α型芋螺多肽及其应用的制作方法

专利名称：：α型芋螺多肽及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种a型芋螺多肽及其应用。
背景技术：
：芋螺属腹足纲软体动物，全世界约有500余种，遍布世界各暖海区，我国有芋螺100多种，主要分布在我国的西沙群岛、海南岛及台湾海域。芋螺多肽是由芋螺毒液管和毒囊内壁的毒腺所分泌，每种芋螺的毒液中含50-200个活性多肽，不同品种芋螺所含的活性肽各不相同，即使同种芋螺因海域不同，其毒素成分也可存在差异，理论上估计约存在5万多禾中不同活性的多月太(Mcintosh,J.M.，Jones，R.M.(2001).Conevenom—fromaccidentalstingstodeliberateinjection.Toxicon，39，1447-1451.Nelson,L.(2004).Venomoussnails:Oneslip,andyou'redead.Nature,429，798-799.)。芋螺多肽能特异性作用于乙酰胆碱等神经递质的各种受体亚型，以及钙、钠和钾等多种离子通道，不仅可以直接作为药物，还可以作为理想的分子模型用于开发新药的先导化合物。其中，"型芋螺多肽MVIIA已被FDA批准作为治疗HIV和晚期癌症痛的药物进入市场；从中国南海线纹芋螺中发现的S0-3也具有很强的镇痛活性(Daiqyetal.JNatProd2003，66(9)1，276-9;专利Zl00128525.4)。但上述两种芋螺多肽作用于中枢神经的N_型钙通道，给药方式为鞘内，不方便使用。a-芋螺多肽(a-CTX)属于芋螺多肽A超家族(按信号肽保守序列及二硫键排列模式芋螺多肽分为A，M，0，P，I，J，S，T等超家族)，特异作用于肌肉型及神经元型nAChRs。绝大多数a-芋螺多肽含12-18个氨基酸、两对二硫键(CCXmCXnC，连接方式为1_3，2_4)。根据m，n的数目不同，a-芋螺多肽细分为a3/5，a4/3，a4/4，a4/6，a4/7亚家族。目前发现某些a-芋螺多肽具有镇痛活性，其中a-芋螺多肽Vcl.1(GCCSDPRCNYDHPEIC0NH2)是来自维多利亚芋螺(Co皿sVictoriae)，由16个氨基酸组成，含两对二硫键(二硫键的排列方式为l-3，2-4)(Sandalletal.Biochemistry2003，42，6904-6911.)。研究表明Vcl.1在神经性疼痛动物模型中表现出了较好的镇痛活性并具有加速损伤神经恢复的作用(Satkunanathanetal.BrainRes2005，1059，149-158)，2006年已进入临床研究阶段。另一种a型芋螺多肽Rgla在动物模型中同样表现出镇痛作用。由此可见，a型芋螺多肽中存在某些具有较好镇痛活性的多肽，它们对于开发新一代神经性疼痛的治疗药物具有重要意义，而且这些多肽可以采用皮下、肌肉或腹腔等给药方式，大大方便了应用。根据神经损伤的病因、性质和程度不同，在临床上分为中枢神经疼痛和外周神经损伤所致的周围神经疼痛两大类。其中，中枢神经疼痛简称中枢痛，为中枢神经系统的疼痛传导通路发生损害或功能障碍而引起的原发性疼痛，常见于脊髓的创伤、脑血管疾病或多发性硬化症和肿瘤等。周围神经疼痛系外伤、缺血、压迫、感染、炎症或代谢等因素损伤外周神经所致，如幻肢痛、带状疱疹后神经痛、多发性神经炎、糖尿病性周围神经痛等。神经性疼痛的典型症状包括感觉异常、痛觉过敏和痛觉超敏等。临床上常用的药物主要有抗惊厥药(如莱提西酞、奥卡西平)、阿片类药(如吗啡)和各种抗抑郁药的联用，但是由于毒副作用以及长期用药带来的耐受性、成瘾性等问题，治疗效果不佳(Drayetal，BrJAnaesth.2008，101(1)，48-58;Gilronetal，ExpertOpinEmergDrugs.2007，12(1)，113-26.)。因此，发现新一代高活性、低耐受和非成瘾的镇痛药物十分必要。
发明内容本发明的目的是提供一种a型芋螺多肽及其应用。本发明提供的a型芋螺多肽为通式I所示的多肽；Xi-X^CCXg-X^-Xs-XgCX^^-Xs-Xg-Xio-Xii-Xi^-Xig-Xi^C-_p通式I通式I中&选自G、R中任意一个氨基酸或空缺；^选自G、N、K中任意一个氨基酸；^选自S、T、D、M中任意一个氨基酸；乂4选自N、R、I、F中任意一个氨基酸；Xs选自P、S、H中任意一个氨基酸；乂6选自A、F、D、T中任意一个氨基酸；^选自M、K、Y、P、N中任意一个氨基酸；Xs选自L、R、N、1中任意一个氨基酸；Xg选自K、I、D、Y中任意一个氨基酸；&。选自Y、N中任意一个氨基酸；Xn选自P、R、S、K中任意一个氨基酸；乂12选自N、D、E、R、L中任意一个氨基酸；X13选自L、Q、F中任意一个氨基酸或空缺；X14选自N、Y中任意一个氨基酸或空缺；|3选自酰胺基、或羧基；上述字母定义如下D-天冬氨酸；E-谷氨酸；1_异亮氨酸；K_赖氨酸；L_亮氨酸；M-蛋氨酸；N-天冬酰胺；Q-谷氨酰胺；R-精氨酸；S_丝氨酸；T_苏氨酸；G_甘氨酸；F_苯丙氨酸；P-脯氨酸；H-组氨酸；A-丙氨酸；Y_酪氨酸。所述多肽具体可为如下七种多肽中的任意一种多肽I:氨基酸序列如序列表的序列7所示，且最后一位氨基酸残基酰胺化；多肽II:氨基酸序列如序列表的序列8所示，且最后一位氨基酸残基酰胺化；多肽III:氨基酸序列如序列表的序列9所示，且最后一位氨基酸残基酰胺化；多肽IV:氨基酸序列如序列表的序列10所示，且最后一位氨基酸残基酰胺化；多肽V:氨基酸序列如序列表的序列11所示，且最后一位氨基酸残基酰胺化；多肽VI:氨基酸序列如序列表的序列12所示，且最后一位氨基酸残基酰胺化；多肽VII:氨基酸序列如序列表的序列13所示。7个多肽的氨基酸序列如下多肽Tl:NH2-GCCSNPACMLKNPNLC-CONH2;多肽T2:NH2-NCCTRSFCKRIYPDLC-CONH2;多肽T3:NH2-GCCDIPDCYNKNREQC-CONH2;多肽T4:NH2-NCCMFHTCPIDYSRFNC-CONH2;多肽T5:NH2-GNCCMFHTCPIDYSRFNC-CONH2;多肽T6:NH2-GNCCMFHTCPIDYSRFYC-CONH2;多肽T7:NH2-RKCCSNPACNRYNKLC-COOH。所述多肽II的制备方法具体如下化学合成氨基酸序列如序列表的序列8所示且最后一位氨基酸残基酰胺化的线性多肽，溶解于0.1M的NH4HC03缓冲液中，用氨水调节pH值为8.2，磁力搅拌24-48h，得到多肽II。所述多肽III的制备方法具体如下化学合成氨基酸序列如序列表的序列9所示且最后一位氨基酸残基酰胺化的线性多肽，溶解于0.1M的NH4HC03缓冲液中，用氨水调节pH值为8.2，磁力搅拌24-48h，得到多肽III。所述多肽IV的制备方法具体如下化学合成氨基酸序列如序列表的序列IO所示且最后一位氨基酸残基酰胺化的线性多肽，溶解于0.1M的NH4HC03缓冲液中，用氨水调节pH值为8.2，磁力搅拌24-48h，得到多肽IV。所述多肽V的制备方法具体如下化学合成氨基酸序列如序列表的序列11所示且最后一位氨基酸残基酰胺化的线性多肽，溶解于0.1M的NH4HC03缓冲液中，用氨水调节PH值为8.2，磁力搅拌24-48h，得到多肽V。所述多肽VI的制备方法具体如下化学合成氨基酸序列如序列表的序列12所示且最后一位氨基酸残基酰胺化的线性多肽，溶解于0.1M的NH4HC03缓冲液中，用氨水调节pH值为8.2，磁力搅拌24_48h，得到多肽VI。所述多肽I的制备方法具体如下化学合成氨基酸序列如序列表的序列7所示且最后一位氨基酸残基酰胺化的线性多肽，置于pH7.70.1MTris-HCl缓冲液中氧化28h，然后加入醋酸终止反应，脱盐冻干，然后与lOmM碘溶液避光反应lOmin，得到多肽I。所述多肽VII的制备方法具体如下化学合成序列表的序列13所示的线性多肽，置于pH7.70.1MTris-HCl缓冲液中氧化28h，然后加入醋酸终止反应，脱盐冻干，然后与lOmM碘溶液避光反应10min，得到多肽VII。所述多肽的编码基因也属于本发明的保护范围。所述多肽的编码基因具体可为如下七种DNA片段中的任意一种(1)序列表的序列1自5'端第142至189位核苷酸所示的DNA分子(2)序列表的序列2自5'端第142至189位核苷酸所示的DNA分子(3)序列表的序列3自5'端第133至180位核苷酸所示的DNA分子(4)序列表的序列4自5'端第139至189位核苷酸所示的DNA分子(5)序列表的序列5自5'端第136至189位核苷酸所示的DNA分子(6)序列表的序列6自5'端第136至189位核苷酸所示的DNA分子(7)序列表的序列7自5'端第133至180位核苷酸所示的DNA分子。本发明还保护一种用于镇痛的药物，其活性成分为以上任一所述的多肽。以上任一所述的多肽在制备用于镇痛的药物中的应用也属于本发明的保护范围。本发明还保护一种镇痛剂，为以上任一所述的多肽。以上任一所述的多肽或均可应用于制备镇痛剂。上述a型芋螺多肽可采用Fmoc法固相合成，用高效液相色谱技术纯化。经过活性测定发现通式I的7个多肽具有镇痛作用，其中a芋螺多肽T-l、T_2、T-3、T-4具有显著的镇痛活性，T5-T7也有明显镇痛活性，在抑制镇痛方面具有应用价值c所述的a型芋螺多肽的衍生物也属于本发明的保护范围。所述的a型芋螺多肽的衍生物可为如下(1)、(11)、(III)或(IV):(I)将所述a型芋螺多肽进行一个或多个氨基酸的插入和/或替换和/或缺失，得到的a型芋螺多肽的衍生物；(II)将所述a型芋螺多肽或(I)a型芋螺多肽的衍生物进行环化、脂化或PEG化修饰，得到的a型芋螺多肽的衍生物；(III)将所述a型芋螺多肽或(I)a型芋螺多肽的衍生物与载体联接，得到的a型芋螺多肽的衍生物；(IV)将一个或几个所述a型芋螺多肽或(I)a型芋螺多肽的衍生物连接为多聚体，得到的a型芋螺多肽的衍生物。所述的a型芋螺多肽中，可对侧链氨基酸进行修饰，这些残基的修饰可以增强肽的生物活性或者靶向的选择性。所述取代还可以是"保守性取代"或"非保守性取代"。取代可以是一个氨基酸的取代，也可以是多个氨基酸的取代，可以是连续的取代，也可以是分散的取代。"保守性取代"将所述的a型芋螺多肽中的一个或多个氨基酸残基用构象为D-型的氨基酸、自然界存在的稀有氨基酸或人工修饰的氨基酸替换，以增加生物利用度及提高抑制活性；D-型的氨基酸指与组成蛋白质的L-型的氨基酸相对的氨基酸；自然界存在的稀有氨基酸包括组成蛋白质的不常见氨基酸和不组成蛋白质的氨基酸，如5_羟基赖氨酸、甲基组氨酸、Y_氨基丁酸、高丝氨酸等；人工修饰的氨基酸指经过甲基化，磷酸化等修饰的组成蛋白质的常见L-型氨基酸。"非保守性取代":多肽中的一个氨基酸或多个氨基酸残基被不同性质的氨基酸所取代，或者被非常规氨基酸所取代。所述添加，可以是一个氨基酸或者多个天然的或者非常规的氨基酸。所述缺失，也包括一个或者多个氨基酸的缺失。所述载体包括但是不局限于蛋白质、聚乙二醇、脂类物质等。几个(1-4个)相同的a型芋螺多肽可通过氨基酸，如赖氨酸、半胱氨酸，或者其他的分子连接在一起形成多聚体。所述药物中还可含有阿片受体拮抗剂、阿片受体部分激动剂、去甲肾上腺素受体拮抗剂、a2去甲肾上腺素受体激动剂、胆碱能神经拮抗剂、钙通道阻断剂或NMDA受体拮抗剂中的任意一种或几种，以增强其镇痛的效果。所述药物中可添加药剂学可接受的辅料，制成针剂、口服剂、直肠体给药剂或皮肤吸收剂等不同剂型。本发明的a型芋螺多肽具有以下特点1、本发明的a型芋螺多肽具有很强的镇痛活性，其中T-2、T-3、T-4四个肽在肌肉注射剂量在很低的情况下(10nmol/kg)既可使痛阈率提高40%以上，T_l可使痛阈率提高80%以上，T-5、T-6、T-7也可使痛阈提高20%以上。2、本发明的a型芋螺多肽来自中国南海芋螺，具有全新的氨基酸组成，与目前报道的a型芋螺多肽在氨基酸组成上具有显著差异。3、本发明的a型芋螺多肽作用于外周神经系统，给药方式为皮下、肌肉或腹腔注射，与现有的镇痛药物MVIIA的鞘内给药方式相比，应用更便利。图1为T-2、T-3、T-4、T-5、T-6禾PVcl.1折叠24h后的色谱分析图；A:T_2折叠B:T-3折叠图；C:T-4折叠图；D:T_5折叠图；E:T_6折叠图；F:Vcl.1折叠图。图2为T-l、T-7第一步折叠和第二步折叠后的色谱分析图；A:T_1第一步氧化折叠图；B:T-l第二步氧化折叠图；C:T_7第一步氧化折叠图；D:T_7第二步氧化折叠图。图3为T-l、T-2、T-3、T-4、T-5、T-6、T-7、Vcl.1多肽纯化后的色谱分析图；A:T_1纯化分析图；B:T-2纯化分析图；C:T-3纯化分析图；D:T-4纯化分析图；E:T_5纯化分析图；F:T-6纯化分析图；G:T_7纯化分析图；H:Vcl.1纯化分析图。图4为T-l、T-2、T-3、T-4、T-5、T-6、T-7、Vcl.1多肽的镇痛活性。具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例1、a型芋螺多肽的发现1、芋螺总RNA的提取从西沙群岛、海南三亚等地采集6种芋螺活体作为样本材料，分别采用Trizol法提取6种芋螺的总RNA。6种芋螺大理石芋螺(Conusmarmoreus)、堂皇芋螺(Co皿simperialis)、信号芋螺(Co皿slitteratus)、黑心芋螺(Co皿semaciatus)、少女芋螺(Co皿seberneus)、小牛芋螺(Co皿svituli皿s)。Trizol法提取总RNA的具体步骤①先于冰上取芋螺毒腺管，将其置于液氮中冷冻并用研磨器研成粉末，倒入事先冰浴的微量匀浆器中。②吸取1.2mlTrizol加入匀浆器并进一步研磨使芋螺组织裂解释放RNA。③将研磨好的浆液倒入1.5ml的离心管中，室温静置5min。加入20%氯仿240iU，剧烈震荡15s后，放于冰上10min。⑤4t:、12000rpm离心15min，小心转移上清到一新的离心管中，加入高盐沉淀液250iil、异丙醇250iU，反复颠倒30次左右，再放于冰上10min。⑥4。C、12000rpm，离心10min，弃去上清。⑦加入1.2ml75X乙醇混匀，4。C、9045rpm离心5min。⑧弃去上清，空气中干燥10min，加入50-80iilDEPC溶解沉淀，溶液即为RNA溶液，于-8(TC保存备用。2、cDNA的合成采用大连TaKaRa公司的3'Full-RACE试剂盒(3'-FullRACECoreSetVer2.0)进行cDNA的合成，具体方法如下按下列比例混合样品RNaseFreeddH204.5ii183'RACEAdaptor(5iiM)1ii1RNA(l.5iigtotalRNA)1ii1混匀后，70。C变性10min，冰上急冷2min。上述反应溶液6.5ii1d證Mixture(10mMeach)1ii1RNaseInhibitor0.25ii1ReverseTranscriptaseM-MLV(RNaseH_)0.25ii15XM-MLVBuffer2ii1混匀后，42t:反应lh，7(TC反应15min，反应结束后的反转录产物于-2(rC保存。3、芋螺毒素cDNA的3'-RACE扩增以步骤2合成的cDNA为模板，根据芋螺多肽A超家族a芋螺多肽信号肽区域设计a-CTX外侧引物Fl和内侧引物F2，分别和3'-RACE外侧引物Rl，3'-RACE内侧引物R2进行巢式PCR。Fl:5'—ATGGGCATGCGGATGATGTTC-3，；F2:5'-CTGTTGGTTGTCTTGGCAACCAC-3';Rl:5'-TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT-3，；R2:5'-CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG-3'。具体步骤第一轮PCR反应体系包括反转录的cDNA模板3iil，1XcDNADilutionBufferII7ii1，上游引物Fl2ii1，3'-RACE夕卜侦U弓|物Rl2iU，10XLAPCRBufferII(Mg2+plus)5iil，TaKaRaLATaq(5U/ii1)0.25ii1，用灭菌的去离子水补齐总体积50ii1。进行PCR的循环条件为94t:预变性4分钟；94t:变性30秒，55。C退火30秒，72。C延伸50秒(桶形芋螺及密码芋螺为lmin)，30个循环，最后在72t:延伸10min，4t:保温。第二轮PCR反应体系包括第一轮PCR产物lii1，dNTPMixture(各2.5mM)8ii1，10XLAPCRBufferII(Mg2+plus)5ii1，3，-RACE内侧引物R22iU，下游引物F22iU，TaKaRaLATaq(5U/iU)0.5iU，用灭菌的去离子水补齐总体积50iU。进行PCR的循环条件为94t:预变性4分钟；94t:变性30秒，55t:退火30秒，72t:延伸50秒(桶形芋螺及密码芋螺为lmin)，30个循环，最后在72。C延伸10min，4。C保温。PCR产物取8iiL点样，扩增产物经1.0^琼脂糖凝胶电泳分离，在图像分析仪下紫外透射观察分析照相。4、PCR产物的克隆与测序用胶回收试剂盒回收上述特异PCR产物(300bp-800bp)与载体连接，6种PCR产物与pGM-T载体(TIANGEN生物公司)连接；转化大肠杆菌DH5a，利用氨苄青霉素抗性挑选单克隆，37°C、220rpm进行摇菌，再通过PCR法挑选阳性克隆进行测序，PCR反应体系为反应菌液1i！1，3'-RACE内侧引物R2lyl，下游引物F2lyl，2XTaqPCRMasterMix(TIANGEN生物公司)12.5iU，ddH209.5ii1，总反应体系为25y1，反应条件同第二轮PCR的循环条件，阳性克隆进行测序，经过序列的分析和比对，获得了本发明所述通式I的新型a芋螺多肽序列。通式I的新型a芋螺多肽序列是根据前肽及芋螺毒素特点推测而来，前肽是根据前体基因推测而来。6种a芋螺多肽前肽序列见表1，6种a芋螺多肽前肽编码的多核苷9酸序列见表2。表l前肽序列<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>见序列表的序列7实施例2、a型芋螺多肽的合成分别合成表3所示的七种多肽。表3a型芋螺多肽的氨基酸序列<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>D-天冬氨酸；E-谷氨酸；1-异亮氨酸；K-赖氨酸；L_亮氨酸；M_蛋氨酸；N_天冬酰胺；Q-谷氨酰胺；R-精氨酸；S-丝氨酸；T_苏氨酸；G_甘氨酸；F_苯丙氨酸；P_脯氨酸；H-组氨酸；A-丙氨酸；Y-酪氨酸。T-l和T-7，每个多肽中二硫键连接方式均为C1_C3，C2-C4。*表示酰胺化(C0NH2)。—、多肽(—)T-l的合成(采用Fmoc方法人工合成)1、肽树脂的合成使用固相合成技术。在433A多肽合成仪(ABI美国应用系统生物公司仪器)上进行。使用的氨基酸为Fmoc氨基酸(美国AdvancedChemtech公司产品)，使用的树脂为Rink树脂(美国AdvancedChemtech公司产品)和Wang树脂(美国AdvancedChemtech公司产品)，使用的试剂包括DCC(Acros公司产品)、H0Bt(美国AdvancedChemtech公司产品)、NMP(PE公司产品)、哌啶(上海吉尔生化产品)、甲醇(国产分析纯)和二氯甲烷(国产分析纯)。Fmoc氨基酸的侧链保护基分别如下His、Cys、Asn、Gln的侧链保护基为三苯甲基(-Trt);Cys的侧链保护基为三苯甲基(-Trt)或Acm，以利于分步氧化；Arg的侧链保护基为9-苯基芴甲基(-Pbf);Trp的侧链保护基为叔丁氧羰基(-Boc);Ser、Tyr的侧链保护基为叔丁基(-tBu);Asp、Glu、Try的侧链保护基为叔丁氧基(-0tBu)。羧基化或者酰胺化由采用的树脂决定的，T7用的是王树脂，Tl至T6用的是Rink树脂，所以T7末端羧基化，Tl至T6末端酰胺化。反应体系中，树脂与氨基酸的摩尔比为1:5，每次合成0.lmmol肽树脂(带有侧链保护基)。2、肽树脂的裂解将步骤1获得的带有侧链保护基的肽树脂(0.lmmol)加入10ml裂解液中进行裂解；常温下裂解3h后，蒸去大部分三氟乙酸，然后加入冷乙醚进行沉淀，过滤，所得沉淀用5%(质量百分含量)乙酸溶解，然后冻干，得到多肽T-1(粗肽)。裂解液的组成88体积份三氟乙酸(TFA)、5体积份H20、2体积份三异丙基硅烷和115体积份二巯基苏糖醇(DTT)。(二)其它多肽的合成方法同T-1的合成，分别得到多肽T-2、T-3、T-4、T-5、T-6、T-7。二、多肽的折叠和富集色谱分析条件C_18，Calesil0DS-100(PromptarCompany);5iim，。4.6X250mm;柱温25。C;上样量100ii1;流速lml/min;检测波长214nm;梯度(在每个时间段，为线性梯度洗脱):0-lmin，乙月青0%-5%;l-25min，乙月青5%-70%;25-28min，乙腈70%-80%。1、多肽的折叠(1)—步折叠法(空气氧化法)T-2、T-3、T-4、T-5、T-6采用一步折叠法，步骤如下取40mg步骤一获得的多肽，溶解于300ml0.1M的NH4HC03缓冲溶液中，用氨水调节pH值为8.2，室温下磁力搅拌24_48h。折叠结束后，用冰醋酸调节pH值至5，终止反应，进行色谱分析。[OH4](2)两步折叠法T-l、T-7采用两步折叠法，先用Acm保护线性肽中的一对巯基，用空气氧化法氧化另外一对二硫键，然后再用碘氧化法除去Acm基，形成剩下的一对二硫键。两步折叠法具体步骤如下(1)第一步氧化折叠0.1MTris-HCl缓冲溶液(pH7.7)中折叠氧化28h，HPLC监测反应进程，反应结束后加入少量醋酸终止反应，富集脱盐冻干，纯化后用去离子水溶解后进行下一步折叠；(2)第二步氧化折叠10mM碘溶液与0.4mg/mL步骤(1)的产物等体积混合，避光反应10min，然后加入适量的抗坏血酸溶液终止反应，HPLC分析，富集，冻干。T-2、T-3、T-4、T_5、T_6折叠24h后的色谱分析图如图1所示；A为T_2折叠24h后的色谱分析图，B为T-3折叠24h后的色谱分析图，C为T-4折叠24h后的色谱分析图，D为T-5折叠24h后的色谱分析图，E为T-6折叠24h后的色谱分析图。T_l、T_7第一步和第二步氧化折叠后的色谱分析图如图2所示；A为T-l第一步折叠后的色谱分析图，B为T-l第二步折叠后的色谱分析图，C为T-7第一步折叠后的色谱分析图，D为T-7第二步折叠后的色谱分析图。多肽T-1的第一步折叠的保留时间为17.828min，第二步折叠的保留时间为17.699;多肽T-2的保留时间为17.288min;多肽T_3的保留时间为10.654min;多肽T-4的保留时间为15.390min;多肽T_5的保留时间为15.198min;多肽T_6的保留时间为15.656min;多肽T-7的第一步折叠的保留时间为11.266min，第二步折叠的保留时间为11.653。2、多肽富集取300ml步骤1得到的Tl多肽溶液用WatersDeltaPr印4000HPLC富集。制备柱(C18，Nucleosil，25mmX100mm，大连物化所)。上样速度为2.5ml/min;上样结束后用水(含0.1%TFA)脱盐，水的体积为两个柱体积(约140ml)，流速4ml/min;然后用90%乙腈(含O.1%TFA)和10%水(含O.1%TFA)洗脱，流速5ml/min，收集洗脱液，214nm下进行检测。将收集到的洗脱液旋转蒸发去掉大部分乙腈，冻干后得到70mg多肽Tl(粗肽)。采用相同的方法分别得到T_2、T_3、T_4、T_5、T_6、T_7的粗肽。三、多肽的纯化(HPLC法)多肽的纯化中多肽T-lT-7的保留时间为10-14min之间。多肽的分析中多肽T-1的保留时间为17.675min;多肽T-2的保留时间为11.631min;多肽T-3的保留时间为10.669min;多肽T-4的保留时间为15.133min;多月太T-5的保留时间为14.889min;多肽T-6的保留时间为15.504min;多肽T-7的保留时间为11.554min。1、多肽的纯化取30mg步骤二制备的Tl粗肽，使用反相HPLC进行纯化。以水和乙腈(分别含0.1X体积百分含量的TFA)为流动相，采用梯度洗脱的方法，用C-18半制备柱制备。液相HPLC条件如下半制备柱C-18，Kromasil，10m，10.0X250mm;f克速3ml/min;检测波长214nm;柱温25。C;梯度(在每个时间段，为线性梯度洗脱)0-lmin，乙腈5%-10%;l-25min，乙腈10%-40%;25-28min，乙腈40%-100%;上样量2mg。收集目标峰，蒸去大部分乙腈，冻干后得到8mg多肽Tl(纯肽)。2、多肽的分析对得到Tl的纯肽采用HPLC法进行分析，分析纯肽的HPLC条件如下分析柱C-18，CalesilODS-IOO，5iim，4.6X250mm;柱温25。C;上样量100ill;流速lml/min;检测波长214nm;梯度(在每个时间段，为线性梯度洗脱)0-lmin，乙腈0%_5%;l-25min，乙腈5%-70%;25-28min，乙腈70%-80%;上样量20ug。采用相同的方法分别得到T-2、T-3、T-4、T_5、T_6、T_7的纯肽。T-l、T-2、T-3、T-4、T-5、T-6、T-7的色谱分析图如图3所示。其中，A为T-1的色谱分析图，B为T-2为的色谱分析图，C为T-3的色谱分析图，D为T-4的色谱分析图，E为T-5的色谱分析图，F为T-6的色谱分析图，G为T-7的色谱分析图。结果表明，采用HPLC法纯化后获得的T-l、T-2、T-3、T-4、T-5、T-6、T-7纯度为70-90%。实施例3、a型芋螺多肽的镇痛活性测定—、a-芋螺多肽Vcl.1的制备a-芋螺多肽Vcl.1:GCCSDPRCNYDHPEICONH2。1、肽树脂的合成使用固相合成技术。在433A多肽合成仪(ABI美国应用系统生物公司仪器)上进行。合成使用的氨基酸为Fmoc保护氨基酸(美国AdvancedChemtech公司产品)，使用的树脂为Rink树脂(美国AdvancedChemtech公司产品)，使用的试剂包括DCC(Acros公司)、H0Bt(美国AdvancedChemtech公司产品)、NMP(PE公司)、哌啶(上海吉尔生化)、甲醇(国产分析纯)和二氯甲烷(国产分析纯)。Fmoc氨基酸的侧链保护基分别如下His、Cys的侧链保护基为三苯甲基(_Trt)，Arg的侧链保护基为9-苯基芴甲基(-Pbf)、Trp的侧链保护基为叔丁氧羰基(-Boc)，Ser、Tyr的侧链保护基为叔丁基(-tBu)，Asp、Glu的侧链保护基为叔丁氧基(-OtBu)。反应体系中，树脂与氨基酸的摩尔比为1:5，每次合成0.lmmol肽树脂(带有侧链保护基)。2、肽树脂的裂解将步骤1获得的带有侧链保护基的肽树脂(0.lmmol)加入10ml裂解液中进行裂解；常温下裂解3h后，蒸去大部分三氟乙酸，然后加入冷乙醚进行沉淀，过滤，所得沉淀用5%(质量百分含量)乙酸溶解，然后冻干，得到多肽Vcl.l(粗肽)。裂解液的组成88体积份三氟乙酸(TFA)、5体积份H20、2体积份三异丙基硅烷和5体积份二巯基苏糖醇(DTT)。3、多肽的折叠和富集色谱分析条件KromasilC-18(北京分析仪器厂)分析柱，5ym，①4.6X250mm;柱温25°C;上样量100iU;流速lml/min;检测波长214nm;梯度l-30min，乙腈5%-60%(线性梯度洗脱)。(1)多肽的折叠采用空气氧化法，取90mg步骤2获得的多肽Vcl.1，溶解于300ml0.1M的NH4HC03缓冲液中，用氨水调节PH值为8.5，室温下磁力搅拌24-48h。折叠结束后，用冰醋酸调节pH值至3.5，终止反应，进行色谱分析。Vcl.l折叠24h后的色谱分析图如图1F所示。图中主峰为目标多肽Vcl.l(保留时间为14.365min)。(2)多肽的富集使用制备液相富集折叠后的多肽溶液，具体操作步骤如下在waters300E半制备液相系统中，制备柱(C_18，15iim，①25XlOmm(预柱)+①25X100mm)，用1120平衡两个柱体积(5ml/min，20min)后，缓慢进样(2.5ml/min)，用H^洗脱两个柱体积(2.5ml/min，40min以上)以洗脱掉盐及其他小分子物质，再用60%的乙腈进行等梯度洗脱(5ml/min)，监测214nm处的吸光度，接收多肽目标峰，最后用100%的乙腈保存C18柱。收集的多肽溶液，冻干后得到Vcl.1(粗肽)。4、HPLC法纯化(1)多肽的纯化取30mg步骤3制备的Vcl.1初肽，使用反相HPLC进行纯化，以水及乙腈(分别含0.1X体积百分含量的TFA)为流动相，采用梯度洗脱的方法，用C-18半制备柱制备。液相HPLC条件如下半制备柱:Zorabx300SB，C_18，10m，①9.4X250m;14流速3ml/min;检测波长:214nm;柱温25°C;梯度(在每个时间段，为线性梯度洗脱)0-lmin，0-5X体积百分含量乙腈；1-30min，5%_60%体积百分含量乙腈；30-32min，60%_100%体积百分含量乙腈；上样量2mg。收集目标峰(保留时间为13-15min)，蒸去大部分乙腈，冻干后得到6mgVcl.1纯(2)多肽的分析对Vcl.1的纯肽采用HPLC法进行分析，分析纯肽的HPLC条件如下分析柱KromasilC-18柱(北京分析仪器厂)，5iim，①4.6X250mm;流速lml/min;检测波长:214nm;柱温25°C;梯度(在每个时间段，为线性梯度洗脱)0-lmin，0-5X体积百分含量乙腈；1-30min，5%_60%体积百分含量乙腈；30-32min，60%_100%体积百分含量乙腈；上样量50ug。Vcl.1的色谱分析图如图3H所示(保留时间为14.465min)。结果表明，采用HPLC二、构建大鼠坐骨神经半切模型利用大鼠坐骨神经半切模型作为镇痛模型。该模型是对大鼠坐骨神经直接穿剌造成伤害，可诱发强烈的机械痛敏，动物极少出现自噬，可以较好的模拟神经源性疼痛，同时手术过程简单快捷，是一种良好镇痛模型。SD大鼠，$，体重200-220g，由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供。参照文献(Seltzeretal.Pain，Anovelbehavioralmodelofneuropathicpaindisordersproducedinratsbypartialsciaticnerveinjury.1990，43，205-218.)的方法构建坐骨神经半切模型大鼠。具体步骤如下大鼠在麻醉及无菌操作下在股段高位暴露右侧坐骨神经，在25倍放大镜下，在坐骨神经干向后二头肌和半腱肌分支处的远端小心地将神经背侧与周围组织分离开来，用小止血钳夹住神经背侧，将一条6-0号硅制丝线缝入神经干内，使神经的背侧3/1-2/1被收在线套内，然后扎紧线套。肌肉和皮肤均用棉线缝合。手术七天后使用Ugo37215型压痛仪测试大鼠痛阈值，痛阈值下降50%以上者视为建模成功大鼠。二、利用大鼠坐骨神经半切模型测定a型芋螺多肽对大鼠的镇痛活性1、T-l、T_4、T_5、T_6的镇痛活性将建模成功的大鼠分成6组，每组8只，第一组至第四组分别肌肉注射3翻l(0.2mL)上述实施例2获得的a型芋螺毒素T-l、T-4、T-5、T-6，第五组(阳性对照)注射3翻lVcl.1(0.2mL)，第六组(阴性对照)注射0.2mL生理盐水。给药2.5-3h后，测试大鼠给药前后痛阈值的变化。实验设三次重复，痛阈值取8只大鼠三次重复实验的平均值。各实验组大鼠痛阈值提高率见表4。表4a型芋螺多肽的镇痛效果<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>2、T-2、T-3、T-7的镇痛活性将建模成功的大鼠分成5组，每组6只，第一组至第三组分别肌肉注射3nmo1(0.2mL)上述实施例2获得的a型芋螺毒素T_2、T_3、T_7，第四组(阳性对照)注射3nmo1Vcl.1(0.2mL)，第五组(阴性对照)注射0.2mL生理盐水。给药2.5_3h后，测试大鼠给药前后痛阈值的变化。实验设三次重复，痛阈值取6只大鼠三次重复实验的平均值。各实验组大鼠痛阈值提高率见表5。表5a型芋螺多肽的镇痛效果<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>不同a型芋螺毒素的镇痛活性结果如图4所示。图4中，纵坐标为大鼠肌肉给药2.5-3h后痛阈值的提高率，横坐标表示不同的a型芋螺多肽。镇痛结果表明，在相同的剂量下，与生理盐水组相比，T-l、T-2、T-3、T-4、T_5、T_6、T_7均显著的提高了大鼠的痛阈值。T-l、T-2、T-3、T-4的镇痛活性显著高于对照肽Vcl.1。当给药量为3nmo1时，T-1可使大鼠的痛阈值提高80.4士16.0X，比Vc1.1(34.3±6.1%)的镇痛效果提升了约134%，T_2可使大鼠痛阈值提高40.9±11.1%，T-3可使大鼠痛阈值提高46.8±10.3%，T_4可使大鼠痛阈值提高58.9±8.5%。T-5可使大鼠痛阈值提高26.9±5.9%，T_6可使大鼠痛阈值提高20.6±4.7%，T-7可使大鼠痛阈值提高26.6±7.2%。权利要求通式I所示的多肽；X1-X2CCX3-X4-X5-X6CX7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14C-β通式I通式I中X1选自G、R中任意一个氨基酸或空缺；X2选自G、N、K中任意一个氨基酸；X3选自S、T、D、M中任意一个氨基酸；X4选自N、R、I、F中任意一个氨基酸；X5选自P、S、H中任意一个氨基酸；X6选自A、F、D、T中任意一个氨基酸；X7选自M、K、Y、P、N中任意一个氨基酸；X8选自L、R、N、I中任意一个氨基酸；X9选自K、I、D、Y中任意一个氨基酸；X10选自Y、N中任意一个氨基酸；X11选自P、R、S、K中任意一个氨基酸；X12选自N、D、E、R、L中任意一个氨基酸；X13选自L、Q、F中任意一个氨基酸或空缺；X14选自N、Y中任意一个氨基酸或空缺；β选自酰胺基或羧基；上述字母定义如下D-天冬氨酸；E-谷氨酸；I-异亮氨酸；K-赖氨酸；L-亮氨酸；M-蛋氨酸；N-天冬酰胺；Q-谷氨酰胺；R-精氨酸；S-丝氨酸；T-苏氨酸；G-甘氨酸；F-苯丙氨酸；P-脯氨酸；H-组氨酸；A-丙氨酸；Y-酪氨酸。2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于所述多肽为如下七种多肽中的任意一种多肽I:氨基酸序列如序列表的序列7所示，且最后一位氨基酸残基酰胺化；多肽II:氨基酸序列如序列表的序列8所示，且最后一位氨基酸残基酰胺化；多肽III:氨基酸序列如序列表的序列9所示，且最后一位氨基酸残基酰胺化；多肽IV:氨基酸序列如序列表的序列10所示，且最后一位氨基酸残基酰胺化；多肽V:氨基酸序列如序列表的序列11所示，且最后一位氨基酸残基酰胺化；多肽VI:氨基酸序列如序列表的序列12所示，且最后一位氨基酸残基酰胺化；多肽VII:氨基酸序列如序列表的序列13所示。3.如权利要求2所述的多肽，其特征在于所述多肽II的制备方法如下化学合成氨基酸序列如序列表的序列8所示且最后一位氨基酸残基酰胺化的线性多肽，溶解于0.1M的NH4HC03缓冲液中，用氨水调节pH值为8.2，磁力搅拌24-48h，得到多肽I1;所述多肽III的制备方法如下化学合成氨基酸序列如序列表的序列9所示且最后一位氨基酸残基酰胺化的线性多肽，溶解于0.1M的NH4HC03缓冲液中，用氨水调节pH值为8.2，磁力搅拌24_48h，得到多肽III;所述多肽IV的制备方法如下化学合成氨基酸序列如序列表的序列10所示且最后一位氨基酸残基酰胺化的线性多肽，溶解于0.1M的NH4HC03缓冲液中，用氨水调节pH值为8.2，磁力搅拌24-48h，得到多肽IV;所述多肽V的制备方法如下化学合成氨基酸序列如序列表的序列11所示且最后一位氨基酸残基酰胺化的线性多肽，溶解于0.1M的NH4HC03缓冲液中，用氨水调节pH值为8.2，磁力搅拌24_48h，得到多肽V;所述多肽VI的制备方法如下化学合成氨基酸序列如序列表的序列12所示且最后一位氨基酸残基酰胺化的线性多肽，溶解于0.1M的NH4HC03缓冲液中，用氨水调节pH值为8.2，磁力搅拌24_48h，得到多肽VI。4.如权利要求2所述的多肽，其特征在于所述多肽I的制备方法如下化学合成氨基酸序列如序列表的序列7所示且最后一位氨基酸残基酰胺化的线性多肽，置于pH7.70.1MTris-HCl缓冲液中氧化28h，然后加入醋酸终止反应，脱盐冻干，然后与lOmM碘溶液避光反应10min，得到多肽I;所述多肽VII的制备方法如下化学合成序列表的序列13所示的线性多肽，置于pH7.70.1MTris-HCl缓冲液中氧化28h，然后加入醋酸终止反应，脱盐冻干，然后与lOmM碘溶液避光反应lOmin，得到多肽VII。5.权利要求1至4中任一所述多肽的编码基因。6.如权利要求5所述的基因，其特征在于所述多肽的编码基因为如下七种DNA片段中的任意一种(1)序列表的序列1自5'端第142至189位核苷酸所示的DNA分子；(2)序列表的序列2自5'端第142至189位核苷酸所示的DNA分子；(3)序列表的序列3自5'端第133至180位核苷酸所示的DNA分子；(4)序列表的序列4自5'端第139至189位核苷酸所示的DNA分子；(5)序列表的序列5自5'端第136至189位核苷酸所示的DNA分子；(6)序列表的序列6自5'端第136至189位核苷酸所示的DNA分子；(7)序列表的序列7自5'端第133至180位核苷酸所示的DNA分子。7.—种用于镇痛的药物，其活性成分为权利要求1至4中任一所述的多肽。8.权利要求1至4中任一所述的多肽在制备用于镇痛的药物中的应用。9.一种镇痛剂，为权利要求1至4中任一所述的多肽。10.权利要求1至4中任一所述的多肽在制备镇痛剂中的应用。全文摘要本发明公开了一种α型芋螺多肽及其应用。本发明提供了七种多肽多肽I氨基酸序列如序列表的序列7所示，且最后一位氨基酸残基酰胺化；多肽II氨基酸序列如序列表的序列8所示，且最后一位氨基酸残基酰胺化；多肽III氨基酸序列如序列表的序列9所示，且最后一位氨基酸残基酰胺化；多肽IV氨基酸序列如序列表的序列10所示，且最后一位氨基酸残基酰胺化；多肽V氨基酸序列如序列表的序列11所示，且最后一位氨基酸残基酰胺化；多肽VI氨基酸序列如序列表的序列12所示，且最后一位氨基酸残基酰胺化；多肽VII氨基酸序列如序列表的序列13所示。经过活性测定发现通式I的7个多肽具有镇痛作用，其中α芋螺多肽T-1、T-2、T-3、T-4具有显著的镇痛活性，T5-T7也有明显镇痛活性，在镇痛方面具有应用价值。文档编号A61K38/10GK101792485SQ201010121879公开日2010年8月4日申请日期2010年3月10日优先权日2010年3月10日发明者于正,刘珠果,吴巧玲,孙婷,戴秋云,胡洁申请人:中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所