专利名称：利用数据性状位点信息进行作物功能基因电子克隆的方法
技术领域：
本发明属功能基因电子克隆技术领域，具体涉及一种利用数据性状位点(QTL)信息进行作物功能基因电子克隆的方法。
背景技术：
电子克隆是近年来伴随着基因组计划和EST(表达序列标签)计划发展起来的基因克隆新方法，主要原理是利用日益发展的生物信息学技术，借助电子计算机的巨大运算能力，通过EST或基因组的序列组装和拼接，利用RT-PCR(逆转录-聚合酶链式反应)的方法快速获得功能基因，具有投入低、速度快、技术要求低和针对性强等优点。随着水稻基因组计划的实施，已有研究人员利用电子克隆的方法克隆了很多水稻的功能基因。目前利用电子克隆进行作物功能基因发掘的方法有两种1利用EST数据库信息利用EST数据库信息进行功能基因的电子克隆是目前最常用的手段，其实验流程见图1。首先选择感兴趣的目标作物EST作为查询探针，搜索该作物dbEST(非冗余EST)数据库，找到部分重叠的EST进行拼接，然后再以拼接好的EST重叠群(EST contig)为新的查询探针，继续搜索dbEST库，直到没有新的EST可供拼接为止，最后根据拼接好的完整序列设计PCR引物，通过RT-PCR的方法获得目的cDNA(互补脱氧核糖核酸)克隆并进行序列测定验证。除了利用该作物EST作查询探针外，还可以选择其他物种尤其是亲缘关系较近的物种全长或EST作为查询探针，搜索该作物的dbEST库，进而拼接成完整的cDNA序列，其主要理论依据是不同物种同类基因之间存在序列保守性。
2利用基因组信息随着越来越多的植物的全长基因组序列测序的完成，并供全世界免费使用，促进了植物功能基因的电子克隆。利用基因组信息资料进行电子克隆的最大优点就是基因的克隆不受作物发育时期或特殊环境条件的限制，可以用来源于任何时期或组织的该作物和其他作物的EST或全长cDNA序列作为信息探针，搜索GenBanki(核苷酸数据库)，随后根据内含子“GU...AG”的规则通过人工拼接或相应的计算机软件预测，可以得到该基因完整的开放读码框(ORF)，根据拼接的序列结果设计PCR引物，进一步采取RT-CR的方法获得目的基因的cDNA克隆并进行序列测定，具体实验流程见图2。
发明内容
本发明的目的在于针对作物的QTL信息中包含有大量的功能基因，提出一种具有广泛适用性的对作物进行功能基因电子克隆的方法。
本发明提出的进行作物功能基因电子克隆的方法，是利用作物抗逆相关的QTL(数据性状位点)信息进行功能基因的电子克隆，是在上述两种电子克隆方法基础上加以创新而形成的一种新的电子克隆方法。该方法对物种并没有特异性，只要被研究的物种有相关的QTL及EST信息，且该作物的基因组已经测序，均可以采用该方法进行基因发掘，故具有广泛的适用性。其实验流程见图3。具体步骤如下选择感兴趣的QTL作为查询探针，利用QTL内部的核苷酸序列进行分析1、利用QTL内部的核苷酸序列搜索dbEST库，找到与该序列同源的所有抗逆相关的EST序列；2、利用基因预测软件(如Genscan(http//ccr-081.mit.edu/GENSCAN.html)和Fgenesh(http//www.softberry.com)软件)对该QTL序列进行基因预测，找到该序列内部所有涉及的基因；3、将该序列与该作物基因组BAC(细菌人工染色体)文库进行同源比对，以找到该序列所对应的作物基因组BAC文库；4、综合上述三个步骤的结果，将EST序列定位在基因预测结果的相对位置，由于一个EST对应一个功能基因，故与EST匹配的预测基因可能为抗逆相关的基因；同时用这些预测的功能基因与作物BAC文库中预测的功能基因进行比较，以进一步预测结果的准确性；5、最后根据预测的功能基因设计PCR引物，通过RT-PCR的方法获得目的cDNA克隆并进行序列测定验证。
通过该方法，可以方便、快捷的得到QTL中控制目标性状的基因，而且由于这些功能基因均对应相应的抗逆EST序列，故预测结果的可靠性较高，是一种发现QTL内部所包含的功能基因，并阐明QTL和基因之间的相互关系的一种新方法。
图1为利用作物EST数据库进行电子克隆的方法流程图，说明*基本局域网联配搜寻工具，一种序列对齐算法和软件。
图2为利用作物基因组信息进行功能基因电子克隆的方法的流程图。
图3为利用作物抗逆QTL信息进行功能基因发掘的方法的流程图。
具体实施例方式
以水稻为例，具体的操作过程为1、选择感兴趣的QTL作为查询探针，到Cornell水稻基因数据库网站(http//stein.cshl.org/)和日本水稻基因组计划网站(http//rgp.dna.affrc.go.jp)获得该QTL两端的分子标记信息及两分子标记之间的基因组序列。
2、利用该基因组序列到NCBI网站(http//www.ncbi.nih.gov/)搜索dbEST库，找到与该序列同源的所有抗逆相关的EST序列。
3、利用基因预测软件Genscan(http//ccr-081.mit.edu/GENSCAN.html)和Fgenesh(http//www.softberry.com)软件对该序列进行基因预测，找到该序列内部所有涉及的基因。
4、将该序列与该作物基因组BAC(细菌人工染色体)文库进行同源比对，以找到该序列所对应的水稻基因组BAC文库。
5、综合上述三个步骤的结果，将EST序列定位在所匹配的基因对应位置，由于一个EST对应一个功能基因，故与EST匹配的预测基因可能为抗逆相关的基因；同时用这些预测的功能基因与水稻BAC文库中预测的功能基因进行比较，以进一步预测结果的准确性。
6、最后根据预测的功能基因设计PCR引物，通过RT-PCR的方法获得目的cDNA克隆并进行实验验证。
利用该方法，我们对部分水稻QTL区间进行了分析，结果表明绝大多数的QTL标记区间均与一到多个抗逆相关EST同源，由于EST代表一个功能基因的部分cDNA表达序列，故确定这些QTL区间存在着一到多个与抗逆有关的基因。部分结果如下染色体4上控制根基粗(root thickness)的QTL标记区间RZ23--RM255对应的核苷酸序列长度为910KB，与dbEST数据库进行BLAST分析，发现有14个抗逆相关的EST与之匹配，其中EST----CA763678与拟南芥中的锌指蛋白(RING finger-like protein)相似，而锌指蛋白是与植物抗逆密切相关的一类蛋白。两个EST(CA759506、CA759507)与醛糖还原酶基因(aldose reductase-related protein)序列同源，该基因已证明与水稻抗逆性密切相关。此外，CA753947与乙烯应答因子结合蛋白(ethylene-responsive element binding protein)同源，该乙烯被认为在植物抗逆反应中起着重要作用的调控因子，可见在QTL区间RZ23-RM255内至少存在着3个与抗逆相关的基因。
染色体3上控制水稻分蘖数和植株高度性状的QTL区间RZ519～RZ448之间的核苷酸序与3个水稻抗逆EST高度同源，分别是CA759165(与受体激酶有关)、CA765696、CA756047(与葡萄糖磷酸变位酶基因有关)；该序列位于genebank标记号为AC082645的BAC基因组文库内，位于该文库内部94892----119035bp处。综合该文库的信息及基因预测软件的结果，发现该QTL内部只存在4个基因，其中有一个基因与CA759165、CA765696两个EST匹配，故可以预测该基因为与抗逆密切相关的受体激酶基因(putativereceptor kinase)；此外还有一个与CA756047匹配的基因预测为葡萄糖磷酸变位酶基因(phosphoglucomutase)，该基因也在水稻抗逆胁迫下发挥重要作用。
权利要求
1.一种进行作物功能基因电子克隆的方法，其特征在于利用作物抗逆相关的数据性状位点-QTL信息进行功能基因的电子克隆，具体步骤如下选择感兴趣的QTL作为查询探针，利用QTL内部的核苷酸序列进行如下分析(1)利用QTL内部的核苷酸序列搜索dbEST库，找到与该序列同源的所有抗逆相关的EST序列；(2)利用基因预测软件对该QTL序列进行基因预测，找到该序列内部所有涉及的基因；(3)将该序列与该作物基因组BAC文库进行同源比对，以找到该序列所对应的作物基因组BAC文库；(4)综合上述三个步骤的结果，将EST序列定位在基因预测结果的相对位置，同时用这些预测的功能基因与作物BAC文库中预测的功能基因进行比较，以进一步预测结果的准备性；(5)最后根据预测的功能基因设计PCR引物，通过RT-PCR的方法获得目的cDNA克隆并进行序列测定验证。
全文摘要
本发明属功能基因电子克隆技术领域，具体为一种利用与作物抗道相关的QTL信息进行作物功能基因电子克隆的方法。该方法选择感兴趣的QTL作为查询探针，利用QTL内部的核苷酸序列进行分析，包括利用QTL序列搜索dbEST库，利用基因预测软件对该QTL序列进行基因预测，并将该序列与该作物基因组BAC文库进行同源比对等步骤，最后根据预测的功能基因设计PCR引物，通过RT－PCR方法获得cDNA克隆。本发明方法预测结果的可靠性高，是发现QTL内部所包含功能基因的一种新方法。本方法对作物没有特异性要求，故具有广泛的适用性。
文档编号C12N15/10GK1683530SQ20041008457
公开日2005年10月19日 申请日期2004年11月25日 优先权日2004年11月25日
发明者曾华宗, 罗利军, 钟扬 申请人:复旦大学, 上海市农业生物基因中心