专利名称：高通量哺乳动物细胞培养基优化方法
技术领域：
本发明涉及细胞培养、生物制药领域，更具体地涉及高通量哺乳动物细胞微培养以及活细胞浓度检测方法，用于细胞培养基成分优化。
背景技术：
重组DNA技术的发展已使蛋白质药物大规模生产、取代从生物原料提取成为可能；毫无疑问，随着人类基因组学和蛋白组学研究的开展，会有更多的基因功能得到鉴别，与之相应的将是会有更多的蛋白质药物出现并用于临床试验和疾病治疗。
蛋白质药物的生物合成有若干途径可以选择，包括哺乳动物细胞培养、微生物发酵、转基因动物和转基因植物。就目前来讲，微生物发酵主要用于不需要修饰的蛋白质药物生产，而大规模动物细胞培养主要用于翻译后需要糖基化等修饰的蛋白质的生产。虽然转基因动物、植物在蛋白质药物生产方面有大幅度降低生产成本的可能，但技术研发过程复杂，技术市场取向目前尚不能同大规模动物细胞培养相比。另外，蛋白质修饰物种之间的差异也可以对影响药物的功能和免疫反应程度造成影响。
哺乳动物细胞培养的商业化生产应用需要大量的过程研发工作奠定基础。过程研发的目的是在保证产物质量的前提下，即在保证药物性能的基础上，提高产率，降低生产成本，使实现商业利润成为可能。经过多年不断努力，大规模动物细胞培养工艺已经日趋成熟。搅拌式生物反应器目前是大规模细胞悬浮培养的首选设备，常用的操作模式有间歇和流加两种。就生产原料来说，无血清和无蛋白细胞培养基是目前大规模细胞培养的主要材料，可以摆脱昂贵的血清或蛋白质成份，避免外源生物污染(如病毒和疯牛病)、资源限制和原料生物活性不稳定性(批间差异)，提高过程稳定性和操作规范化程度，降低一般占总成本大部分的下游过程成本。
细胞培养过程优化包括培养基成分优化、反应器操作条件优化和反应器操作模式选择等几部分，而针对具体生产过程配置并优化培养基成分是现代大规模细胞培养过程研究的主要任务之一，工作量非常大。一般来说，每一细胞株都有独特要求，没有任何一种培养基会充分满足所有细胞株的需要或发挥细胞的最大生产潜力。具体培养基成份的确定需要结合细胞生长、产物产率与质量、反应器类型和操作方式及物理环境等因素整体考虑。
由于培养基成分十分复杂(含数十种生化成分)，细胞培养周期长，以往的方法如采用小型生物反应器或转瓶或摇床，培养数有限，不能在有限的时间内完成所需要的实验数量，而且分部执行又容易产生实验结果批间的不可比性，耗时、效率低、成本高。例如优化培养基成分假如培养基的化学成分有50种，每种化学成分只有2个浓度水平，如果每一个成分和每一个浓度水平搭配起来进行实验，那么所需要的培养数为250，即1.126×1015个培养，这是不可能实现的。即使采用正交实验方法，考虑到培养基组分的相互作用，实验量也在万次以上，采用常规方法也不可能完成。
针对以上实际问题，本领域技术人员主要通过合理地设计实验，简化实验方案，降低工作量，另一方面则要依靠能模拟反应器环境、操作模式的高通量细胞培养系统，提高批次实验数量来实现培养基的筛选。
刃天青，又称树脂天青、偶氮间苯四酚、树脂酚天青，英文名称Alamar Blue，Resazurin，Diazoresorcinol，Resazoin，分子式C12H7NO4，分子量229.2。由于其酚羟基在不同pH环境中解离程度不同而呈不同颜色，刃天青可用作酸碱指示剂，pH3.8(橙色)-6.5(深紫色)。刃天青经氧化还原反应，可被还原为试卤灵(Resorufin)。该反应也可以在刃天青被细胞吸收之后在细胞内完成。在真核细胞线粒体中，刃天青可以作为呼吸链电子最终受体，经酶催化，取代氧而被还原；在原核细胞中刃天青经酶催化还原的机理目前尚不清楚。由于刃天青和试卤灵在光吸收方面有较大区别，最大光吸收波长分别为573(试卤灵)和605nm(刃天青)，刃天青在605nm有最大光吸收，而试卤灵的光吸收接近于零，可应用于细胞代谢活性分析。另外，试卤灵具有荧光性质，该特性也可应用于细胞代谢活性分析，以及可以以此为指标的其它应用如化学和生化物质毒性、药物筛选等方面。
美国专利5413916(Colorimetric toxicity test，1995年)采用大肠杆菌作为生物样本、戊二醛作为细胞膜电子供体，利用刃天青的氧化还原颜色反应，建立了一个颜色毒性检测方法，反应在试管中完成，并用分光光度计测量光吸收，波长为603nm。
美国专利5501959(Antibiotic and cytotoxic drug susceptibility assaysusing resazurin and poising agents，1996年)针对刃天青在培养液中存在时间较长(如24小时)会发生自还原(Autoreduetion)现象，提出使用平衡剂(Poisingagent)并控制培养液氧还电位的方法(商品名Alamar Blue)，来降低自还原现象所引起的检测偏差。该专利用此方法结合荧光检测(激发光540-560nm，荧光580-600nm)用来检测细胞存活率，以此检测药物对肿瘤细胞的杀伤作用。
美国专利6271022(Device for incubating and monitoring multiwell assays，2001年)发明了一种可以对细胞在多孔板中监测细胞生长的仪器，其检测手段为相机和扫描仪，通过图像分析对细胞生长进行监测。该专利虽然提到将刃天青作为氧化还原指示剂使用，但未提供具体使用方法，权利要求中也未包括。
国际专利申请WO03016556(Measurement of microbiological activity in anopaque medium，2003年)针对金属冶炼流体(Metal Working Fluids)的高散射性质，通过测量未反应荧光物质和已反应荧光物质浓度并计算二者比率，来反映流体中微生物活性。
美国专利5055411(Methods used in testing human males for fertility，1991年)和美国专利5068089(Kit for testing human males for fertility，1991年)利用刃天青的氧化还原颜色反应，建立了一个人精液活性检测方法。该方法中反应在试管中完成，并用与标准色板(Color Chart)对比的方法得到检测结果。
美国专利5766875(Metabolic monitoring of cells in a microplate reader，1998年)采用双波长方法和不同pH指示剂，利用细胞代谢对生长环境pH的影响，在微孔板上检测细胞代谢活性。
国际专利申请WO0198531(Resazurin-based cytotoxicity assay，2001年)利用活肝细胞和活肝细胞株(HepG2)能首先将刃天青转化为荧光化合物试卤灵(第一信号)，再将试卤灵进一步转化为非荧光化合物(第二信号)的代谢特性，测定死亡细胞数量。该方法可应用于肝癌药物筛选和药物毒性研究。
Ahmed等(A new rapid and simple non-radioactive assay to monitor anddetermine the proliferation of 1ymphocytesan alternative to[3H]thymidineincorporation assay，Journal of Immunological Methods 170(1994)211-224)和Zhi-Jun等(A dye-based lymphocyte proliferation assay that permitsmultiple immunological analysesmRNA，cytogenetic，apotosis，andimmunophenotying studies，Journal of Immunological Methods210(1997)25-39)报导了采用刃天青作为氧化还原指示剂，用比色法检测96孔板中淋巴细胞和杂交瘤细胞的生长的方法。该方法使用普通酶标仪，分别对570nm(还原态刃天青)和600nm(氧化态刃天青)读光密度，并用(OD570nm-OD600nm)值代表细胞量。在Ahmed等的文章中，作者特别强调，刃天青必须在细胞培养初期进入到培养液中。尚未有联合细胞培养，并且在培养后加入刃天青进行活性检测，且不影响细胞存活的高通量细胞培养条件筛选方法。
因此，本领域也迫切需要一种简便的、具有良好重复性和可比性的、能够模拟反应器环境、操作模式的简单、低成本高通量细胞微培养方法，不但可以进行间歇和流加培养，也可以方便地监测细胞浓度。本领域迫切的需要可以有效地应用于细胞培养基成分优化和过程优化的快速简便的筛选方法。
发明简述本发明的目的是提供一种在多孔板(如96孔板)中细胞微培养方法，提供一种活细胞终点检测方法，可以利用酶标仪快速、简便有效地测定微培养中活细胞浓度，可以有效地应用于细胞培养基成分优化。
公开了一种细胞培养基优化的方法，该方法包括步骤a.将细胞接种到多孔板中的不同成分的培养基中，所述培养基为至少2种；b.在相同条件下培养这些细胞；c.检测活细胞数；和d.选择活细胞数最多的培养基作为优选培养基。
在该方法的一个优选例中，该培养基是无血清培养基。
在该方法的另一个优选例中，步骤c为加入刃天青，测定605nm下的光密度。更优选的，刃天青在培养结束时加入。
在该方法的另一个优选例中，检测活细胞浓度范围在0.05-10×106细胞/ml之间。
在该方法的还有一个优选例中，检测活细胞是通过酶标定法。
在该方法的还有一个优选例中，刃天青在溶液中以10-40μl/孔存在。更优选的，刃天青在溶液中以20-30μl/孔存在。
附图简述
图1显示了实施例1刃天青浓度与OD605的关系。
图2显示了实施例2溶液pH对刃天青在605nm光吸收的影响。
图3显示了实施例3温度对刃天青在605nm光吸收的影响。
图4显示了实施例4杂交瘤(4a)和CHO细胞在605nm的光吸收(4b)。
图5显示了实施例5低细胞密度条件下活细胞浓度检测(CHO)。
图6显示了实施例6高细胞密度条件下活细胞浓度检测(CHO)。
图7显示了实施例7低细胞密度条件下活细胞浓度检测(杂交瘤)。
图8显示了实施例8高细胞密度条件下活细胞浓度检测(杂交瘤)。
图9显示了实施例9刃天青在高通量细胞培养中活细胞浓度检测。
图10显示了实施例10杂交瘤培养基配方的高通量筛选。
图11显示了实施例11杂交瘤培养基组分的高通量优化-异亮氨酸。
图12显示了实施例12杂交瘤培养基组分的髙通量优化-铁复合物。
具体实施例方式
本发明利用细胞培养多孔板(如96孔板)作为细胞生长容器，以摇床作为传动装置实现流体混合，达到增加培养数量、实现高通量培养基成分优化的目的。
本发明利用活细胞对刃天青的还原反应所导致的605nm光密度降低值来反应培养中活细胞密度，可以简便地用于活细胞密度终点检测，活细胞浓度检测范围在0.05-10×106细胞/ml之间。此外，由于刃天青的氧化还原反应不影响细胞的代谢，因此不象与核或细胞器结合的试剂那样，测试后造成细胞死亡。
本文所述的高通量细胞培养方法和活细胞检测方法可以高效率地应用于细胞培养基筛选和培养基成分优化。常规的正交实验需要进行大量的重复实验，若采用常规实验设备如转瓶或发酵罐将受到实验室规模等的限制，对大量浓度变量同时实验是不可能的，而分批实验也会由于细胞接种质量和细胞计数差异等因素使批次结果间失去可比性。而本发明在一块96孔板中就可进行几组甚至几十组实验，而且培养规模小、速度快，结合简便的细胞浓度检测方法，大大节约了研究成本，对于细胞培养条件的研究是一个重要的进步。
下文提供了实施例进一步说明了本发明。这些例子不是为了限制本发明的范围。
实施例实施例1刃天青浓度与605nm光吸收的关系(1)在96孔细胞培养板中分别加入100μl无血清培养基(本实验室配制)；(2)每孔分别加入刃天青溶液(Sigma，1.2mM，pH7.5 PBS)5、10、20、30、40和50μl，每种浓度重复4个孔，混匀；(3)以无血清培养基作为空白对照，用酶标仪(Microplate Reader 550，Bio-Rad)读取605nm光密度。
实验结果表明(见图1)，刃天青浓度在一定范围与OD605呈线性关系；从信号大小方面看出，刃天青溶液比例在20-30μl左右时比较适中。
实施例2溶液pH对刃天青自605nm光吸收的影响(1)分别配制pH5.0、5.5、6.5、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0缓冲液(pH5.5-6.0为柠檬酸缓冲液，pH6.5-8.0为磷酸盐缓冲液，pH8.5-9.0为Tris-HCl缓冲液)；(2)分别加入100μl缓冲液到96孔细胞培养板(Corning)中，每种pH重复4个孔；(3)每孔加入刃天青溶液20μl，混匀；(4)以对应缓冲液作为空白对照，用酶标仪读取605nm光密度。
实验结果表明(见图2)，在5.0-6.0范围内pH对刃天青在605nm光吸收影响很大，而在6.5-9.0范围内pH影响很小。
实施例3温度对刃天青OD605nm光吸收的影响(1)在96孔细胞培养板中分别加入100μl无血清培养基；(2)每孔分别加入刃天青溶液5、10、20、30、40和50μl，每种浓度重复4个孔，混匀；(3)将96孔细胞培养板4℃放置20分钟后用酶标仪读取605nm光密度；(4)将96孔细胞培养板室温放置20分钟后用酶标仪读取605nm光密度；(5)将96孔细胞培养板37℃放置20分钟后用酶标仪读取605nm光密度。
实验结果表明(见图3)，在4-37℃范围内温度对刃天青在605nm光密度基本上没有影响。
实施例4杂交瘤细胞(鼠源，融合伴侣细胞为SP2/0)和中国仓鼠卵巢细胞(ATCCCRL9096，DHFR缺陷型)在605nm的光吸收(1)细胞计数，用无血清培养基配成细胞悬液，在96孔细胞培养板的第1列中加入200μl细胞悬液；(2)分别在培养板的第2-12列中加入100μl无血清培养基；(3)在第一列中取出100μl细胞加入第2列，吹打混匀后取出100μl加入第3列；(4)重复以上操作至第12列后，取出100μl丢弃；至此细胞从第1列至第12列倍比稀释完成；(5)用酶标仪读取605nm光密度。
实验结果表明(见图4a和4b)，在较低的细胞密度时，由细胞本身产生的605nm光密度保持在很低的水平，与刃天青产生的光密度相比，由细胞密度引入的误差可以忽略。如果细胞密度较高(如杂交瘤细胞密度在106/ml以上，CHO细胞密度在5×106/ml以上)，细胞所引起的光密度仍占总光吸收的很小部分，但可以采取对照实验排除。
实施例5低细胞密度条件下活细胞浓度检测(CHO)(1)细胞计数，用无血清培养基配成1×106细胞/ml的细胞悬液，分别在96孔细胞培养板的第1列中加入200μl；(2)分别在培养板的第2-12列中加入100μl无血清培养基；(3)在第一列中取出100μl细胞加入第2列，吹打混匀后取出100μl加入第3列。重复3.的操作至第12列后，取出100μl丢弃；至此细胞从第1列至第12列倍比稀释完成；(4)依次加入30μl刃天青溶液；(5)用酶标仪读取0时605nm光密度；此后分别在20、60、90、120、180、240分钟各读数一次，读数间隔期间将培养板放置在37℃ CO2培养箱中。
实验结果见图5，在细胞密度0.05-1×106细胞/ml范围内，反应时间60分钟后，刃天青在605nm的光密度减少与细胞浓度呈线性关系。
实施例6髙细胞密度条件下活细胞浓度检测(CHO)
(1)细胞计数，用无血清培养基配成10×106细胞/ml的细胞悬液，分别在96孔细胞培养板的第1列中加入200μl；(2)分别在培养板的第2-12列中加入100μl无血清培养基；(3)在第一列中取出100μl细胞加入第2列，吹打混匀后取出100μl加入第3列。重复3.的操作至第12列后，取出100μl丢弃；至此细胞从第1列至第12列倍比稀释完成；(4)依次加入30μl刃天青溶液；(5)用酶标仪读取0时605nm光密度，此后分别在15、20、25、30分钟各读数一次，读数间隔期间将培养板放置在37℃ CO2培养箱中。
实验结果表明(见图6)，在细胞浓度为1-10×106/ml范围内，反应时间20分钟后，刃天青在605nm的光密度减少与细胞浓度呈线性关系。
实施例7低细胞密度条件下活细胞浓度检测(杂交瘤)(1)细胞计数，用无血清培养基配成1×106细胞/ml的细胞悬液，分别在96孔细胞培养板的第1列中加入200μl；(2)分别在培养板的第2-12列中加入100μl无血清培养基；(3)在第一列中取出100μl细胞加入第2列，吹打混匀后取出100μl加入第3列。重复(3)的操作至第12列后，取出100μl丢弃；至此细胞从第1列至第12列倍比稀释完成；(4)依次加入20μl刃天青溶液；(5)用酶标仪读取0时605nm光密度，此后分别在60、90、120、180、240分钟各读数一次，读数间隔期间将培养板放置在37℃ CO2培养箱中。
实验结果表明(见图7)，在细胞密度0.05-1×106细胞/ml范围内，反应时间90分钟后刃天青在605nm的光密度减少与细胞浓度呈线性关系。
实施例8髙细胞密度条件下活细胞浓度检测(杂交瘤)(1)细胞计数，用无血清培养基配成10×106细胞/ml的细胞悬液，分别在96孔细胞培养板的第1列中加入200μl；(2)分别在培养板的第2-12列中加入100μl无血清培养基；(3)在第一列中取出100μl细胞加入第2列，吹打混匀后取出100μl加入第3列。重复3.的操作至第12列后，取出100μl丢弃；至此细胞从第1列至第12列倍比稀释完成；(4)依次加入20μl刃天青溶液；(5)用酶标仪读取0时605nm光密度，此后分别在15、20、30、90分钟各读数一次，读数间隔期间将培养板放置在37℃ CO2培养箱中。
实验结果表明(见图8)，在细胞浓度为1-10×106/ml范围内，反应时间20分钟后刃天青在605nm的光密度减少与细胞浓度呈线性关系。
实施例9刃天青在髙通量细胞培养中活细胞浓度检测(1)杂交瘤细胞计数，并用无血清培养基配成1×105细胞/ml的细胞悬液，在96孔细胞培养板的第A、B排中分别加入110μl细胞悬液。共接种5块培养板，放入37℃ CO2培养箱中培养；(2)24小时后取出一块培养板，反复吹打混匀B1-B12孔中的细胞，每孔取出50μl细胞悬液，台盼蓝染色后用血球计数板计数活细胞；(3)在培养板的F-H排做细胞测活的标准曲线，按照实施例8的实验步骤1-4稀释细胞；(4)在A、F-H排分别加入刃天青，每孔20μl；(5)用酶标仪读取0时605nm光密度，此后在20和90分钟各读数一次，读数间隔期间将培养板放置在培养箱中；(6)分别在第48、60、72和84小时取出一块培养板重复以上检测。
实验结果表明(见图9)，两种活细胞检测方法相比较，刃天青法测得的活细胞数比台盼蓝法测得的活细胞数高，但是两者的趋势一致，具有可比性。
实施例10杂交瘤培养基配方的髙通量筛选(1)在96孔细胞培养板中分别加入100μl不同配方的培养基(从A到H依次为F1、F2、F3、F4、F5、F6、F7、F8)，每种配方重复4个孔；(2)细胞离心，弃去上清，用PBS洗两遍，再用PBS悬浮、计数。用PBS配成1×106细胞/ml的细胞悬液，每孔分别加入10μl，放入37℃ CO2培养箱中摇床培养；(3)48小时后取出培养板，每孔中加入20μl刃天青溶液；(4)用酶标仪读取0时605nm的光密度，在20和90分钟分别读取605nm光密度，读数间隔期间将培养板放置在培养箱中；
(5)按照实施例7的实验步骤在培养板中作细胞标准曲线，计算活细胞数。
实验结果表明(图10)，该方法可以用于培养基配方的高通量筛选。
实施例11杂交瘤培养基组分的髙通量优化-异亮氨酸(1)在96孔细胞培养板中分别加入100μl无血清培养基，在A7-A9孔中分别加入100μl含50mM异亮氨酸(Isoleucine)的无血清培养基，吹打混匀后取出100μl加入B7-B9孔。重复上述操作，倍比稀释至H7-H9，混匀后取出100μl丢弃。至此细胞从第1排至第8排倍比稀释完成，异亮氨酸浓度分别为25.15、12.65、6.40、3.28、1.71、0.93、0.54、0.35mM；(2)细胞离心，弃去上清，用PBS洗两遍，用PBS悬浮；细胞计数，用PBS配成1×106细胞/ml的细胞悬液，在培养板的各孔中分别加入10μl，放入37℃ CO2培养箱中摇床培养；(3)48小时后取出，每孔分别加入20μl刃天青溶液；(4)用酶标仪读取0时605nm的光密度，在20和90分钟分别读取605nm光密度，读数间隔期间将培养板放置在培养箱中；(5)按照实施例7的实验步骤在培养板中作细胞标准曲线，计算活细胞数。
实验结果表明(图11)，当异亮氨酸浓度过高时对细胞生长有抑制作用，但可以告知培养基中可使用的最高浓度，从而用于培养基中的单一成分的优化。
实施例12杂交瘤培养基组分的髙通量优化-铁复合物(1)在96孔细胞培养板中分别加入100μl无血清培养基，在A10-A12孔中分别加入100μl含500倍浓度铁复合物的无血清培养基，吹打混匀后取出100μl加入B10-B12孔，重复上述操作，倍比稀释至H10-H12，混匀后取出100μl丢弃。至此细胞从第1排至第8排倍比稀释完成，Fe复合物浓度分别为500、250、125、63、31、16、8、4倍浓度；(2)细胞离心，弃去上清，用PBS洗两遍，用PBS悬浮；细胞计数，用PBS配成1×106细胞/ml的细胞悬液，在培养板的各孔中分别加入10μl，放入37℃ CO2培养箱中摇床培养；(3)48小时后取出，每孔分别加入20μl刃天青溶液；(4)用酶标仪读取0时605nm的光密度，在20和90分钟分别读取605nm光密度，读数间隔期间将培养板放置在培养箱中；
(5)按照实施例7的实验步骤在培养板中做细胞标准曲线，计算活细胞数。
实验结果表明(图12)，当铁复合物浓度过高时对细胞生长有抑制作用，但可以告知培养基中可使用的最高浓度，从而用于培养基中的单一成分的优化。
权利要求
1.一种细胞培养基优化的方法，其特征在于，该方法包括步骤a.将细胞接种到多孔板中的不同成分的培养基中，所述培养基为至少2种；b.在相同条件下培养这些细胞；c.检测活细胞数；和d.选择活细胞数最多的培养基作为优选培养基。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养基是无血清培养基。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤c为加入刃天青，测定605nm下的光密度。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所检测活细胞浓度范围在0.05-10×106细胞/ml之间。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述检测活细胞是通过酶标定法。
6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，刃天青在培养结束时加入。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述刃天青在溶液中以10-40μl/孔存在。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述刃天青在溶液中以20-30μl/孔存在。
全文摘要
公开了一种细胞培养基优化的方法，该方法包括步骤a.将细胞接种到多孔板中的不同成分的培养基中，所述培养基为至少2种；b.在相同条件下培养这些细胞；c.检测活细胞数；和d.选择活细胞数最多的培养基作为优选培养基。
文档编号C12N5/06GK1778899SQ20041008434
公开日2006年5月31日 申请日期2004年11月19日 优先权日2004年11月19日
发明者沈秉谦, 贡向辉, 杨胜利 申请人:上海中科伍佰豪生物工程有限公司