专利名称：利用激光制备的纳米沟槽调控细胞定向排列的方法
技术领域：
本发明涉及一种调控细胞定向生长和排列的方法，具体涉及一种利用激光的LIPS(laser induced periodic surface structures)技术在细胞培养基质表面制备纳米沟槽，进而进行细胞培养诱导和控制细胞定向生长和排列的方法，属于生物材料范畴，可用于细胞生物学、种植体和组织工程领域的研究以及生物传感器的研制。
背景技术：
组织工程中器官与组织的修复和移植、细胞传感器、药物研制、生物芯片、人工神经网络和生命机理的研究等领域的发展，要求定向控制细胞的生长和排列。细胞作为生命体的最小单位，几乎能进行生命体的所有功能，如代谢、遗传、信息传输等。各种生命技术相关的研究在从理论走向实际应用于动物和人体的过程中，以细胞为基础的研究以及细胞培养是必不可少的重要环节。动物细胞绝大多数属于贴壁依附型生长的细胞，细胞只有贴附基质表面才能正常生长和增殖。在传统的细胞培养基质上，人们往往注重基质表面的生物化学特性，而忽略了基质表面的物理特性(如表面形貌、硬度等)，细胞培养几乎全在二维平面上进行，生长在其表面的细胞全部是任意地取向和无序地排列。随着上世纪九十年代组织工程的发展，要求三维细胞支架来调控细胞行为，人们意识到传统培养方式的局限性；同时，生物传感器、种植体和组织修复的发展也对器件或器具的表面形貌特性提出更高的要求，以期实现微区细胞行为的人为可调控。然而，传统的技术手段无法满足这一要求。利用基质表面修饰诱导细胞定向生长和排列是新涌现出来的方法。细胞培养的创始人之一Harrison早在1912年就发现细胞沿蛛丝取向生长这一现象[Anat.Rec.，1912，6182-193]。后来Weiss把细胞沿沟槽形貌取向生长和排列的行为称之为“接触引导(Contact guidance)”[J.Exp.Zoo.，100353-386]。一般采取的手段是在培养基质表面产生沟槽形貌，利用沟槽形貌导向细胞的生长和排列。如利用电子束或离子束对硅片或石英的刻蚀来制作沟槽，沟槽的尺度在1-50μm[J.Cell Sci.，9973-77]；或者利用有沟槽的硅片或石英为母板，在聚合物上模塑[Biomaterials 191861-1868]。单纯利用有沟槽硅片或石英作为培养基质，制作成本高、效率低，且硅片或石英也不适于通常的细胞培养；利用聚合物上模塑产生沟槽，在模塑过程中温度会使聚合物表面其他部分也发生变形，而且脱模过程中也会造成图形缺陷或变形，这种现象对小尺寸的沟槽影响尤为明显。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提出一种利用激光LIPS技术在细胞培养基质表面制备的纳米沟槽来调控细胞定向生长和排列的方法，简化工艺，降低成本，能实现细胞在培养基质表面定域和定向有序生长和排列，满足细胞生物学研究、医用种植体、组织工程及药理病理研究的需要。
为实现上述目标，本发明选用通用的医用聚合物材料作为细胞培养基质，采用激光扫描辐照的方法，对培养基质表面进行处理，使其形成微米/纳米或亚微米/纳米表面沟槽结构，然后对细胞培养基质进行消毒处理，选择生长状态良好的贴壁依附型生长的细胞，胰酶消化后，以一定的密度，均匀接种于培养基质表面，放入培养箱培养，根据细胞类型调节培养条件。由于培养基质表面沟槽形貌对细胞生长的调控作用，使细胞沿着微沟槽的方向定向生长和排列。
本发明的具体步骤包括1、培养基质表面沟槽化处理本发明采用聚合物基材作细胞培养基质，用激光方法在聚合物表面形成周期性的纳米或亚微米沟槽结构。将激光器产生的激光经过偏振片形成偏振激光，通过扫描辐照的方式处理培养基质表面。激光的脉冲宽度为5-20ns，脉冲频率为5-10Hz，入射光束的入射角度可以从0°变化到30°，入射光束功率密度为5-30mJ/cm2，偏振方向为面内偏振，扫描速率为0.01-30mm/s。经20-50/cm2的能量、波长为266nm的偏振激光辐射，在聚合物表面形成周期性的纳米或亚微米沟槽。沟槽的方向可以任意调节，变化激光偏振方向与样品的夹角，可以实现沟槽的方向从0°到90°变化，在样品表面制备不同方向的纳米沟槽。扩大扫描范围，可实现样品表面处理范围的大面积化。聚合物材料对所使用的激光波长有吸收是实现器皿表面有效处理的必要条件。激光波长可选择紫外区或可见区，根据聚合物材料的光吸收波长选择。
2、培养基质的消毒处理将经过上述处理的聚合物培养基质，选用紫外灯辐照1-2小时，或采用环氧乙烷气体消毒30分钟，或利用75％医用酒精浸泡24小时进行消毒处理后，用作细胞培养。
3、细胞培养选择生长状态良好的贴壁依附型生长的细胞，胰酶消化后，以1.0×104个/cm2，均匀接种于基质表面，在培养箱培养6个小时后，在倒置相差显微镜下可以观察到细胞沿着沟槽的方向取向生长和排列。
激光诱导聚合物表面形成纳米或亚微米沟槽的原因是当入射光照射到聚合物样品表面时，散射波与入射光发生干涉，从而在聚合物表面引起能量以及温度的周期性分布。聚合物分子链在应力场的作用下从温度高的区域向温度低的区域运动，经过一定数量的激光脉冲后聚合物表面形成周期性纳米沟槽。纳米沟槽的尺度大小与激光辐照能量、入射角度以及材料本身的性质有关。
本发明所述的聚合物材料培养基质可以制成各种尺寸形状的样品，包括聚合物薄膜、支架或细胞培养皿等。所取材料包括聚碳酸酯(PC)、聚苯乙烯(PS)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚对苯二甲酸丁二醇酯(PBT)、聚酰亚胺(PI)等高分子材料。
本发明采用激光直接在聚合物基材表面制备纳米沟槽结构，不需要其他的中间步骤或表面处理工艺，方法简化、成本低，既可大面积又可微区定域制作纳米沟槽结构；纳米沟槽方向可随意调控，纳米沟槽的大小在一定的范围内(周期200-300nm；深度30-70nm)可以调控。
本发明选用的细胞培养基质可以为细胞和组织培养最通用的医用聚合物材料，选材面宽，应用范围广。本发明工艺简单，可操作性强，制备的表面带有沟槽状培养基质具有成本低、透光性好、显微镜观察方便、适于各种生物学表征方便适用性广的特点。培养基表面定域和定向生长、排列的细胞，可用作细胞生物学研究模型，适合于多种细胞生物学基础研究；可用于细胞和组织芯片的研制；可用于制作以活细胞为基础的生物传感器；可作为导向装置，诱导神经组织的修复以及作为细胞支架应用于组织工程研究等。
图1为原子力显微镜表征的纳米沟槽形貌特征。
图1中，A为没有处理的PS基质表面形貌；B为激光处理后，具有有序纳米沟槽的PS基质表面形貌。
图2为光学显微镜下C6细胞在具有纳米沟槽的PS表面的取向特性照片。
图2中细胞培养时间为24小时，纳米沟槽方向为箭头所示方向。
图3为原子力显微镜表征C6细胞纳米沟槽上取向时细胞突起与纳米沟槽关系照片。
图3中，A为二维平面图，B为三维立体图。
图4为纳米沟槽调控骨髓基质干细胞(MSCs)诱导分化为成骨细胞的定向生长照片。
图4中，A为细胞培养4天后的光学照片，B为细胞培养20小时后的照片，C为成骨细胞培养14天后的SEM照片。
图5为利用培养基质表面微区纳米沟槽方向的变化来调控生长细胞的取向，制备不同排列方向的细胞图形的照片。
图5中，A为有沟槽区域沟槽方向与没有沟槽区域垂直，B为有沟槽区域沟槽方向与没有沟槽区域成30°的角，C为两个沟槽方向互相垂直的微区中间被100μm宽的没有沟槽区域隔开，D为两个沟槽方向互相垂直的微区靠近在一起。
具体实施例方式
以下通过附图及具体的实施例对本发明的技术方案作进一步描述。
细胞培养基质材料中最常用的是聚苯乙烯(PS)材料，它本身价格低廉，对细胞或组织无毒性，易于制成各种尺寸大小和形状的样品。另外，PS有很好的透光性，可利用各种光学显微镜，在静态或动态条件下对生长在其上的细胞进行观察，研究纳米沟槽对细胞行为的影响。因此本发明中以PS为例作为细胞培养的基材。但实施例并不构成对本发明培养基取材的限定。
实施例1纳米沟槽调控大鼠神经胶质瘤(C6)细胞定向生长和排列。
1、PS聚合物表面纳米沟槽制备选用Nd:YAG激光4倍频的装置，使激光器输出激光的波长为266nm；同时，用266nm波长的反射镜组使激光垂直地到达移动平台表面。将洁净的PS培养皿(35mm)固定在一个X-Y移动操作平台上的支架上。开启激光器，预热40分钟后，激光产生并稳定输出。激光的脉冲宽度为6ns，频率为10Hz。用能量计检测并调节激光能量，使其到达样品表面的能量为30mJ/cm2；同时，调节激光的入射角度为20°，入射光为S偏振光。开启计算机中移动平台的控制程序，使平台在X-Y平面内精确地移动，其中平台在X方向的移动速度为0.01mm/s，在Y方向的移动速度为15mm/s。这样，激光对PS培养皿表面进行扫描辐照，即可以在样品表面制得纳米沟槽。改变Y方向的移动速度和扫描时间可以获得不同面积大小的纳米沟槽区域。用原子力显微镜对没有纳米沟槽和有纳米沟槽的PS表面的形貌特征进行表征，见图1。制备的纳米沟槽如图1B所示，纳米沟槽的周期约210nm，深度约30-40nm；而没有经过激光处理的PS表面为大小不一的、极不规则的微米和纳米尺度共混的结构，见图1A。
2、培养基质浸泡在75％的医用酒精中24小时进行消毒，然后取出置于无菌操作台中晾干。
3、细胞培养C6细胞在含有10％(Vol/Vol)胎牛血清的高糖DMEM培养基培养液中培养，利用其在培养瓶的传代来维持细胞系。取生长状态良好的细胞用0.25％胰蛋白酶(Sigma公司)消化后，以1×104个细胞/cm2接种于激光处理过的PS样品表面。然后置于温度为37℃和CO2浓度为5％的培养箱中培养。
实验结果图2为C6细胞培养24小时后，活细胞用光学显微镜观察得到的照片；图3为C6细胞用戊二醛固定，50％、75％、90％和100％酒精逐步脱水后，采原子力显微镜观察(接触模式)，得到细胞突起与纳米沟槽关系的图像；其中(A)二维平面图，(B)三维立体图。可以看出C6细胞的取向和排列的方向与纳米沟槽的方向一致，且细胞的突起也沿着表面的纳米沟槽方向。
实施例2纳米沟槽调控骨髓基质干细胞(MSC)诱导分化为成骨细胞的定向生长。
1、纳米沟槽制作激光的能量为50mJ/cm2，调节激光的入射角度为30°，平台在X方向的移动速度为0.015mm/s，在Y方向的移动速度为30mm/s。其他同实例1。
2、培养基质浸泡在75％的医用酒精中24小时进行消毒，然后取出置于无菌操作台中晾干。
3、MSCs细胞培养诱导骨髓基质干细胞定向分化成成骨细胞的培养液组成含有100nmol/L地塞米松(Sigma)，50μg/ml维生素C(Sigma，培养纯)，10mmol/Lβ-磷酸甘油，高糖的DMEM(Sigma)，15％胎牛血清。
取4月龄的新西兰大白兔一只，1％戊巴比妥纳(1ml/kg)耳缘静脉注射麻醉，在严格无菌条件下进行操作。取股骨中段为穿刺点，抽取4ml骨髓，加入到90mm的PS培养皿(Corning)中，用含诱导剂的培养液全骨髓法进行原代培养。每隔三天换液一次，换液时倒去血细胞。三次换液后，血细胞已不复存在，培养皿中已形成成纤维细胞集落，细胞呈梭型，细胞排列有一定的方向性，局部呈漩涡样生长，细胞界线不清。这时的细胞已可以进行传代。传代后，继续用含诱导剂的培养液培养。传代三次后，细胞表型趋于稳定，细胞的生长力也最旺盛。这时将细胞用0.25％胰蛋白酶消化，以5.0×103个细胞/cm2接种到激光处理且含有纳米结构的PS基片上，用不含诱导剂的高糖的DMEM培养液(含10％胎牛血清)培养。细胞培养过程中的显微观察见图4。图4中，(A)为细胞培养4天后的光学照片，可以看出绝大多数细胞沿着纳米沟槽的方向排列；(B)为细胞培养20小时后的照片，通过激光共聚焦显微观察细胞骨架，可以看出细胞肌动蛋白纤维发生了取向排列，开始沿着纳米沟槽方向延伸和生长；(C)细胞培养14天后的照片，从照片已经看出细胞内有骨结节出现，细胞分泌的胶原纤维也沿着纳米沟槽方向排列。
实施例3利用纳米沟槽方向的变化来制备细胞图形1.根据纳米沟槽可以控制细胞在确定方向取向生长和排列的特性，在同一基质上制备了不同方向的纳米沟槽微区，以此调控细胞取向形成不同取向方向的细胞图形(cell patterning)。
2.细胞培养细胞选用C6细胞，培养方法同实施例1。当纳米沟槽方向变化时，细胞图形的方向也随之发生改变。在图5A和B中，作为对照图下半部分是没有纳米沟槽区域，上半部分是有纳米沟槽区域。图5A中，纳米沟槽方向与未处理区域垂直，细胞图形的方向也与未取向的细胞垂直；当纳米沟槽方向与未处理区域的夹角为30°时，细胞图形的方向也发生相应的变化(图5B)。进一步地，在同一PS培养皿处理两个互相垂直的纳米沟槽区域，中间留下约100μm宽的区域不作处理；培养细胞后，发现细胞依然遵循各自的纳米沟槽方向形成细胞图形，细胞排列方向也相互垂直；同时中间未处理区域的细胞也或多或少受两边取向细胞的影响(图5C)。当互相垂直的沟槽区域紧挨在一起，细胞在其上面生长仍然按沟槽方向排列，形成相互靠近且相互垂直的细胞图形区域(图5D)。激光是可随意调节的，可以在PS基质表面选择不同的微区制备不同方向的纳米沟槽，细胞在其上面按预先设计的方向生长。这对于组织工程和生物传感器的研究具有特别重要的意义。
权利要求
1.一种利用激光制备的纳米沟槽调控细胞定向排列的方法，其特征在于包括如下具体步骤1)培养基质表面沟槽化处理利用入射偏振激光扫描聚合物培养基质表面，激光的脉冲宽度为5-20ns，脉冲频率为5-10Hz，入射光束的入射角度从0°到30°，入射光束功率密度为5-30mJ/cm2，偏振方向为面内偏振，扫描速率为0.01-30mm/s，经20-50/cm2的能量、波长为266nm的偏振激光辐射，在聚合物表面形成周期性的亚微米或纳米沟槽结构；2)培养基质的消毒处理将经过上述处理的聚合物培养基质，选用紫外灯辐照1-2小时，或采用环氧乙烷气体消毒30分钟，或利用75％医用酒精浸泡24小时进行消毒处理后，用作细胞培养；3)细胞培养选择生长状态良好的贴壁依附型生长的细胞，胰酶消化后，以1.0×104个/cm2，均匀接种于培养表面，在培养箱培养6个小时后，可观察到细胞沿着沟槽的方向取向生长和排列。
2.根据权利要求1的利用激光制备的纳米沟槽调控细胞定向排列的方法，其特征在于培养基质表面沟槽化处理所使用的激光波长根据聚合物材料的光吸收波长选择紫外区或可见区。
3.根据权利要求1的利用激光制备的纳米沟槽调控细胞定向排列的方法，其特征在于所述聚合物培养基质为聚合物薄膜、支架或细胞培养皿，所取材料为聚碳酸酯、聚乳酸、聚苯乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚对苯二甲酸丁二醇酯或聚酰亚胺。
全文摘要
一种利用激光制备的纳米沟槽调控细胞定向排列的方法，选用通用的医用聚合物材料作为细胞培养基质，采用激光扫描辐射的方法，对培养基质表面进行处理，使其形成微米/纳米或亚微米/纳米表面沟槽结构，然后对细胞培养基质进行消毒处理，选择生长状态良好的贴壁依附型生长的细胞，胰酶消化后，以一定的密度，均匀接种于培养基质表面后进行培养。由于培养基质表面沟槽形貌对细胞生长的调控作用，使细胞沿着微沟槽的方向定向生长和排列。本发明工艺简单，可操作性强，适合于多种细胞生物学基础研究、生物传感器或功能器件的制作以及医学植入体、组织工程等研究和应用中要求调控细胞定向生长的各个领域。
文档编号C12N5/00GK1637136SQ20041008456
公开日2005年7月13日 申请日期2004年11月25日 优先权日2004年11月25日
发明者朱邦尚, 路庆华, 陈万涛, 王宗光, 胡钧 申请人:上海交通大学