专利名称：表达人cd20的转基因小鼠的制作方法
本申请已于2003年12月11日以如下名义申报PCT国际专利申请健泰科公司，该公司是一家位于美国的美国公司(除美国之外所有国家的申请人)；安德鲁.C-Y.陈，美国公民与居民(仅对美国的申请人)；龚谦，中国公民与美国居民(仅对美国的申请人)；与弗莱维厄斯·马丁，罗马尼亚公民与美国居民(仅对美国的申请人)；本申请指定所有国家，并要求如下优先权美国临时申请序列号60/434,115，于2002年12月16日提交；与美国临时申请序列号60/476,481，于2003年6月5日提交，在此引入作为参考。
背景技术：
T与B细胞两者包含可以被用作分化与识别标志物的细胞表面蛋白。一个这样的人B细胞标志是人B淋巴细胞限制的分化抗原Bp35，又名″CD20″。CD20在早期前B细胞发育期间表达，并且保持直到浆细胞分化。人们相信CD20分子调节激活过程中对细胞周期起始和分化所必需的步骤。
CD20存在于正常的B细胞以及恶性的B细胞两者上，恶性B细胞的强劲增殖可以导致B细胞淋巴瘤。因此，CD20表面抗原有作为候选物的可能性，以用特异于该抗原的抗体靶向B细胞。这些抗CD20抗体特异地与正常和恶性的B细胞的细胞表面抗原结合，导致B细胞的破坏与消减。具有破坏肿瘤的潜力的化学试剂或者放射性标记可以是偶联到抗CD20抗体的，以致于该药剂被特异地递送给肿瘤的B细胞。
通过利用单克隆抗体靶向CD20已经被描述(参见，例如Weiner，Semin.Oncol，26，43-51(1999)；Gopal and Press，J.Lab.Clin.Med.，134，445-450(1999)；White et al.，Pharm.Sci.Technol.Today，2，95-101(1999))。RituxanTM是一嵌合的抗CD20单克隆抗体，已经被广泛地作为单个的药剂和与化学疗法一起用于具有新诊断的和复发的淋巴瘤的病人(Davis et al，J.Clin.Oncol.，17，1851-1857(1999)；Solal-Celigny et al.，Blood，94，摘要2802(1999)；Foran et al.，J.Clin.Oncol.，18，317-324(2000)。利用放射性标记的抗体偶联物也已经叙述(例如，BexxarTM；Zelenetz et al.，Blood，94，摘要2806(1999))。
利用靶向CD20的抗体也已经被叙述用于其它病症，特别是那些涉及自体免疫的病症。例如，抗-CD20抗体治疗已经或者正在在类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮与强直性脊柱炎的治疗中被评价(Protheroe et al.，Rheumatology 381150(1999))。也已经研究用抗-CD20抗体治疗，导致B细胞消减以治疗其它的自身免疫病症，例如自身免疫性血小板减少、中性白细胞减少与自身免疫性溶血性贫血(Trape et al.，Haematologica 88223(2003)；Arzo et a1.，Annals of Rheumatic Diseases 61922(2002))。
尽管CD20在人淋巴瘤及其它紊乱中的重要作用，但缺乏表达该人标志物的动物模型。因此，需要有关的动物模型进行疾病研究与药物开发。
发明概述本发明普遍涉及表达人细胞标志物，特别地是CD20的，非自然发生的非人转基因动物。一方面，转基因动物提供鉴定与测试对于与CD20有关的疾病或者病症，例如癌症的新治疗剂的系统。在一个实施方式中，转基因动物对测试针对CD20的治疗的效力与毒性是有用处的。
本发明提供非自然发生的转基因动物，其基因组包含编码异源的CD20，优选人CD20的核苷酸序列。核苷酸序列优选地与人内源启动子可操作地连接，其中人CD20在B淋巴细胞表面上表达。将抗-人CD20抗体给予该目前叙述的转基因动物导致表达人CD20的B淋巴细胞的消减。在一个实施方式中，人CD20转基因鼠特征为人CD20在细胞上的表达水平足以使与表达细胞结合的抗人CD20抗体影响细胞的杀伤，引起至少大约75％、和更优选80％、85％、90％、95％、99％并且甚至100％外周的及/或循环B细胞的B细胞消减。
根据另一个优选实施方式，当动物基因组包含同源内源CD20基因，该基因被破坏或者剔除，以致内源的分子在细胞表面上不表达。
本发明更进一步地提供鉴定能治疗B细胞淋巴瘤的药剂的方法，其中该方法包含给予在B淋巴细胞上表达人CD20的转基因动物的药剂，并且确定B淋巴细胞数目是否有减少。本发明也提供鉴定能消减或者杀死表达人CD20的细胞的方法，包含给予表达人CD20的转基因动物一种药剂，并且确定像这样的细胞的数目是否有减少。更进一步提供根据这样的方法鉴定的药剂。
本发明的动物也通过对目前叙述的转基因动物给药，而对评估抗-CD20治疗的毒性有用。治疗特异性、毒性与效力还可以通过将该药剂的效果与在野生型动物或者未处理过的转基因动物中的效果比较而确定。
本发明的非人转基因动物可以更进一步提供向人给药的具体的药剂的安全性指示。例如，可以给予该转基因动物人源化的抗体或者其它的药剂，而对该动物给药该药剂的结果可以监视或者鉴别任何毒性或者副作用，作为该人源化的抗体或者药剂对于人体内利用的安全性与耐受性的指征。那些可以在短期基础上出现的不利情况包括头痛、感染、发热、寒战、疼痛、恶心、无力、咽炎、腹泻、鼻炎、灌输反应(infusion reaction)与肌痛。短期不利情况是处理后数天内测量的。长期的副作用包括对某些细胞类型的细胞毒作用、由于血小板减少导致的出血事件、由于炎性及/或变态反应导致的介质释放、对免疫系统的抑制及/或抗治疗剂抗体产生的抑制、末端器官毒性、感染或者恶性肿瘤发生率的增加。长期的不利情况是处理后数月内计量的。
本发明另一个方面涉及确定抗-CD20药剂效力的方法。通过向一组具有人CD20的转基因动物给予一系列剂量的该药剂、确定导致携带人CD20细胞的减少的药剂的至少一个剂量而确定效力。
图1显示来源于无转基因(Tg-)、杂合的(Tg+/-)与纯合的(Tg+/+)转基因的小鼠的小鼠B220+细胞上人CD20的表达。
图2提供在B细胞分化与成熟期间各种细胞表面标志物(CD43、IgM、IgD)表达的示意图。在Tg+小鼠中，hCD20在前-B(pre-B)、未成熟的B细胞与成熟B细胞上表达。
图3显示筛选Tg+小鼠在骨髓B细胞中人CD20表达的结果。细胞用偶联到FITC的抗-人CD20(BD Pharmingen)染色。根据B220与CD43的存在门化(gate)细胞，以将B细胞划分成各种群体。为进行门化，细胞用偶联到PerCP的抗-B220抗体(BD Pharmingen)与偶联到PE的抗-CD43抗体(荧光，BD Pharmingen)染色。
图4显示筛选Tg+小鼠脾B细胞人CD20表达的结果。细胞用偶联到FITC的抗-人CD20(BD Pharmingen)染色。用B220与CD21的存在门化该细胞允许将B细胞划分成各种的群体。为进行门化，细胞用偶联到PerCP的抗-B220抗体(BD Pharmingen)与偶联到PE的抗CD21抗体(荧光，BDPharmingen)染色。在T1区、边缘区和T2/滤泡区发现带有人CD20的B细胞。
图5显示筛选Tg+小鼠肠系膜淋巴结B细胞人CD20表达的结果。细胞用偶联到FITC的抗-人CD20(BD Pharmingen)染色。用B220与CD21门化该细胞允许划分成B细胞的各种的群体。为进行门化，细胞用偶联到PerCP的抗-B220抗体(BD Pharmingen)与偶联到PE的抗CD21抗体(荧光，BD Pharmingen)染色。
图6显示筛选Tg+小鼠派伊尔斑B细胞中人CD20表达的结果。细胞用偶联到FITC的抗-人CD20(BD Pharmingen)染色。用B220与CD38门化该细胞允许划分成B细胞的各种的群体。为进行门化，细胞用偶联到PerCP的抗-B220抗体(BD Pharmingen)与偶联到PE的抗CD38抗体(荧光，BDPharmingen)染色。带有人CD20的B细胞是成熟B细胞和生发中心的细胞。
图7是一示意图，示意将抗-人CD20单克隆抗体给药至Tg+小鼠，并且分析具有人CD20细胞的存在或者缺少。在第0天给予单一剂量1毫克的抗-人CD20单克隆抗体。在第-1、1、2、3、4、7、14与21天从各种组织取样品。如同以前叙述，经过FACS分析来自不同组织例如外周血、脾、淋巴结、骨髓、与派伊尔斑的样品。也监视抗-CD20单克隆抗体的血清水平。
图8显示在用抗-人CD20单克隆抗体m2H7(BD Pharmingen)处理的转基因小鼠中外周B细胞的消减。如同在图7简图中的概括，以总计1mg的剂量将抗体给予转基因小鼠。如前述进行门化，对外周血、脾、淋巴结、骨髓、与派伊尔斑做FACS分析。
图9显示用抗-人CD20单克隆抗体m2H7处理过的转基因小鼠中外周淋巴结成熟B细胞的消减。如同在图7简图中的概括的，以总计1mg的剂量将抗体给予转基因小鼠。如同以前叙述的进行门化，对外周血、脾、淋巴结、骨髓、与派伊尔斑做FACS分析。
图10显示用抗-人CD20单克隆抗体m2H7处理的转基因小鼠中脾T2与滤泡的B细胞(follicular B cell)的消减。如同在图7简图中的概括的，以总计1mg的剂量将抗体给予转基因小鼠。如同以前叙述的进行门化，对外周血、脾、淋巴结、骨髓、与派伊尔斑做FACS分析。
图11显示用抗-人CD20单克隆抗体m2H7处理过的转基因小鼠中再循环成熟B细胞的消减。如同在图7简图中的概括，以总计1mg的剂量将抗体给予转基因小鼠。如同以前叙述地进行门化，对外周血、脾、淋巴结、骨髓、与派伊尔斑做FACS分析。
图12显示在用抗人CD20单克隆抗体m2H7处理过的转基因小鼠中成熟B细胞的消减与派伊尔斑生发中心B细胞对消减的抵抗。如同在图7简图中的概括，以总计1mg的剂量将抗体给予转基因小鼠。如同以前叙述的进行门化，对外周血、脾、淋巴结、骨髓、与派伊尔斑做FACS分析。
图13显示用抗-CD20单克隆抗体给药后B细胞的消减与恢复。在第1天将抗体给药小鼠。在抗体处理后第6天，表达人CD20的B细胞在外周血液中检测不到。在第6周，抗体刚一清除，hCD20+细胞开始被检测到。到第l4周，B细胞似乎已经恢复到正常水平。恢复来自前体B细胞，该细胞不表达CD20，随后其发展成为具有人CD20+的成熟B细胞。
图14显示FACS图，指示脾生发中心B细胞对短期抗-CD20单克隆抗体治疗的抵抗。不对小鼠进行免疫，或在第1天由腹膜内注射绵羊红细胞(SRBC)对小鼠进行免疫以在脾中诱导生发中心。生发中心在第7天出现。在第8天，一组小鼠用抗CD20抗体m2H7处理。对照组的小鼠用mIgG2a同种型对照抗体处理。在第12天对来自小鼠的脾细胞进行分析。使用对生发中心染色的PNA(花生凝集素(peanut agglutinin)。在未用SRBC免疫的小鼠脾中没有见到可检测的生发中心细胞，而免疫小鼠脾显示0.3％的PNA染色细胞。尽管T2/滤泡的B细胞被用抗-CD20抗体消减，脾中边缘中心的B细胞对抗体是有抗力的。
图15显示在用抗-CD20单克隆抗体处理过的小鼠与对照中不依赖T细胞的反应。在第0天，小鼠用m2H7或同种型对照抗体mlgG2a处理。在第3-7天，B细胞消减已经发生。在第7天，小鼠用肺炎链球菌IV静脉注射以诱导对多糖的反应。在第11天建立不依赖T细胞的反应。结果显示，用抗-人CD20 m2H7处理不影响来自边缘区与B1细胞的B细胞反应，即非消减的MZ与B1B细胞赋予对T-非依赖性抗原的抗御作用。
图16显示BR3与2H7抗体处理在Tg+小鼠效应上的比较。表达细菌人工染色体编码的人CD20的人CD20转基因小鼠(命名为hCD20+小鼠)用抗CD20单克隆抗体(在第9天单次注射(single injection)100微克)、BR3-Fc(从第1天至第12天，100微克每隔一天注射)、或者抗-CD20单克隆抗体与BR3-Fc联合进行腹膜内注射处理。每组包括4只小鼠。最后一次注射后两天，将小鼠杀死，分析hCD20+B细胞。针对B细胞标志物(CD21+CD23+)对脾、血、淋巴结与派伊尔斑进行FACS分析。抗-CD20单克隆抗体治疗消减T2与滤泡的B细胞，而非脾中的边缘区B细胞；BR3-Fc处理在脾中降低T2/滤泡的B细胞与边缘区B细胞。
图17显示抗-CD20单克隆抗体处理对派伊尔斑没有影响。表达细菌人工染色体编码的人CD20的人CD20转基因小鼠(命名为hCD20+小鼠)用抗CD20单克隆抗体(在第9天单次注射)、BR3-Fc(从第1天至第12天，100微克每隔一天注射)、或者抗-CD20与BR3-Fc单克隆抗体联合进行腹膜内注射。每组包括4只小鼠。最后一次注射后两天，将小鼠杀死，分析hCD20+B细胞。针对B细胞标志物(CD21+CD23+)对脾、血、淋巴结与派伊尔斑进行FACS分析。BR3-Fc、2H7以及两者的组合对派伊尔斑中的生发中心B细胞都没有影响。
图18显示长期抗-CD20单克隆抗体处理后浆细胞未被消减。人CD20阳性的转基因Tg+小鼠用抗-人CD20 mH27抗体如同以前叙述地进行处理。通过检测骨髓与脾中细胞对于syndican(CD-138浆细胞标志物)阳性的细胞，分析小鼠中浆细胞的存在或者缺乏。在抗-人CD20处理之后也监视IgA或者IgM阳性的浆细胞的数目。结果表明在Tg+小鼠中，浆细胞不受抗-人CD20抗体处理的影响，指示Tg+小鼠仍然具有产生抗体的能力。
图19显示用PK-136单克隆抗体导致在Tg+小鼠中NK细胞的消减。产生PK-136单克隆抗体(特异于小鼠NK1.1)的杂交瘤克隆获得自ATCC。分别用对照单克隆抗体、PK-136、抗-CD20单克隆抗体与PK-136/抗-CD20的联合腹膜内注射给四组人CD20转基因小鼠。给予的剂量如下对照单克隆抗体200μg/ip，3ip/周，共1周PK-136200μg/ip，3ip/周，共1周抗-CD20单克隆抗体10μg/ip，单次剂量(single dose)来自外周血液、肝脏与脾的NK细胞在抗体处理后进行分析。数据用平均数+/-标准误差来表示，n＝8。
图20表明自然杀伤细胞在Tg+小鼠的2H7介导的B细胞消减中起作用。产生PK-136单克隆抗体(特异于小鼠NK1.1)的杂交瘤克隆是获得自ATCC。分别用对照单克隆抗体，PK-136，抗-CD20单克隆抗体与PK-136/抗-CD20的联合腹膜内注射给四组人CD20转基因小鼠。腹膜内给予的剂量如下
对照单克隆抗体200μg/ip，3ip/周，共1周PK-136200μg/ip，3ip/周，共1周抗-CD20单克隆抗体10μg/ip，单次剂量在抗-CD20单克隆抗体腹膜内注射之后第3天分析来自外周血、淋巴结与脾的淋巴细胞。数据用平均数+/-标准误差来表示，n＝8。
图21A显示人CD20的氨基酸序列(SEQ ID NO1)(GenBank登记号码BC002807)，人CD20 cDNA序列(图21B)(SEQ ID NO2)(GenBank登记号码BC002807)与人CD20的基因组序列(GenBank登记号码AH005353)(图21C)。图21D显示小鼠CD20cDNA序列(SEQ ID NO4)(GenBank登记号码M62541)。
图22显示与人外周血细胞上CD20表达比较在来自人CD20转基因小鼠的外周血细胞上人CD20表达水平的代表性比较。外周血细胞获自人供体和来自hCD20Tg+小鼠，并且用标记的抗-人CD20抗体(mH27)染色。细胞用FACS分析，对人CD19+与B220+群体门化。在图上的数字表示平均荧光强度。
发明详述以下术语除非另外规定具有在下面对其所赋予的含义。
术语“构建物”或者“靶向构建物(targeting construct)”指包含靶向区的多核苷酸分子。靶向区包含实质上和在靶组织，细胞或者动物中的内源序列同源的序列，提供该靶向构建物向靶组织、细胞或动物基因组的整合。典型的，靶向构建物也包括具有特定目的的基因或者核酸序列、标记基因与合适的控制序列。
术语“CD20”指在免疫系统的某些细胞上表达的细胞表面蛋白，特定地是B淋巴细胞-限制的分化抗原Bp35。“自然发生的CD20”具有获得自自然的蛋白质的氨基酸序列，并且包括自然发生的变体例如等位基因变体、同种型与截短的形式。更特别地，“CD20”包括人CD20(AH003353；GenBank登记号数M27395，J03574)。代表性的人与鼠CD20的氨基酸序列、cDNA序列和基因组序列示于图21。本发明也考虑CD20变体。利用一般已知的技术，与源序列相比，所述变体已经发生了改变，并且优选保留有自然发生的人CD20的生物活性。优选该变体不是在自然发生的人CD20氨基酸位置170与172改变，因为这些位置已经被证明是如Polyak et al.描述的被几个不同抗-人CD20单克隆抗体所识别的表位的一部分，Blood993256(2002)。
当一DNA片段定位于内源的同源序列并且与其重组时发生基因的“破坏(disruption)”。这些序列破坏或者修饰可以包括DNA序列的插入、错义、移码、删除、或者置换或者替换，或者它们的任何组合。插入包括插入整个的基因，其可能是动物、植物、真菌、昆虫、原核、或者病毒来源的。破坏，例如，可以经过部分地或者完全地抑制正常基因产物的生产，或者经过增强正常基因产物的活性来改变正常的基因产物。在一优选方案中，该破坏是一种无效性破坏(null disruption)，即该破坏使该基因不显著表达。
术语“内源的位点”意味着包括在将变成转基因的宿主动物中发现的自然发生的基因位点。
术语“异源的”当与多肽或者基因联合使用时指一多肽，具有编码在转基因非人宿主动物中未找到的多肽的氨基酸序列或者DNA。因此，具有人CD20基因的转基因小鼠可以被称作具有异源的CD20基因。可以利用种种的方法包括PCR、蛋白质印迹、或者Southern印迹检测转基因。术语“人内源的启动子”指与将被引入动物以形成转基因动物的编码人蛋白质的多核苷酸序列有自然联系的启动子。
术语“非-人动物”意图包括任何脊椎动物例如哺乳动物、鸟类、爬行动物与两栖动物。合适的哺乳动物包括啮齿类动物、非-人灵长类动物、羊、狗与母牛。合适的鸟类包括鸡、鹅与火鸡。优选的非-人动物是从包括大鼠和小鼠的啮齿科中选出来的，最优选小鼠。
术语“自然发生”或者“自然相关的”如同在这里应用于一对象时所使用的，指一对象可以在自然中被发现这一事实。例如，存在于一可以从自然来源分离的有机体(包括病毒)、并且没有被人在实验室中有意地修饰的一多肽或者多核苷酸序列是自然发生的。
对于核酸，术语“基本上同源”指两个核酸或者其中指定的序列，当最佳地比对并且与合适的核苷酸插入或者删除相比较时彼此具有至少大约80％序列同一性，更优选大约81％序列同一性，更优选大约82％序列同一性，更优选大约83％序列同一性，更优选大约84％序列同一性，更优选大约85％序列同一性，更优选大约86％序列同一性，更优选大约87％序列同一性，更优选大约88％序列同一性，更优选大约89％序列同一性，更优选大约90％序列同一性，更优选大约91％序列同一性，更优选大约92％序列同一性，更优选大约93序列同一性，更优选大约94％序列同一性，更优选大约95％序列同一性，更优选大约96％序列同一性，更优选大约97％序列同一性，更优选大约98％序列同一性，以及更加优选大约99％序列同一性。或者，当该片段在选择性杂交条件下与所述链的互补体杂交时存在基本的同源(substantial homology)。比对两序列并且鉴定同一性的方法为本领域技术人员所熟知。几个计算机程序可用于确定同一性％。为了确定核酸序列同一性百分比而进行的比对可以本领域范围内的多种方式取得，例如，利用公众可以得到的计算机软件例如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或者Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以判定用来测量比对的合适的参数，包括任何对所比较的序列全长达最大比对所需要的算法。
″转录调节序列″指多核苷酸序列，例如起始信号、增强子与启动子，其诱导或者控制与其可操作连接的蛋白质编码序列的转录。在最优方案中，重组转基因的转录在启动子序列(或者其它的转录调节序列)的控制之下，所述基因在预定表达的细胞类型中控制重组基因表达。也应该理解，重组基因可以在与那些控制自然发生的形式的CD20转录的序列相同或者不同的转录调节序列控制之下。
如同在这里使用的，术语″转基因″指一个核酸序列(编码，例如，CD20)，该序列已经经由人的干预例如经由在这里叙述的方法被引入细胞。所述转基因对其将要被引入的转基因动物或者细胞是部分地或者完全地异源的，即外来的。一转基因可以包括一个或多个转录调节序列与任何其它的可能是为所选择的核酸最佳的表达所需的核酸，例如内含子。
转基因动物″或″Tg+″可互换地使用，并且意图包括任何非-自然发生的非-人动物，其中该动物的一个或多个细胞包含已经经由人的干预例如经过本领域已熟知的转基因技术被引入的、编码人CD20的异源核酸。经由有意的遗传操纵，例如经过显微注射或者用感染，将重组病毒引入该细胞的前体，使核酸被直接地或者间接地引入该细胞。
术语遗传操纵不包括经典的杂交育种，而是针对重组DNA分子的引入。这个分子可能被整合入染色体，或者可以是染色体外复制的DNA。术语″Tg+″包括对于人CD20而言杂合的及/或纯合的动物。
″CD20相关的疾病″指那些已经与CD20在细胞上表达、B细胞的异常增殖或者活化有联系、或者已经用抗-CD20抗体处理过的疾病或者紊乱。例如，嵌合的抗-CD20抗体已经被用于治疗淋巴瘤病人。已经用抗-CD20治疗处理过的其它的疾病或者症状包括例如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、和强直性脊柱炎等自身免疫症状或者疾病。其它的病症包括血或者骨髓移植后的EB病毒有关的疾病、卡波济氏肉瘤有关的疱疹病毒相关的多中心性Castlemen疾病(Karposi Sarcoma associated herpes virus relatedmulticentric Castlemen disease)、丙型肝炎有关的冷球蛋白血症性血管炎、具有自体免疫性溶血性贫血的淋巴增生性疾病、与ANCA相关的血管炎。
A.本发明的方式本发明提供表达异源CD20标志物的转基因动物。在一个实施方式中，本发明的人CD20转基因动物在与人相同类型的B细胞上表达CD20。由于缺乏有效转录控制区域向转基因的掺入，先前制备表达人CD20转基因小鼠的尝试未能取得人CD20在合适的B细胞亚群中、或以足够的水平的表达。
本发明提供具有以类似于人受试者的方式反应的细胞的转基因动物。将抗-人CD20抗体给予该目前叙述的转基因动物，导致表达人CD20的B淋巴细胞的消减。在一个实施方式中，人CD20转基因鼠特征为人CD20在细胞上的表达水平足以使与该表达细胞结合的抗人CD20抗体影响细胞的杀伤，引起至少大约75％、和更优选80％、85％、90％、95％、99％并且甚至100％外周的及/或循环B细胞的消减。一个类似的反应在人中观察到。这些动物模型能被用于筛选药剂，包括然而并非限于抗CD20标志物的单克隆抗体。另外，该转基因动物可能用来测试抗-CD20指向的治疗的效力与毒性。
B.DNA构建物典型的，编码本发明的异源蛋白质的多核苷酸分子被插入载体中，优选DNA载体，以在合适的寄主细胞中复制该多核苷酸分子。DNA构建物也可以对制备用于敲除动物的靶向载体有用处。
为了分离、克隆与转移CD20基因座，可以使用酵母人工染色体(YAC)。整个基因座可以被克隆，并被包含在一个或者几个YAC克隆中。如果使用许多的YAC克隆，并且包含重叠同源的区域，它们可以在酵母宿主株内部重组，以产生代表整个基因座的单一构建物。YAC臂可以另外用哺乳动物选择盒通过改型(retrofitting)来进行修饰，以帮助构建物经过以前概括的方法引入胚胎干细胞或者胚胎。
由于其高稳定性与可以插入相对大的插入物、操作容易、以及可以鸟枪法测序，细菌人工染色体(BAC)文库可以提供目的基因的人源序列。BAC文库包含100-150bp大小的平均插入物。BAC克隆能够携带高达300,000bp的插入物。Shizuya，et al.，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 898794-8797；Kim，et al.，(1996)Genomics 34 213-218；Swiatek，et al.，(1993)Genes andDevelopment 72071-2084。人与小鼠的基因组BAC文库已经被构建，并且市场上可买到(Invitrogen，Carlsbad CA)。基因组BAC文库还可以作为人与鼠CD20基因序列以及转录控制区域的来源。
编码人CD20的核酸为本领域技术人员所知。图21显示人CD20代表性cDNA(SEQ ID NO2)、基因组(SEQ ID NO3)与氨基酸序列(SEQ ID NO1)。其它的序列也可以在GenBank中找到，例如登记号码AH003353。鼠CD20代表性cDNA(SEQ ID NO4)如图21D所示。
异源的转基因优选包含与将要在转基因非-人动物中表达的目的基因可操作连接的种系调节DNA序列。术语″可操作地连接″指一遗传片段在操作上(即功能上)与一核酸片段、或一给定片段或者序列的上游(5′)或者下游(3′)序列连接。那些附近的序列经常影响在一所需的细胞类型中核酸片段或者序列的加工及/或表达。
优选，这些调节序列是基因组来源的，并且包括一个或者多个内含子。例如，转基因构建物可以包括位于编码CD20 5′-旁侧区的调节区，该调节区可操作地以能在寄主细胞中复制与表达的方式与编码序列连接。在一个实施方式中，调节序列包含与CD20有自然联系的内源的启动子序列。在一些实施方式中，启动子提供与在该序列所来源的动物中的表达水平类似的水平的组织特异性的表达。如果额外的旁侧序列在最佳化表达中有用，可以利用目前的序列作为探针克隆这样的序列。为转基因的最大加工或者表达所需的附加序列可以源自于基因组序列。
或者，启动子可以是那些与在该转基因宿主动物中相应的内源的基因有联系的启动子。例如，如果通过与相应的人基因整合而破坏鼠基因CD20基因，相应的人基因优选是整合的，以致于与内源鼠CD20的鼠转录控制区域可操作地连接。
优选，调节序列在合适的细胞中并以一定的水平提供该转基因的表达以致可以利用标准方法例如用抗体检测来检测表达。在一个实施方式中，调节序列以在人细胞上CD20表达的至少40％的水平提供该人CD20转基因的表达。
编码如同在这里叙述的转基因的表达系统或者构建物还可以包括DNA序列下游3′非翻译区。像这样的区域可以使该表达系统的RNA转录物稳定，并因此增加来自该表达系统的想要的蛋白质的产量。对这个发明的构建物有用的3′非翻译区之一是那些提供多聚腺苷酸化信号的序列。像这样的序列可以源自，例如SV40小t抗原、CD20非翻译区或者其它本领域熟知的3′非翻译序列。
选择性地，该表达系统或者构建物包括在启动子与编码该信号序列的DNA序列之间的5′非翻译区。
像这样的非翻译区可以来自于从中获取启动子的相同的控制区域，或者可以来自于不同基因，例如它们可能是来源于其它的人造的、半-人造的或者天然来源。
另外，可以利用非自然地与该转基因有联系的其它启动子或者其它转录调节序列。例如，异源的启动子可以提供增强水平的表达或者组织特异性的表达。具有不同强度的各种启动子可以被利用，只要该启动子在该非-人动物或者在该所需的组织类型中起作用。许多启动子为本领域技术人员所已知。
表达系统可以利用本领域已知的方法制备。例如，表达系统可以作为较大质粒的一部分被制备。像这样的制备允许以本领域已知的有效方式克隆与选择正确构建物。表达系统可以位于质粒上适宜限制性位点之间，以致它们可以容易地从掺入该想要的哺乳动物的其余质粒序列中分离。
优选，编码人CD20的DNA构建物包含细菌人工染色体以提供组织特异性的表达，所述细菌人工染色体包括自然相关的转录调节序列。
在质粒制备与宿主有机体的转化中使用的各种的方法在本领域是已知的。对于其它的对于原核的与真核细胞合适的表达系统，以及一般的重组操作，参见“Molecular CloningA Laboratory Manual”，第二版，Sambrook、Fritsch与Maniatis编辑，(冷泉港实验室出版社1989)第16与17章。
C.转基因动物的生产生产本发明的转基因动物的方法，包括敲除(knock-out)与“敲入”(knock-in)法，在本领域是熟知的(参见，一般地，“基因打靶一个实用的方法”，Joyner编辑，牛津大学出版社有限公司(2000))。在一个实施方式中，转基因小鼠的产生可以选择性地涉及鼠标志物基因座位的破坏与将编码人标志物的该基因引入该鼠基因组，优选与内源基因在相同的位置。
根据本发明，当人CD20已经被引入该鼠基因组时，生产出转基因小鼠模型(huCD20+；或者称为huCD20Tg+)。内源的鼠CD20多肽存在于鼠淋巴细胞上，但是已知的抗-人CD20单克隆抗体不与鼠B细胞结合。内源的鼠CD20基因因此无须、但是如果想要可以被破坏。当内源的鼠CD20未被破坏，则编码人CD20的基因优选插入在编码鼠CD20的基因的位置之外的位置。
内源性基因座的灭活在一个优选实施方案中，内源基因座的灭活是经过通过胚胎干细胞内的同源重组造成的靶向性破坏取得的。在一个实施方式中，DNA被引入寄主细胞并且在该内源位点重组以破坏内源CD20的生产。利用本领域已知的标准方法可以生产该靶向构建物，(参见，例如Sambrook et al.，1989，Molecular CloningA Laboratory Manual，Second Edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，New York；E.N.Glover(eds.)，1985，DNA CloningA Practical Approach，Volumes I and II；M.J.Gait(ed.)，1984，Oligonucleotide Synthesis；B.D.Hames & S.J.Higgins(eds.)，1985，NucleicAcid Hybridization；B.D.Hames & S.J.Higgins(eds.)，1984，Transcription andTranslation；R.I.Freshney(ed.)，1986，Animal Cell Culture；Immobilized Cellsand Enzymes，IRL Press，1986；B.Perbal，1984，A Practical Guide ToMolecularCloning；F.M.Ausubel et al.，1994，Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley & Sons，Inc.)。例如，该靶向构建体可以依照常规的方式制备，其中序列可以被合成、从天然来源分离、操纵、克隆、连接、接受体外诱变、引物修补，等等。在各个阶段，连接的序列可以被克隆，经过限制性内切酶酶切分析进行分析，测序等等。
靶向DNA可以利用本领域熟知的技术获得。例如，靶向DNA可以通过寡核苷酸化学合成、双链DNA模板的切口翻译、序列的聚合酶链式反应扩增(或者连接酶链式反应扩增)、携带目的序列的原核的或者靶克隆载体的纯化(例如克隆的cDNA或者基因组DNA，合成DNA或者来自任何前面提到过的组合的DNA)而产生，例如质粒、噬菌粒、YACs、粘粒、BACs、噬菌体DNA、其它的病毒DNA或者复制中间产品、或者其纯化的限制性片断、以及具有所需核苷酸序列的单与双链多核苷酸的其它来源。此外，可利用本领域已知方法选择同源性的长度。例如选择可能是以预先确定的内源的靶DNA序列的序列组成与复杂性为基础。
在一个实施方式中，本发明的靶向构建物包含靶向区，其包含与要被破坏的CD20基因的一部分或者区域同源的第一序列(或者臂)和与该基因的第二部分或者区域同源的第二序列。该靶向构建物可以更进一步地包含正选择标记，其优选位于第一与第二DNA序列之间。该正选择标记可以可操作地与启动子和聚腺苷酸化信号连接。
在另一个实施方式中，该靶向构建物可以包含超过一个可选择的标记基因，包括负的选择性标记，例如单纯疱疹病毒tk(HSV-tk)基因，其优选位于该靶向构建物的一或二个同源臂之外。负的可选择的标记可以与启动子和聚腺苷酸化信号可操作地连接(参见，例如，美国专利号5,464,764；5,487,992；5,627,059及5,631,153)。
一旦合适的靶向构建物已经被制备，该靶向构建物可能利用任何本领域已知方法被引入一合适的寄主细胞。各种的技术可被用于本发明，包括，例如原核显微注射；逆转录病毒介导的基因转移入种系；在胚胎干细胞中的基因靶向；胚胎的电穿孔；精液介导的基因靶向；与磷酸钙/DNA共沉淀；显微注射DNA入核；细菌的原生质体与完整细胞融合；转染；聚阳离子例如l，5-二甲基-1，5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物、聚鸟氨酸等等。(参见，例如美国专利号4,873,191；Van der Putten et a1.，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 826148-6152；Thompson et al.，1989，Cell 56313-321；Lo，1983，Mol Cell.Biol.31803-1814；Lavitrano et al.，1989，Cell，57717-723)。转化哺乳动物细胞的各种技术在本领域是已知的(参见，例如Gordon，1989，Intl.Rev.Cytol.，115171-229；Keown et al.，1989，Methods in Enzymology；Keown et al.，1990，Methods and Enzymology，Vol.185，pp.527-537；Mansour et al.，1988，Nature，336348-352)。
能同源重组的任何细胞类型可被用于本发明的操作。像这样的靶细胞的例子包括来源于脊椎动物的细胞包括哺乳动物例如人、牛的物种、羊的物种、鼠的物种、猿的物种、与任何真核生物例如丝状真菌、和高等的多细胞有机体例如植物。
优选的细胞类型包括胚胎干(ES)细胞，其典型的获得自体外培养的移植前胚胎(参见，例如，Evans，M.J.et al.，1981，Nature 292154-156；Bradley，M.O.et al.，1984，Nature 309255-258；Gossler et al.，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 839065-9069；和Robertson et al.，1986，Nature 322445-448)。利用本领域技术人员熟知的方法培养与制备ES细胞用于该靶向构建物的导入。(参见，例如，Robertson，E.J.ed.″Teratocarcinomas and Embryonic StemCells，a Practical Approach″，IRL Press，Washington D.C.，1987；Bradley et al.，1986，Current Topics in Devel.Biol.20357-371；Hogan et al.，在″Manipulatingthe Mouse EmbryoA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor N.Y.，1986中；Thomas et al.，1987，Cell 51503；Koller et al.，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，8810730；Dorin et al.，1992，Transgenic Res.1101；and Veis et al.，1993，Cell 75229)。将要用该靶向构建物插入的ES细胞源自于与它们将被引入的发育胚胎相同物种的胚胎或者胚泡。ES细胞典型的针对它们的整合入内部细胞团的能力被选择，并且当在发育的胚泡阶段被引入该哺乳动物胚胎时成为个体的种系的一部分。因此，任何具有这一能力的ES细胞系适于在本发明的操作中应用。
在该靶向构建物已经被引入细胞之后，鉴别其中已经发生成功的基因靶向的细胞。该靶向构建物插入靶基因典型的是经过鉴定表达该标记基因的细胞而检测。在一优选实施方案中，用本发明的靶向构建物转化的细胞用选择未表达该选择性标记的细胞的合适的药剂处理。只有那些表达选择性标记基因的细胞在一定条件下成活及/或生长。例如，那些表达引入的新霉素抗性基因的细胞抗化合物G418，而那些不表达neo基因标记的细胞被G418杀死。如果该靶向构建物也包含筛选标记例如GFP，同源重组可以通过在荧光下筛选细胞菌落而鉴别。那些已经进行同源重组的细胞将已经删除该GFP基因，并且不会发荧光。
或者，正-负选择技术可能用来选择同源的重组体。这个技术涉及一种方法，其中第一药物，例如新霉素样药物被加入该细胞群体，来选择转染细胞的生长，即正选择。第二药物，例如FIAU随后被加入以杀死那些表达负选择标记的细胞，即负选择。那些包含与表达负选择标记的细胞被选择药剂杀死，而那些没有包含并表达该负选择标记的细胞存活。例如，用构建物非-同源插入的细胞表达HSV胸苷激酶，并因此对治疗疱疹药物例如更昔洛韦(GANC)或者FIAU(1-(2-脱氧2-氟代-B-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-碘代尿嘧啶)敏感。(参见，例如，Mansour et al.，Nature 336348-352(1988)；Capecchi，Science 2441288-1292，(1989)；Capecchi，Trends in Genet.570-76(1989))。其它的方法包括受调节的正选择(参见U.S.20030032175A1)，其中要求加入单一选择剂。
可经过分析被选择细胞的DNA鉴别成功的重组以印证同源重组。各种的技术在本领域已知，例如PCR及/或Southern分析可用来印证同源重组事件。
被选细胞然后被注射入动物(例如小鼠)的胚泡(或者其它的适于创造能生存的动物的用途的发育阶段，例如，桑椹胚)，以形成嵌合体(参见，例如Bradley.A.，在“Teratocarcinomas and Embryonic Stem CellsA PracticalApproach”中，J.Robertson编辑，IRL，Oxford，pp.113-152(1987))。或者，被选的ES细胞可以被允许与离解的小鼠胚胎细胞聚集以形成集合体嵌合体。嵌合胚能因此被移植入合适的假孕雌性代孕动物并且该胚胎被抚育至足月。在其性细胞中携带同源重组DNA的嵌合后代可用于繁殖动物，其中该动物的所有的细胞包含同源重组的DNA。在一个实施方式中，嵌合后代小鼠被用来产生在CD20基因具有杂合破坏的小鼠。杂合转基因小鼠可随后交配。本领域已熟知，典型的，这种交配的后代中1/4将在CD20基因中有纯合破坏。
除以上所述灭活内源基因座的方法之外，有其它的优选灭活方法，并且可以包括例如利用tet转录系统来利用特异目的基因的时序控制(Proc.Natl.Acad.Sci.919302-9306(1994)或者引入脱氧细胞周期蛋白(deoxycycline)转录调节控制进行组织特定的控制(Proc.Natl.Acad.Sci.9310933-10938(1996)。
用于功能性灭活的另外优选的方法包括使用cre-lox删除，用于基因位点的靶向敲除的位点特异性重组系统，其中loxP位点被插入目的基因的侧翼，并且cre重组酶被激活以删除基因(Curr.Opin.Biotechnol.521-527(1994))。
或者，反义或RNAi方法可能被利用以抑制该目的基因座的转录，因此导致内源位点的功能性破坏(khock-down方法)。在这样的情形中，生产靶向指定的目的位点的特定序列的寡核苷酸，其中成功靶向导致该功能蛋白的生产抑制。
对于内源CD20的丧失而言纯合的敲除小鼠可以如WO02/062946中描述制备。简要地，在一个实施方式中，CD20-缺陷的小鼠可以经过利用同源重组靶向破坏在胚胎干(ES)细胞中鼠CD20基因而生产。靶向载体可以生产，其用新霉素抗性基因替换编码第二个细胞外环的一部分的外显子，第四跨膜结构域，及鼠CD20大的羧基末端胞内结构域。鼠CD20的核苷酸序列为本领域技术人员所知。(GenBank登记号码M62541；WO02/062946)。在一个实施方式中，合适的基因寻靶生产在氨基酸位置157截断、并且与Neo基因序列编码的88个氨基酸的蛋白质融合的异常的CD20蛋白质。
在DNA转染之后，携带靶向等位基因的neo-抗性的ES细胞克隆经过Southern印迹分析加以测定。一个ES细胞克隆的细胞可以被注射入可以被转移入代孕母亲的那些胚泡。高度嵌合的雄性后代(根据毛色80-100％)可以用C57BL/6(B6)雌性繁殖，以将突变传递给它们的后代。对于CD20基因的破坏纯合的小鼠可以经过杂交杂合的后代以预期的孟德尔频率获得。
CD20的合适的靶向可以更进一步地用来自纯合的后代的基因组DNA进行PCR分析来证实。野生型CD20 mRNA在CD20-/-小鼠中存在或者缺少可以用来自CD20-/-小鼠脾细胞生产的cDNA的PCR扩增证实。CD20-/-小鼠中细胞表面CD20蛋白质的缺乏可以更进一步地通过用鼠抗-CD20单克隆抗体染色B220+脾细胞证实。CD20基因的靶向突变消除了细胞表面CD20蛋白质的表达。
将转基因引入非-人动物本发明的非-人转基因动物优选经过将转基因引入该动物的种系加以生产。在各种的发育阶段的胚胎的靶细胞可用于引入转基因。依赖于胚胎的靶细胞的发育阶段使用不同的方法。以一般健康、良好胚胎产量、胚胎中良好原核能见度与良好生殖适应度为标准，选择任何被用来实施本发明的动物的特定的谱系。当将生产转基因小鼠时，株例如C57BL/6或者C57BL/6xDBA/2F1、或者FVB系是经常使用的(商业上获得自Charles RiverLabs，Boston，Mass，The Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME，或TaconicLabs.)。优选的株是具有H-2b、H2d或者H-2q单倍体的株例如C57BL/6或者DBA/1。此外，裸鼠可以被利用以允许人肿瘤细胞的引入。裸鼠的繁殖与维持更困难，因为其对感染与疾病敏感。用来实行本发明的系可以本身是转基因的，和/或可以是敲除的。优选相同的系被用来制备初始敲除哺乳动物与转基因哺乳动物。这会使以后的繁殖与回交更有效。
转基因引入胚胎可以通过任何本领域已知的方式完成，例如，显微注射、电穿孔法、或者脂转染。例如，该转基因可以经过将构建物显微注射入已受精的哺乳动物卵的原核而被引入哺乳动物，使得一或多拷贝的该构建物保留在发育哺乳动物的细胞中。转基因构建物被引入受精卵后，该卵可以体外孵化一可变的时间，或者再植入代理宿主内，或者两者都有。活体外孵化至成熟在本发明范围之内。一个常见的方法是活体外孵化该胚胎大约1-7天(取决于物种)，然后将其再植入代理宿主。
再植入术利用标准方法完成。通常，代理宿主是被麻醉的，并且胚胎被插入输卵管中。移植入特定宿主的胚胎数目将随物种改变，但是将通常与该物种自然生产的后代数目同等。
还可以使用逆转录病毒感染将转基因引入非-人动物。发育的非-人胚胎可以体外培养至胚泡阶段。在这一时期，可以针对卵裂球进行逆转录病毒感染(Jaenich，R.(1976)PNAS 731260-1264)。经过酶处理除去透明带，以获得卵裂球的有效感染(Manipulating the Mouse Embryo，Hogan eds.(ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，1986)。用来引入转基因的病毒载体系统典型的是携带该转基因的复制缺陷的逆转录病毒(Jahner et al.et al.(1985)PNAS 826927-6931；Van der Putten et al.(1985)PNAS 826148-6152)。经过在单层生成病毒的细胞上培养卵裂球容易与有效地获得转染(Van der Putten，supra；Stewart et al.(1987)EMBO J.6383-388)。或者，感染可以在以后阶段进行。病毒或者生产病毒的细胞可以被注射入囊胚腔(Jahneret al.(1982)Nature 298623-628)。大多数建立考对于该转基因是嵌合体，因为掺入仅仅发生在形成该转基因非-人动物的细胞亚群。更进一步地，建立者可以在基因组不同位置包含转基因的各种逆转录病毒插入物，其通常将分散在后代中。另外，可能经过逆转录病毒子宫内感染妊娠中期胚胎来将转基因引入种系(Jahner et al.(1982)supra)。
转基因引入的第三种类型的靶细胞是胚胎干细胞。转基因可以通过DNA转染或者通过逆转录病毒介导的转导有效地被引入ES细胞。这样转化的ES细胞可以此后与来自非-人动物的胚泡结合。ES细胞此后加入胚胎，并且构成所得到的嵌合的动物的种系的一部分。
在一个实施方式中，例如图21所示编码人CD20的cDNA或者基因组克隆可以利用显微注射或转染被引入FVB小鼠受精卵或者ES细胞。胚胎体外孵化大约1-7天，然后移植入代理宿主。ES细胞与来自自然交配的宿主动物的胚泡结合，并且胚泡被再植入代理母亲。
在本发明的一个实施方式中，在非人宿主中的内源CD20基因经过异源的CD20的同源的整合作用被功能上破坏，以致于异源的CD20基因实质上替换内源的CD20，并且优选完全替换内源的CD20基因的编码序列。优选，作为同源的整合作用的结果，异源的CD20基因分别地连接于该内源的CD20基因的调节序列(例如增强子启动子)，以致该异源基因在来自内源的CD20基因位点的调控元件的转录控制之下被表达。对于象这样的替换等位基因是纯合的非人类的宿主可以根据在这里叙述的方法生产。象这样的纯合的非人类的宿主一般地将表达异源的CD20，但是不表达内源的CD20蛋白质。通常，异源的CD20基因的表达模式实质上模仿在自然发生的(非转基因)非人类宿主中内源的CD20基因的表达模式。
例如，可以生产人CD20基因序列已经代替内源的鼠CD20基因序列、并且转录上受内源鼠调节序列控制的转基因小鼠。人CD20一般地类似于在自然发生的非转基因小鼠中鼠CD20的方式加以表达。
一般地，使用替换类型的靶向构建物进行同源基因替换。在靶向构建物的内源CD20基因序列之间双交叉同源重组，导致异源的CD20基因片段的靶向整合作用。通常，该转基因的同源靶向区域包含内源的CD20基因片段侧翼的序列，以致同源重组导致内源的CD20基因片段的伴随的删除，和异源基因片段的同源整合作用。实质上整个的内源的CD20基因可以由单一靶向事件或者由多重靶向事件用异源的CD20替换(例如，单个外显子的依序替换)。一或多个选择性标记通常可以正的或者负的选择表达盒形式被置于靶向构建物中。通常优选选择性标记位于异源替换区域的内含子区域。
转基因小鼠的杂交包含转基因人CD20的转基因小鼠可以与缺乏鼠CD20的转基因小鼠杂交。在一个实施方式中，转基因小鼠包含人CD20，并且缺乏鼠CD20。制备方式将产生一系列哺乳动物，每个包含该想要的敲除构建物或者转基因中的一个。像这样的哺乳动物通过一系列杂交、回交与选择共同繁殖，最终产生包含所有的想要的敲除构建物及/或转基因的单一哺乳动物，其中该哺乳动物除了对该敲除构建物及/或转基因的存在之外对野生型是同类系的(遗传上同一的)。
典型地，取决于增殖过程中每个特定步骤的目标通过交配同胞兄弟姐妹或者用后代交配亲本株完成杂交与回交。在某些情况下，也许必需产生许多后代，以产生在适当的染色体位置包含每一敲除构建物及/或转基因的单一后代。另外，也许必需杂交或者回交几代，以最终获得想要的基因型。
一旦该人位点已经或者由同源重组或者由随机的整合作用被引入宿主基因组，并且内源CD20基因座已被灭活的宿主动物已经用经过各种转基因或者突变的动物的适当繁殖而产生，可以产生缺乏产生内源CD20的天然能力、但是具有产生人CD20的能力的宿主。
D.转基因的存在的证实可经过任何合适的方法以在所需组织、细胞或者动物中该转基因的存在及/或表达筛选代理宿主的转基因后代。筛选经常利用对该转基因的至少一部分互补的探针经过Southern印迹或者Northern印迹分析完成。可以使用利用抗由该转基因编码的蛋白质的抗体进行的蛋白质印迹分析，作为筛选转基因产物的存在的替代或者补充的方法。典型地，DNA制备自尾组织，并且经过Southern分析或者PCR分析该转基因。或者，虽然任何组织或者细胞类型可被用来进行这一分析，利用Southern分析或者PCR测试被认为以最高水平表达该转基因的组织或者细胞该转基因的存在与表达。
评价转基因存在的其它或者附加方法包括，但不限于，合适的生物化学的试验例如酶及/或免疫学测定，对于特定的标记或者酶活性的组织学染色、流式细胞计分析，等等。对血液的分析也可以对检测血中该转基因产物的存在，以及评定该转基因在各种类型血细胞及其它血液组分水平的效应有用处。在一个实施方式中，人CD20的表达可以利用对人CD20的可检测的标记抗体在来自脾、骨髓、外周血、淋巴结与派伊尔斑的免疫细胞上检测，并且利用FACS分析标记的细胞。
对在本发明的转基因小鼠中表达模式的检验揭示对在人B系谱细胞中发现的正常人CD20表达的反映。以细胞的百分数与表型特征考察的其它免疫学参数，包括T细胞、B细胞、NK细胞、巨噬细胞、树状细胞与嗜中性白细胞的百分数与表型特征，揭示在转基因负的与正的同窝出生仔畜之间的相似性。
E.转基因动物的运用本发明的转基因动物代表在人中CD20表达与作用的模型。相应地，这些动物在研究其起作用与相关的事件后的机制、并且生成及测试对治疗与诊断CD20有关的人类疾病包括癌症与自身免疫病症有用的产物(例如，抗体，双特异性，多特异性等等)中有用。
在有些实施方案中，转基因表达的人CD20保有与在人细胞中所显示出的类似功能特性。例如，表达人CD20的B淋巴细胞被抗-人CD20抗体所识别，并且如同在人中一样，响应人CD20抗体给药而类似地从该转基因动物中消减。如在实施例中更进一步详细描述的，在本发明的转基因小鼠中的B淋巴细胞响应用抗-人CD20抗体例如Rituxan处理而被消减。在一个实施方式中，人CD20转基因鼠特征为人CD20在细胞上的表达水平足以使与该表达细胞结合的抗人CD20抗体影响细胞的杀伤，引起的至少大约75％、和更优选80％、85％、90％、95％、99％并且甚至100％外周的及/或循环B细胞的消减。一个类似的反应在人中观察到。
相应地，在一个实施方式中，本发明的转基因动物被用于测试药剂例如抗体、多或者双特异性分子、免疫粘附素(例如对人体的安全性与效力)与靶表位，例如人CD20的区域的结合。其它药剂可以包括有或者没有Fc区域的抗体的抗原结合片段、单链抗体、微抗体(minibody)(仅有重链的抗体)、具有多聚体之一抗-人CD20抗原结合区域的异源多聚免疫粘附素。其它的药剂可以包括抑制或者导致CD20-B细胞消减的小分子，可以包括与CD20结合、但是不激活CD20的CD20配体的变体。例如，像这样的药剂消减CD20表达细胞例如恶性的B细胞的效力可以经过测量测试药剂给药前后转基因动物中B淋巴细胞水平来测定。
相应地，本发明经过给予表达人CD20的转基因动物一种药剂与确定B淋巴细胞数目是否有减少，提供鉴定能治疗B细胞淋巴瘤的药剂，以及能消减或者杀死表达人CD20的B淋巴细胞的药剂的方法。如同在这里使用的，“B细胞消减(depletion)”指在药物或者抗体处理之后同像这样的处理以前的水平比较起来，在动物或者人中B细胞水平的减少。B细胞水平利用如同在这里叙述的已知方法是可度量的。B细胞消减可以是部分的或者完全的。
优选，该药剂诱导的B细胞消减的水平是与疾病或紊乱症状的降低或者改善相关的数量。该推定的药剂的效力(即它的消耗表达CD20的B淋巴细胞的能力)可以经过测量在表达CD20的转基因动物中循环B淋巴细胞基线水平、并与相同的动物中给药之后水平相比较而评估。B细胞消减效力的比较可以针对已知治疗剂例如抗-人CD20抗体(例如Rituxan)进行，以计量该推定的药剂对于CD20有关症状治疗的效力。或者，B淋巴细胞的基线水平可以在表达人CD20的第一转基因动物的各种的组织(例如脾、骨髓、外周血、淋巴结、派伊尔斑)中测量。
该推定的药剂能随后被给予表达人CD20的第二转基因动物。动物然后被杀死，并且分析B淋巴细胞的水平。在表达人CD20的转基因动物中B淋巴细胞数目减少指示该药剂在减低与B细胞淋巴瘤有联系的癌细胞及/或在人受试者中治疗B细胞淋巴瘤的效力。也可以测试联合治疗来判定消耗该想要的细胞类型的效力。例如，抗-人CD20抗体可以与另一个药剂例如Br3-Fc结合以引起任何可能是对抗-人CD20杀伤有抗力的携带CD20的B细胞消减。
B淋巴细胞恢复还可以通过随着时间测量在一系列转基因动物中细胞水平来评估。该药剂对于人CD20的特异性可以经过比较该药剂对表达人CD20转基因小鼠的影响与对野生型小鼠(不表达CD20标志物)的影响而评估。该药剂的效力还可以与安慰剂或者对照物质例如非特异性抗体或者其它的对照剂的效应比较。优选，该药剂靶向大多数或者所有携带人CD20的细胞但是不影响提供对刺激T非依赖性免疫反应的抗原的免疫反应性的细胞。
另外，这些动物对于评估在人中免疫反应的潜力是有用的模型，因为在转基因动物中给药像这样的药剂后免疫反应的起始指示该药剂将在人中产生相同的效应。在像这样的转基因动物中对免疫反应的影响可以例如经过细胞因子水平的改变，抗体的生产或者T细胞反应来检测。另外，转基因动物可以在多或者双特异性分子给药之前被改造以包含靶细胞(例如肿瘤，病毒)。
为了在抗-CD20抗体或者双或多特异性分子给药至转基因动物后检测抗体结合，能使用任何合适的分析。例如，可以取动物血样品并且利用本领域已知的筛选试验，例如酶联免疫吸附试验(ELISA)，放射免疫测定(RIA)，或者蛋白质印迹试验分析抗CD抗体-CD复合体的存在。这些分析中的每一个通常经过使用特异于目的复合物的标志物的试剂(例如抗体)检测特定目的蛋白质-抗体复合体的存在。相应地，在本发明中，这些试验被用于检测包含在动物血清中的免疫球蛋白(例如IgG、IgA等等)与在该动物的特定细胞表面上包含的人CD标志物之间形成的CD-抗体复合物。
利用例如识别并特异地与抗体-CD标志物复合物结合的酶联抗体或者抗体片段可以检测该CD标志物-抗体复合物。或者，可以利用各种各样的其它的免疫测定中任何一种检测该复合体。例如，抗体可以是放射性标记的，并且被用于放射免疫测定(RIA)。放射性同位素可以经过像利用γ粒子计数管或者闪烁计数器或者经过放射自显影术这样的方式检测。
为了在抗体或者双或者多特异性分子或者其它的药剂给药到转基因动物后检测免疫反应，可以使用测量动物血浆或者血清中例如细胞因子、抗体或者T细胞群体浓度方面改变的任何合适的程序。例如，体内细胞因子浓度改变可以通过各种各样的免疫测定检测，例如酶免疫测定(EIA)，放射免疫测定(RIA)或者ELISPOT化验。可以被分析的示范性的细胞因子包括粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、白细胞介素1-12(IL-1至IL-12)。
例如可以从已经进行抗体、双特异性或者多特异性分子或者其它的药剂给药的转基因动物获得。可以利用EIA经过检测细胞因子与同酶偶联的抗体的交互作用测量细胞因子的浓度。用合适的底物一优选显色底物一进行反应，借助于产生可以被检测的化学部分的方法，例如，经过分光光度法、荧光的或者经过视觉的方法，来检测酶活性(Voller，“The Enzyme LinkedImmunosorbent Assay(ELISA)”，Diagnostic Horizons 21-7，1978，MicrobiologicalAssociates Quarterly Publication，Walkersville，MD；Voller，et al.，J.Clin.Pathol.31507-520(1978)；Butler，Meth.Enzymol.73482-523(1981)；Maggio，(ed.)Enzyme Immunoassay，CRC Press，Boca Raton，FL，1980；Ishikawa，et al.，(eds.)EnzymeImmunoassay，Kgaku Shoin，Tokyo，1981)。可用于检测性地标记该抗体的酶包括，但是不局限于，苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、Δ-5-甾体异构酶、酵母乙醇脱氢酶、α-甘油磷酸盐脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、辣根过氧化酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、尿素酶、过氧化氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡糖淀粉酶与乙酰胆碱酯酶。检测可以通过使用对该酶的显色底物的比色法进行。检测也可以通过视觉上将底物的酶促反应程度同类似制备的标准比较或者利用RIA进行。
也可能用荧光的化合物标记抗-细胞因子抗体或者抗CD20药剂。当荧光标记的抗体暴露于适当的波长的光时，可随后检测它的存在。最通常使用的荧光标记化合物是异硫氰酸荧光素、若丹明、藻红蛋白、藻青蛋白、别藻蓝蛋白，o-苯二甲醛与荧光胺。抗体还可以利用发荧光金属例如152铕或者其它的镧系进行可检测地标记。这些金属可以利用像金属螯合基团例如二乙烯三胺五乙酸(DTPA)或者乙二胺四乙酸(EDTA)来附于抗体。抗体也可以经过偶联其至化学发光的化合物而可检测地标记。然后经过检测在化学反应期间产生的荧光确定化学发光示踪的抗体的存在。特别有帮助的化学发光标记化合物的例子是发光氨、异氨基苯二酰肼、theromatic吖啶酯、咪唑、吖啶盐与乙二酸酯。同样地，生物发光的化合物可能用来标记抗体。生物发光是一类在生物系统中发现的化学荧光，其中催化蛋白质提高化学发光反应的效率。生物发光的蛋白质的存在经过检测荧光的存在而测定。用于标记的重要的生物发光的化合物是荧光素，荧光素酶与水母蛋白。
本发明的非人转基因动物可以更进一步提供向人给药的具体的药剂的安全性指示。例如，可以将人源化的抗体或者其它的药剂给予该转基因动物，并且作为该人源化抗体或者药剂的人体内利用的安全性与耐受性的指示、监视作为将该药剂投药给该动物的结果的任何毒性或者副作用。那些可以在短期基础上出现的不利情况包括头痛、感染、发热、寒战、疼痛、恶心、无力、咽炎、腹泻、鼻炎、灌输反应、与肌痛。短期不利情况是处理后数天内计量的。长期的副作用包括某些细胞类型的细胞毒、血小板减少导致的出血、由于炎性及/或变态反应导致的介质释放、对免疫系统的抑制和/或抗治疗剂抗体产生的抑制、终端器官毒性、感染或者恶性肿瘤发生率增加。长期的不利情况是处理后数月内计量的。
本发明的另一方面涉及测定抗CD20药剂的效力的方法。通过向一系列具有人CD20的转基因动物给予一系列剂量的该药剂、确定导致携带人CD20细胞的减少的药剂的至少一个剂量而确定效力。
本发明的转基因动物，包括细胞、组织、或者从其中衍生的其它的材料，可以作为疾病模型，特别是与携带CD20细胞有关的或者其介导的疾病模型被使用。任何物种的动物，包括然而并非限于，小鼠、大鼠、兔、豚鼠、猪、微型猪(micro-pig)、山羊，与非-人灵长目、例如狒狒，猴子，与黑猩猩可能用来产生疾病动物模型。这些系统可能用于各种各样的应用。像这样的试验可以作为筛选策略的一部分来设计鉴别药剂，例如能改善病症的化合物。因此，以动物与细胞为基础的模型可能用来鉴别可能在治疗疾病中有效的药物、药品、治疗与介入。
以细胞为基础的系统可以用来鉴别可以对改善病症起作用的化合物。例如，可以将这样的细胞系统以足够的浓度，足以引发被暴露的细胞中病症的所述改善的时间，暴露于怀疑具有改善病症能力的化合物。暴露后，检查细胞以判定疾病细胞的表现型中一个或多个是否已经转变，以与更正常的或更野生型，非-疾病表现型相似。
其它用途对于本领域技术人员来说是显而易见的。
以下非-限制性实施例举例说明本发明。
实施例实施例1本实施例叙述人CD20BAC转基因(Tg+)小鼠的产生，并且研究了抗-人CD20抗体处理在hCD20+小鼠中的效果。
利用来自Invitrogen(Invitrogen，Carlsbad，CA)的CITB人BAC-D-克隆No.117H19生产人CD20转基因小鼠。编码人CD20的DNA从人淋巴细胞中分离，并且送至Invitrogen。Invitrogen用来自人BAC文库的克隆用滤纸(against the filters)测试DNA，并且鉴定克隆117H19。先前的产生表达人CD20的转基因小鼠的尝试不成功，也许部分由于没有将足够的转录控制区域包括入转基因构建物。经过用克隆117H19制备的人CD20BAC构建物显微注射入小鼠FVB近交系的受精卵，生产转基因小鼠。受精卵孵化1-7天，然后移植入代用小鼠。基于人CD20表达的FACS分析筛选小鼠。如同可以从在图1的FACS图中看到的，用于转基因的杂合的(Tg+/-)与纯合的(Tg+/+)小鼠，在它们的B220+B细胞上表达人CD20。小鼠CD20基因没有被有意破坏。
图2提供在B细胞分化与成熟期间各种细胞表面标志物(CD43，IgM，IgD)表达的示意图。在Tg+小鼠中，hCD20在前-B、未成熟的B细胞与成熟B细胞上表达。人CD20在与人相同的细胞类型中发现，并且以与人B细胞相比，以相同的水平或稍低的水平在这些细胞类型上表达。
利用偶联至FITC的抗-人CD20抗体(BD Pharmingen)筛选Tg+小鼠在骨髓、脾、肠系膜LN与派伊尔斑(Peyer′s patches)B细胞上对于人CD20的表达(结果示于图3-6)。以B220与CD43、CD21、或者CD38对细胞门化，从而允许对来自不同组织的各种的B细胞群体进行划分。为了进行门化，细胞用偶联至PerCP的抗-B220抗体(BD Biosciences)染色，并且用偶联至PE的抗CD43抗体，抗-CD21抗体或者抗-CD38抗体(fluorescence，BectonDickinson)染色。
将在转基因小鼠外周血细胞上人CD20的表达水平与在人外周血细胞上人CD20表达水平相比较。外周血细胞获自人供体和来自hCD20Tg+小鼠，并且用标记的抗-人CD20抗体(mH27)染色。细胞用FACS分析，分别根据人CD19与B220的表达门化。图22显示代表性作图。在图上的数字表示平均荧光强度。图上的数字显示，基于平均荧光强度的比较，人CD20在转基因细胞上以在人细胞上人CD20的大约40％的水平表达。
这些结果表明获自转基因小鼠中许多不同组织的B细胞表达人CD20标志物。人CD20标志物主要地在成熟B细胞上发现，但也可以以类似于在人中观察到的模式在前-B与未成熟的B细胞中发现。
该转基因小鼠然后用抗-人CD20单克隆抗体m2H7处理，以判定该抗体处理是否将导致B细胞消减。抗体m2H7可以获得自BD PharMingen(SanDiego，CA)，eBioscience，或者Calbiochem。在体外试验中将m2H7的抗-人CD20活性与Rituxan相比较，并且具有可比拟的活性。人源化的抗体，例如Rituxan，也在细胞杀伤研究中利用，因为体内细胞杀死发生在足够短的时间，以致不用考虑对该人源化的抗体的免疫反应。
如同在图7中示意性概括的，以总计1毫克剂量给予该转基因小鼠抗体m2H7，相当于对于70公斤人而言3.5毫克。在箭头指示的日子在外周血、脾、淋巴结、骨髓、与派伊尔斑上进行FACS分析。监视抗-CD20单克隆抗体的血清水平。
单独用抗-CD20单克隆抗体(m2H7)处理Tg+小鼠导致在外周血、成熟的外周淋巴结B细胞、脾中T2与滤泡的B细胞中B细胞的消减(参见图8-11)。然而，尽管在细胞表面上有非常高，很可能是饱和水平的抗体，也观察到某些B细胞亚群对抗抗-CD20抗体杀伤。这些抗性B细胞是脾边缘区B细胞(图10)，与在派伊尔斑(图12)与脾(图14)两者的生发中心B细胞。在图14中，小鼠用第一剂量的抗-CD20单克隆抗体以100μg在第1天注射，继之以在第3天上以第二个100μg剂量注射(可能50μg单一剂量就足够饱和B细胞)。T2/滤泡的B细胞被消减，但是来自派伊尔斑生发中心的B细胞被显示与抗-CD20单克隆抗体结合但是对杀伤具抗性。
研究了抗-人CD20抗体处理后B细胞的恢复。在第1天给予小鼠抗体。图13表明抗体处理后第6天，没有检测到外周血中B细胞。在第6周，刚一清除抗体，hCD20+细胞就开始被检测，并且到第14周，B细胞似乎回升至正常水平。恢复来自前体B细胞，该细胞不表达CD20而且然后随后发展成为具有人CD20+的成熟B细胞。
图14显示FACS图，指示脾生发中心B细胞对短期(单次注射)抗-CD20单克隆抗体治疗的抵抗。小鼠是没有用绵羊红细胞免疫的，或者是在第1天由腹膜注射绵羊红细胞(SRBC)进行免疫以在脾中诱导生发中心的。生发中心在第7天出现。在第8天，一组小鼠用m2H7处理。对照组的小鼠用mIgG2a同种型对照抗体处理。在第12天对来自小鼠的脾细胞进行分析。使用对生发中心染色的PNA(花生凝集素)。在未用SRBC免疫的小鼠脾中没有可检测到生发中心细胞，而免疫小鼠的脾显示0.3％的PNA染色细胞。尽管T2/滤泡的B细胞被用抗-CD20抗体消减，脾中边缘的中心B细胞对该抗体是有抗力的。
然后，测定是否B细胞刚一消减，小鼠就能发育不依赖于T的免疫反应。在第0天，小鼠用m2H7或同种型对照抗体mIgG2a处理。在第3-7天，B细胞消减已经发生。在第7天，小鼠用肺炎链球菌IV静脉注射以诱导对多糖的反应。在第11天建立T细胞不依赖的反应。图15中显示的结果表明，用抗-人CD2 m2H7处理不影响来自边缘区与B1细胞的B细胞反应，即非消减的边缘区(MZ)与B1 B细胞给予对T-非依赖的抗原的保护。这个数据显示，体液免疫的一些方面，特别是T-非依赖的B细胞反应(在这种情况下)，尽管用抗-CD20单克隆抗体处理，仍是保留的。
总之，人CD20转基因动物在血液、骨髓、脾、淋巴结与派伊尔斑的成熟B细胞、前-B细胞与未成熟的B细胞上表达人CD20。如用FACS所测量的，人CD20在转基因细胞上以相当于人细胞上CD20的约40％的水平表达。用抗人CD20抗体处理小鼠，除了脾边缘区B细胞(图10)，和派伊尔斑(图12)与脾(图14)两者的生发中心B细胞之外，在处理3-4天之内导致B细胞的消减。不受任何学说束缚，B细胞死亡看来是由ADCC、依赖于补体的细胞毒性(CDC)或者细胞程序死亡或者该三者的组合所介导。在用抗-人CD20处理过的小鼠中观察到对T非依赖性抗原的反应，其与脾边缘区B细胞对抗-人CD20抗体导致的消减的对抗相一致。对用抗-人CD20抗体的杀伤作用有抗力的B细胞提供T-非依赖性免疫反应的保留，和/或提示如果想要消减所有的B细胞的话，可能需要联合治疗。在用抗-人CD20抗体处理后14周观察到表达人CD20的B细胞的恢复，很可能由于前体B细胞的成熟。这些结果类似于在用Rituxan处理过的人中观察到的。
实施例2这个实施例显示在抗-CD20单克隆抗体与BR3拮抗剂治疗对于B细胞调节/消减之间的协同作用。BR3-Fc是免疫粘附素，其中人BR3的三个细胞外结构域与免疫球蛋白序列——在这种情况下是人IgG1——的恒定结构域融合。
表达细菌人工染色体编码的人CD20的人CD20转基因小鼠(指定为hCD20+小鼠)用抗CD20单克隆抗体(在第9天单次注射100微克)，BR3-Fc(从第1天至第12天，100微克每隔一天注射)，或者抗-CD20与BR3-Fc单克隆抗体的联合进行腹膜内注射进行处理。每组包括4只小鼠。最后一次注射后两天，杀死小鼠，并且分析hCD20+B细胞。针对B细胞标志物(CD21+CD23+)对脾、血、淋巴结与派伊尔斑进行FACS分析。
结果表示抗-CD20单克隆抗体治疗消减多于99％的血液与淋巴结成熟循环B细胞，并且BR3-Fc处理在血与淋巴结中降低成熟循环B细胞(图16)。抗-CD20单克隆抗体治疗消减T2与滤泡的B细胞，然而并非脾中的边缘区B细胞，而BR3-Fc处理在脾中降低T2/滤泡的B细胞与边缘区B细胞。
抗-CD20单克隆抗体与BR3-Fc的联合协同消减脾中所有的B细胞群体。抗-CD20单克隆抗体消减不发生于大部分边缘区B细胞与一些滤泡的/T2脾B细胞，而BR3-Fc消减主要发生在边缘区B细胞与一些滤泡的/T2B细胞(图16)。因此，这两试剂的组合完全消减脾的B系谱的细胞。BR3-Fc、2H7以及两者的组合对派伊尔斑中的生发中心B细胞都没有影响(图17)。用抗-CD20单克隆抗体处理后浆细胞没有明显地受到影响(图18)，指示免疫反应性的一些方面在用抗-CD20抗体处理过的小鼠中仍保持着。
这些结果表明联合治疗对消减大多数B细胞是有效的。类似于人，一些转基因小鼠B细胞对用抗-CD20抗体的杀伤作用有抗性。联合治疗导致脾中对抗-CD20抗体有抗力的B细胞的消减。由此可见，该转基因小鼠还对鉴定药物的组合有用处，所述药物组合可能在那些已经具有抗-CD20抗性的细胞，或者很有侵袭性的肿瘤的情况下可能更有效。
实施例3在这个实验中，NK细胞证实在抗-CD20单克隆抗体介导的B细胞消减中起作用。
产生PK-136单克隆抗体(特异性针对小鼠NK1.1)的杂交瘤克隆从ATCC获得。分别用对照单克隆抗体、PK-136、抗-CD20单克隆抗体与PK-136/抗-CD20的联合腹膜内注射给四组人CD20转基因小鼠。给予的剂量如下对照单克隆抗体200μg/ip，3次腹膜内注射/周，共1周PK-136200μg/ip，3次腹膜内注射/周，共1周抗-CD20单克隆抗体10μg/ip，单一剂量在抗-CD20单克隆抗体ip之后第3天分析来自外周血的，淋巴结与脾的淋巴细胞。数据用平均数+/-标准误差来表示，n＝8。
该结果指示，在已检查过的组织之中(肝脏，脾与血液)用PK-136处理导致NK细胞群体大约80％至90％的减少(图19)。在多数NK细胞缺乏时，2H7介导的B细胞消减的效力降低(图20)。因此，NK细胞在抗-CD20单克隆抗体介导的B细胞消减中起作用。
在此所引用的所有出版物(包括专利与专利申请)在此全文引用作为参考。
权利要求
1.一种非-人转基因动物，其基因组包含编码人CD20的核苷酸序列。
2.根据权利要求1的转基因动物，其中所述核苷酸序列可操作地与人内源启动子连接。
3.根据权利要求2的转基因动物，所述转基因动物的细胞表达人CD20。
4.根据权利要求3的转基因动物，其中人CD20在B淋巴细胞的表面上表达。
5.根据权利要求3的转基因动物，其中人CD20在B淋巴细胞上以一种水平表达，该水平足以使得与表达细胞结合的抗人CD20抗体影响细胞的杀伤，导致B细胞的消减。
6.根据权利要求1的转基因动物，其中所述动物的基因组在编码实质上和人CD20同源的CD20分子的内源基因上包含破坏。
7.根据权利要求6的转基因动物，其中内源基因编码小鼠CD20。
8.鉴定能治疗B细胞淋巴瘤的药剂的方法，包含a)测量在根据权利要求1或者6的动物中表达人CD20的B淋巴细胞的水平；b)给予根据权利要求1或者6的动物所述药剂；并且c)测量在该动物中表达人CD20的B淋巴细胞的水平；如果用该药剂处理后，表达人CD20的B淋巴细胞数目减少，则该药剂被鉴定为能治疗B细胞淋巴瘤的药剂。
9.用根据权利要求8的方法鉴定的药剂。
10.鉴定能消减或者杀伤表达人CD20的细胞的药剂的方法，包含a)测量在根据权利要求1或者6的动物中表达人CD20的B淋巴细胞的水平；b)给予根据权利要求1或者6的动物所述药剂；并且c)测量在该动物中表达人CD20的B淋巴细胞的水平；如果在该动物中表达人CD20的B淋巴细胞数目减少，则鉴定该药剂为能消减或者杀伤表达CD20的细胞的药剂。
11.根据权利要求10的方法，其中所述细胞是癌细胞。
12.用根据权利要求11的方法鉴定的药剂。
13.来源于根据权利要求1或者6的转基因动物的细胞或者组织。
14.根据权利要求1或者6的转基因动物，其中所述动物是啮齿类动物。
15.根据权利要求14的转基因动物，其中所述啮齿类动物是小鼠。
16.测试抗-人CD20治疗的安全性的方法，所述方法包含a)测量在根据权利要求1或者6的动物中表达人CD20的B淋巴细胞的水平；b)给予根据权利要求1或者6的动物所述药剂；并且c)测量在该动物中表达人CD20的B淋巴细胞的水平；如果在该动物中表达人CD20的B淋巴细胞数目减少，则鉴定该药剂为能消减或者杀死表达CD20的细胞的药剂；d)监视该动物短期或者长期的副作用。
17.测试抗-人CD20治疗效力的方法，所述方法包含a)测量在根据权利要求1或者6的一组动物中表达人CD20的B淋巴细胞的水平；b)给予该组的每个动物不同剂量的一种药剂；并且c)测量在每个剂量之后在该动物中表达人CD20的B淋巴细胞的水平；与d)确定导致最大量B细胞消减的该药剂的至少一个剂量。
全文摘要
本发明在通常意义上涉及表达包括CD20的人细胞标志物的非－人转基因动物，以及使用该动物鉴定有效消减携带人CD20的细胞的药剂。转基因动物也对测试抗CD20治疗的安全性和效力有用。
文档编号A61KGK1751236SQ200380106303
公开日2006年3月22日 申请日期2003年12月11日 优先权日2002年12月16日
发明者安德鲁·C－Y·陈, 龚谦, 弗莱维厄斯·马丁 申请人:健泰科生物技术公司