专利名称：一种制备人溶菌酶的方法
技术领域：
本发明属生物制药技术领域，涉及一种用基因工程重组技术生产人溶菌酶的方法。
与其他来源溶菌酶相比，人溶菌酶具有独特的优越性和多种药理作用，在临床上具有重要的应用价值。但天然人溶菌酶来源极其困难，利用重组DNA技术进行生产是解决这一难题的有效途径。
本项发明的目的在于建立一种适宜大批量生产纯化人溶菌酶的方法。
本项发明所采用的技术方法是利用基因重组技术，将人溶菌酶基因克隆入酵母菌体内进行表达，再经纯化、配制、冷冻干燥制得人溶菌酶成品。
具体技术方案如下1.获取人溶菌酶基因为了获得人溶菌酶基因，可以采用RT-PCR的方法，也可以采取全合成的方法。为了获得高水平表达，优选的方法是全基因合成方法，将部分密码子改变成酵母偏爱密码子。
2.表达系统酵母表达用宿主菌有许多。可以采用酿酒酵母或者甲醇酵母。优选的方法是采用选用毕赤酵母菌GS115。表达的形式可以是细胞内可溶表达，也可以是分泌表达。为了表达产物纯化的方便，优选的表达方式是分泌表达，为此，优选的真核表达载体是pPIC9。
3.表达产物纯化本项发明采用真核分泌型表达，发酵上清中除目的蛋白外的杂蛋白较少，纯化工艺简便易行，纯化效率高，并能最大限度地保持酶活，适宜大批量生产人溶菌酶。
以下的实施例及附图可使本专业技术人员更全面地理解本项发明。
实施例1.获取人溶菌酶基因全基因合成人溶菌酶基因，序列见附
图1。该基因编码序列全长390bp，选用酵母偏爱密码子。
实施例2.重组质粒构建合成如下两条引物，5’端分别带有XhoI和EcoRI酶切位点，以合成的溶菌酶基因为模板扩增该基因。以上述二酶酶切扩增产物和pPIC9，再进行连接，获得重组质粒pPIC9-LYS。
引物15’TCTCTCGAGAAAAGAGAAGCTAAAGTCTTCGAACGTTG 3’引物25’GACGAATTCTTAAACGCCACAACCTTGA 3’实施例3重组GS115-HLY工程菌株的筛选采用组氨酸缺陷培养基筛选Mut+、His+重组子。
实施例4.基因工程重组人溶菌酶生产工艺重组人溶菌酶工程菌接种于BMGY培养基中，30℃培养36小时，离心收菌，接入BMGY培养基中，甲醇诱导表达，30℃培养24-72小时，离心收集发酵上清液，经Sephadex G-25去除各种金属离子后，上CM-Sepharose FF离子交换柱，分阶段梯度洗脱，收集活性洗脱峰液，鉴定合格后用作配制半成品的原液。
实施例5.人溶菌酶制剂制备工艺以pH7.0、20mM磷酸盐缓冲液作为缓冲体系，加入5％甘露醇，将鉴定合格的酶蛋白原液配成半成品，经冷冻干燥后即得成品。
纯化酶蛋白原液和冻干成品经SDS-PAGE检测均显示电泳为一条带，其蛋白分子量约为14KD；免疫印迹实验结果证实用以上方法制得的目的蛋白具有天然人溶菌酶的属性；溶菌酶活性测定采用浊度减低法，酶活检测结果显示该重组人溶菌酶的酶活比鸡蛋清来源溶菌酶的活力高1-3倍；试管法抑菌试验结果表明临床分离的对常用抗菌素耐药的细菌，对重组人溶菌酶敏感，说明开发生产该制品具有很好的临床应用前景。
附图1.合成的人溶菌酶基因编码序列和相应的氨基酸序列1 AAAGTCTTCGAACGTTGTGAACTGGCCCGTACTCTGAAACGTCTGGGTATGGATGGCTAC1 K V F E R C E L A R T L K R L G M D G Y61CGTGGTATCAGCTTGGCAAACTGGATGTGTCTGGCCAAATGGGAGTCTGGTTACAACACC21 R G I S L A N W M C L A K W E S G Y N T121 CGTGCCACCAACTACAATGCTGGCGACCGTAGCACTGATTATGGTATCTTTCAGATCAAT41 R A T N Y N A G D R S T D Y G I F Q I N181 AGCCGTTACTGGTGTAATGATGGCAAAACCCCAGGTGCAGTTAATGCCTGTCATTTATCC61 S R Y W C N D G K T P G A V N A C H L S241 TGCTCTGCTCTGCTGCAAGATAACATCGCTGATGCTGTCGCTTGTGCAAAGCGTGTTGTC81 C S A L L Q D N I A D A V A C A K R V V301 CGTGATCCACAAGGCATTCGTGCATGGGTTGCATGGCGTAATCGTTGTCAAAACCGTGAT101R D P Q G I R A W V A W R N R C Q N R D361 GTCCGTCAGTATGTTCAAGGTTGTGGCGTT121V R Q Y V Q G C G V
权利要求
1.一种生产基因工程重组人溶菌酶的方法，由以下步骤完成(1)采取全长序列合成的方法获取人溶菌酶基因(2)采用真核表达载体pPIC9与毕赤酵母宿主菌GS115进行人溶菌酶表达；(3)从发酵液中纯化人溶菌酶；(4)选择合适的赋型剂和稳定剂，与酶蛋白原液配制成一定浓度的半成品后冻干。
2.根据权利要求1所述重组人溶菌酶的制备方法，合成一条人溶菌酶基因，该基因序列参见说明书附图1。
3.根据权利要求1所述重组人溶菌酶的制备方法，重组质粒经过SacI内切酶线性化后，采用电穿孔法将其转入毕赤酵母GS115细胞中，筛选Mut+、His+菌株作为工程菌种。
4.根据权利要求3所述菌种发酵后，离心收集发酵上清液，经Sephadex G-25去除金属离子、CM-Sepharose FF离子交换的方法进行纯化目的产物。
5.权利要求4的目的产物，以磷酸盐缓冲液作为缓冲体系，加入一定浓度的甘露醇，将鉴定合格的酶蛋白原液配成半成品，经冷冻干燥后即得成品。
全文摘要
本发明属于生物技术领域，涉及一种人溶菌酶的制备方法。本发明利用真核表达原理与技术，选择酵母偏爱的密码子，化学合成了人溶菌酶基因。选用真核表达载体构建了重组质粒，转化酵母细胞得到稳定表达人溶菌酶的菌种。菌种发酵后，发酵液上清离子交换等方法进行产品纯化。该方法在制药领域有较好应用前景。
文档编号C12N15/56GK1664096SQ20041008387
公开日2005年9月7日 申请日期2004年10月21日 优先权日2004年10月21日
发明者徐明波, 杨仲凡, 王小山, 王俊玲, 崔铁民, 连治国, 高勇, 邓迪哥, 王璐, 梁果义, 吴彦卓 申请人:北京双鹭立生医药科技有限公司