性将M1KP的cDNA进行优化改造。采用PCR方法，利用两条长引物以野生性M1KP的cDNA为模板扩增出优化后的M1KP编码序列。优化后的基因与真核表达载体pPIC9K重组，核苷酸序列分析证实基因序列与预期相符。
M1KP基因优化方法如下采用长引物扩增法，根据酵母密码子使用的偏好性，合成下列两条长引物Forward5’……GCTAGAA TTCGAT GCT GCT CAA GAA CCA ACT GGT AAT AACGCT GAG ATC TGT TTG TTG CCA TTG GAT TAC GGT CCT TGT AGA GCT CTT TTG TTGAGA TAC TAC TAC GAC AGA TA……3’；Rewards5’……ATTGCG GCC GCT TAT TCA ATT CTC CAA CAA GCA TCG TCACAA GCT TCC CAA GTG TAG AAG TTG TTA GCG TTA CCC TCA CAA CCA CCG TAC AAGAAC TGT CTG CAA GAC TGA GTG……3’上面两条引物中划横线的序列为限制性内切酶EcoRI和NotI的识别位点。以野生性M1KP的cDNA序列为模板，上游引物与下游引物配对，进行PCR。PCR产物即为经过优化的M1KP的编码基因。优化后的编码基因经EcoRI和NotI酶切后与pPIC9K重组。
限制性内切酶购自NEB公司，大肠杆菌DH5α、质粒pPIC9K、酵母菌GS115为Invitrogen公司产品。
(2)筛选高拷贝高效表达细胞株将质粒rpPIC9KM1KP电转化毕赤酵母GS115，使其与酵母菌染色体发生重组，G418筛选高效表达细胞株。
筛选方法按照invitrogen说明书进行。
挑取上述阳性克隆接种于10ml低营养培养基BMGY〖1.34％YNB，(4×10-5)生物素，1％甘油，1％酵母提取物，2％蛋白胨〗中，30℃快速振遥(250 RPM)，培养过夜。次日测定光密度OD600，离心弃BMGY培液，用无菌水洗涤后用BMMY培液〖1.34％YNB，(4×10-5)生物素，0.5％甲醇，1％酵母提取物，2％蛋白胨〗稀释至OD600＝1。每天补加体积百分数为1％的甲醇两次，诱导培养3天，离心弃沉淀，上清于-20℃保存。直接取培液上清与2x上样缓冲液等体积混合后取20ul上样，作还原性SDS-PAGE电泳。考马斯亮蓝R-250染色后，PharmaciaImagenaster VDS扫描定纯度、分子量。可见诱导后上清液在分子量约8kd处有一浓集的条带，经扫描，目的蛋白约占上清总蛋白的60％；上述还原性SDS-PAGE按Laemmli方法进行。
(3)发酵表达工程细胞株按上述筛选高表达细胞株作为工程细胞株，然后以30L发酵罐进行高密度发酵。从-70℃深低温冰箱中取出种子菌，室温下解冻，在种子菌培养室100级洁净度条件下划YPD平板，30℃温箱培养2-3天。从平板上挑取单菌落，同样在100级洁净度条件下接种于10ml BMGY培养液中，30℃培养过夜，此为一级种子液。再将一级种子液加入1000ml培养液中，30℃培养6-8小时，直至OD600＝6，此为二级种子液。种子菌接入后，自然扩增，待基础培养基中预加的甘油被耗尽以后，开始补充甘油，补充速度16ml/L/h，待OD600达到120左右，停止补加甘油。待培养液中甘油全部耗尽后，开始甲醇诱导。甲醇补料速度从1ml/L/h逐渐升高至12ml/L/h，以后一直维持此速度。本发明的发酵技术是用低盐培养基扩增工程菌，诱导前用含微量元素的甘油溶液进行补料，到达一定菌体浓度后用含微量元素的甲醇溶液进行诱导表达。
甲醇诱导40h以后，停止发酵，从发酵罐中立即放出菌液进行离心，分离沉淀菌体，收集上清进行纯化。发酵参数为温度30℃，氧容量控制在35±5％，pH＝5，搅拌速度与DO连动。
(4)超滤浓缩脱盐将离心所获上清经Millipore超滤装置(NMWL3000，Millipore公司)超滤浓缩至0.4L。
(5)凝胶过滤Sephadex G-50(Pharmacia公司)柱用20mmol/L PB(pH6.0)平衡后，将超滤浓缩液上样，加样时注意勿搅动Sephadex G-50胶面。然后用PB洗脱，流速10ml/min，收集蛋白峰。
(6)Q-Sepharose Fast Flow柱层析以10倍体积的20mmol/L PB(pH6.0)平衡Q-Sepharose F.F.(Pharmacia公司)柱，凝胶过滤后收集的目的蛋白峰以50ml/min的速率将其吸附到Q-Sepharose F.F.柱上。用PB洗柱直至OD280达0.00，然后用0-1mol/L NaCl(20mmol/L PB pH6.0)线性梯度洗脱，收集蛋白峰，分装，冷冻干燥，-40℃保存。
(7)纯度鉴定及分子量测定样品进行15％SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝R-250染色后，PharmaciaInagemasterVDS扫描测定纯度、分子量。同时HPLC进一步鉴定纯度。所得产品纯度96％以上，分子量约8kD。
实施例3 M1KP的性质测定(1)抗胰蛋白酶与纤溶酶活性测定使用发色底物法测定，方法如下。
50nM的胰蛋白酶或30nM纤溶酶在15mM Tris-HCl(pH7.4)，100mM NaCl，5mM CaCl2，0.01％Tween 80中和不同浓度的M1KP 37℃孵育15分钟，加入终浓度为10mM的发色底物S-2251，37℃保温，测定405nm的吸光度。根据OD405判断剩余胰蛋白酶或纤溶酶的活性。结果见图3，可见M1KP具有明显的抑制胰蛋白酶和纤溶酶的活性(2)抗MMP-2和MMP-9活性的测定使用明胶酶谱法，方法如下。
配制含2mg/ml明胶的丙烯酰胺(15％)胶，乳腺癌细胞MDA-MB-435的培养基上清与2×的上样缓冲液等体积混合后在上述丙烯酰胺胶中电泳。电泳完毕用2.5％的TritonX-100/50mM Tris-HCl，pH7.5漂洗凝胶两次，每次30min。之后凝胶放在含不同浓度M1KP的0.15M NaCl，10mM CaCl2，50mM Tris-HCl，pH7.5，0.05％NaN3中37℃孵育16小时。取出凝胶后用SDS-PAGE染色液和脱色液分别进行染色和脱色。根据凝胶中产生的透明带的亮度判断培养基中剩余MMP-2和MMP-9的活性。结果见图4，可见M1KP具有明显的抑制MMP-2和MMP-9的作用。
(3)抗HT-1080纤维肉瘤侵袭活性的测定使用人工基底膜法测定，方法如下。200mg/filter的metrigel铺在Transwell小孔的上层，37℃保温使其凝固。不同浓度的M1KP溶于DMEM中，取100μL加入transwell的上层。纤维肉瘤细胞HT-1080用EDTA消化，取100μL(6×105细胞/ml)加入Transwell上层小孔中。下层加入600μL的无血清的HT-1080细胞培养液作为趋化剂。37℃培养20小时，取下小孔中的膜，用HE法染色。显微镜下观察穿到膜下层的细胞数。记数18个视野中的细胞总数，取平均数比较。结果见图5，表明M1KP具有良好的抑制纤维肉瘤侵袭的作用。
无需进一步详细阐述，相信采用前面所公开的内容，本领域技术人员可最大限度地应用本发明。因此，前面的优选具体实施方案应被理解为仅是举例说明，而非以任何方式限制本发明的范围。
从以上描述，本领域技术人员可很容易地明了本发明的本质特征，而且在不偏离其主旨和范围的情况下，可对本发明进行各种变更和改进。
SEQUENCE LISTING<110>复旦大学<120>一种新型Kunin型多肽及其制备方法<130>Fudan-20041116<160>5<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>207<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(1)..(207)<400>1gat gct gct cag gag cca aca gga aat aac gcg gag atc tgt ctc ctg 48Asp Ala Ala Gln Glu Pro Thr Gly Asn Asn Ala Glu Ile Cys Leu Leu1 5 10 15ccc cta gac tac gga ccc tgc cgg gcc cta ctt ctc cgt tac tac tac 96Pro Leu Asp Tyr Gly Pro Cys Arg Ala Leu Leu Leu Arg Tyr Tyr Tyr20 25 30gac agg tac acg cag agc tgc cgc cag ttc ctg tac ggg ggc tgc gag 144Asp Arg Tyr Thr Gln Ser Cys Arg Gln Phe Leu Tyr Gly Gly Cys Glu35 40 45ggc aac gcc aac aat ttc tac acc tgg gag gct tgc gac gat gct tgc 192Gly Asn Ala Asn Asn Phe Tyr Thr Trp Glu Ala Cys Asp Asp Ala Cys50 55 60tgg agg ata gaa taa 207Trp Arg Ile Glu65
<210>2<211>68<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>2Asp Ala Ala Gln Glu Pro Thr Gly Asn Asn Ala Glu Ile Cys Leu Leu1 5 10 15Pro Leu Asp Tyr Gly Pro Cys Arg Ala Leu Leu Leu Arg Tyr Tyr Tyr20 25 30Asp Arg Tyr Thr Gln Ser Cys Arg Gln Phe Leu Tyr Gly Gly Cys Glu35 40 45Gly Asn Ala Asn Asn Phe Tyr Thr Trp Glu Ala Cys Asp Asp Ala Cys50 55 60Trp Arg Ile Glu65<210>3<211>207<212>DNA<213>毕赤酵母(Pichia pastoris)<220>
<221>CDS<222>(1)..(207)<400>3gat gct gct caa gaa cca act ggt aat aac gct gag atc tgt ttg ttg 48Asp Ala Ala Gln Glu Pro Thr Gly Asn Asn Ala Glu Ile Cys Leu Leu1 5 10 15cca ttg gat tac ggt cct tgt aga gct ctt ttg ttg aga tac tac tac 96Pro Leu Asp Tyr Gly Pro Cys Arg Ala Leu Leu Leu Arg Tyr Tyr Tyr
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<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>5Asp Ala Ala Gln Glu Pro Thr Gly Asn Asn Ala Glu Ile Cys Leu Leu1 5 10 15Pro Leu Asp Tyr Gly Pro Cys Arg Ala Leu Leu Leu Arg Tyr Tyr Tyr20 25 30Asp Arg Tyr Thr Gln Ser Cys Arg Gln Phe Leu Tyr Gly Gly Cys Glu35 40 45Gly Asn Ala Asn Asn Phe Tyr Thr Trp Glu Ala Cys Asp Asp Ala Cys50 55 60Trp Arg Ile Glu6权利要求
1.一种新型kunin型多肽，命名为M1型kunin多肽，M1KP，其特征在于所述M1KP具有序列5的氨基酸序列，由68个氨基酸残基组成，其中有6个半胱氨酸残基(C)，组成3对二硫键。
2.根据权利要求1所述的新型kunin型多肽，其特征在于所述6个半胱氨酸残基组成的3对二硫键，其第1个半胱氨酸残基以前的氨基酸残基数量和最后一个半胱氨酸残基以后的氨基酸残基数量可以发生任何数量上的变动。
3.根据权利要求1所述的新型kunin型多肽，其特征在于所述6个半胱氨酸残基的位置分别是C1/14、C2/23、C3/39、C4/47、C5/60和C6/64，所述位置可以随前13个氨基酸残基数量的多寡而相应变化。
4.根据权利要求1所述的新型kunin型多肽，其特征在于所述6个半胱氨酸残基组成3对二硫键的配对关系是C1-C6、C2-C4和C3-C5。
5.权利要求1所述的新型kunin型多肽的制备方法，其特征是包括下述步骤，M1KP经密码子偏好设计后，利用PCR方法合成经过优化后的M1KP的基因片段，然后与表达载体重组，转化相应的表达细胞，筛选高表达工程菌或工程细胞，工程菌或工程细胞经扩增，收集表达相，用分离纯化方法获得高纯度目的蛋白。
6.根据权利要求5所述的新型kunin型多肽的制备方法，其特征在于所述编码M1KP的密码子，其中真核细胞中编码M1KP的密码子具有序列1的核苷酸序列，酵母中编码M1KP的密码子具有序列2的核苷酸序列，其它细胞中编码M1KP的密码子序列是能编码相应氨基酸残基的任何密码子。
7.根据权利要求5的制备方法，其中所述的表达载体是原核或真核表达载体。
8.根据权利要求5的制备方法，其中所述的表达载体是pPIC9K。
9.根据权利要求5的制备方法，其中所述的表达细胞是原核或真核表达细胞。
10.根据权利要求5的制备方法，其中所述的表达细胞是毕赤酵母GS115。
11.根据权利要求5的制备方法，其中所述的分离纯化方式是超滤后，进行分子筛和离子交换层析。
12.权利要求1的新型kunin型多肽在制备抑制纤溶酶或胰蛋白酶或基质金属蛋白酶或组织因子药物中的用途。
13.权利要求1的新型kunin型多肽在制备抑制恶性肿瘤转移药物中的用途。
14.权利要求1的新型kunin型多肽在制备防止动脉粥样硬化斑块破裂药物中的用途。
全文摘要
本发明属生物技术领域，具体涉及一种新型kunin型多肽，命名为M1型kunin多肽，M1KP，本发明M1KP由68个氨基酸残基组成，其中有6个半胱氨酸残基(C)，组成3对二硫键。M1KP经密码子偏好设计后，利用PCR方法合成经过优化后的M1KP的基因片段，然后与表达载体重组，转化相应的表达细胞，筛选高表达工程菌或工程细胞。工程菌或工程细胞经扩增，收集表达相，应用分离纯化方法获得高纯度目的蛋白。获得的M1KP具有良好的抗纤溶酶、抗胰蛋白酶、抗基质金属蛋白酶和抗恶性肿瘤侵袭转移等作用。
文档编号C12N15/81GK1634986SQ200410084289
公开日2005年7月6日 申请日期2004年11月18日 优先权日2004年11月18日
发明者马端, 孔德升, 宋后燕 申请人:复旦大学