专利名称：生物体成分组成改变了的溶液的调制方法
技术领域：
本发明涉及一种从含有生物体成分的溶液、特别是从人类的血浆、尿等中分离蛋白质等生物分子，来制备生物体成分组成变化了的溶液的方法及制备装置。特别涉及以临床蛋白组学分析为目的，除去妨害检测微量成分的成分、特别是高分子量蛋白质，以制备生物体成分的组成改变了的溶液的方法及其装置。
背景技术：
近年来，作为后基因组学研究，蛋白组学分析研究(蛋白组学)开始受到重视。作为基因产物的蛋白质被认为比基因更加直接与疾病的症状相关，因此期待对蛋白质进行系统研究的蛋白组学分析的研究成果可以在诊断和治疗中得到广泛的应用。而且，发现多种在基因组分析中未能找到病因的蛋白质或疾病相关因子的可能性相当高。
蛋白组学分析之所以能够高速发展，与技术上可以采用质量分析装置(mass spectrometerMS)进行高速结构分析是密不可分的，由于MALDI-TOF-MS(matrix assisted laser desorption ionization time-of-flightmass spectrometry)等的实用化，使多肽的高通量超微量分析成为可能，已可检测出以前检测不到的微量蛋白质，成为探索疾病相关因子的强有力的工具。
蛋白组学分析的临床应用的首要目的是发现由疾病诱导或消失的生物标志物(bio-marker)蛋白质。由于生物标志物的活动与病症相关，所以除了可以作为诊断的标志物之外，作为药物开发靶点的可能性也很高。即，蛋白组学分析的成果，由于比特定基因更有可能作为诊断标志物和药物开发靶点，所以成为后基因组时代的诊断和治疗的关键技术，而由于确认的生物标志物与患者的药物反应性评价或副作用的发现预测等的患者可以享受到的利益直接相关，因此可以说对テ一ラ一メ一ド医疗(结合个人基因进行给药治疗的技术)的推进起到了很大作用。
在临床研究中导入蛋白组学分析时，要求迅速、准确地分析大量被检测物，而且由于临床检测物微量而贵重，所以必须迅速地进行高分解度、高灵敏度和高机能的测定。针对此情况的巨大推动力是质量分析(massspectrometry)，质量分析装置具有的超高灵敏度，对高通量的特性具有很大贡献。但是，虽然此类方法和仪器正在快速的改良之中，但还未达到能够使蛋白组学分析在临床现场简便且迅速地实施的状况。
其原因之一可列举出临床检测物的前处理。作为质量分析的前处理，有必要分级、精制临床检测物的蛋白质，目前的状况是该处理仍需要数天时间，并且由于前处理的操作很繁杂必须要有经验，这大大阻碍了其在临床中的应用。如果能通过少量的血液、体液进行全身疾病的诊断和病症监控，则其实用性将非常高，但由于血浆中含有的蛋白质的多样性，产生了很多问题。
据推测，人类蛋白质有10万种或其以上，而仅血清中含有的蛋白质就达到约1万种，其总量在血清中的浓度约为60～80mg/ml。人血清中的高含量蛋白质是清蛋白(分子量66kDa)、免疫球蛋白(150～190kDa)、运铁蛋白(80kDa)、结合珠蛋白(＞85kDa)、脂蛋白(数均分子量100kDa)等，任一种均以超过1mg/mL的水平大量存在。另一方面，被认为是病症的生物标志物或疾病相关因子的肽类激素、白细胞介素、细胞因子等生理活性蛋白质中的多数仅以小于1ng/mL的极微量状态存在。其含量比与高分子的高含量成分相比，实际上是nano(10-9)到pico(10-6)的水平。就蛋白质的大小而言，蛋白质的全部种类的70％或其以下，分子量为6万(60kDa)或其以下，上述极微量的生物标志物蛋白质中的任一种基本都包含在该区域中(例如非专利文献1)。由于这些蛋白质通过肾脏、使一部分从尿中排出，所以不仅可以以血液，并且也可以以尿作为检测物进行测定。
以一般的血清学检查进行蛋白组学分析时，首先必须除去成为妨害检测疾病相关微量成分的分子量为6万或其以上的高分子成分，并尽量回收分子量小于1.5万的蛋白质。
作为该高分子量蛋白质的分离、除去方法，目前使用高效液相色谱(liquid chromatographyLC)或二维电泳(2 dimensional-polyacrylamidegel electrophoresis2D-PAGE)，但仅LC或2D-PAGE的操作就需要1～2天。该所需时间与MALDI-TOF-MS或ESI-MS(electrospray ionizationmass spectrometry)等数分钟的分析时间相比，非常长，分析装置MS所具有的高通量的巨大优势不能在临床蛋白组学分析中得到充分发挥。因此，不得不承认，为了实现在医疗现场进行诊断和治疗而在尽量短的时间内获得分析结果，在现阶段仍缺乏实用性，这成为难以在日常的临床检查中运用MS的很大原因。
因此，如果从样品中除去一部分或全部高分子量蛋白质的方法实现高速化，则可以期待飞跃性地提高利用临床蛋白组学分析进行的临床检查的诊断的快速性。具体而言，只要是能代替LC或2D-PAGE的、能用微量的检测物快速地获得下述溶液的方法或装置即可，所述溶液是以目标蛋白质群残留的形式，改变了生物体成分组成的含生物体成分的溶液。
作为以清蛋白为主要对象物质进行除去的手段，作为已经实用化的制品或公开的技术，有固定了蓝色色素等亲和配体的载体(已制品化)、通过离心分离过滤将高分子量成分进行分级的离心管形式的装置(已制品化)、通过电泳原理进行分级的方法、Cohn的乙醇沉淀等传统的沉淀方法或通过色谱进行分级的方法(例如非专利文献2)等。
但是，上述的任一种方法的分离性能均不充分，存在不适用于微量样品或混入对质量分析等有障碍的试剂等问题。特别是以清蛋白为对象、仅用吸附进行除去的方法，虽能除去清蛋白，但难以除去免疫球蛋白等其他6万或其以上的高分子成分。
另外，在人工肾脏、人工肺、血浆分离装置等中使用的分离膜，根据其用途，开发有各种大小的产品，虽然也进行了提高对生物体成分的适应性那样的改善(专利文献2)，但是没有暗示能解决临床蛋白组学中存在问题，即，要高效率地除去清蛋白等高分子量蛋白质。
如果能开发出解决此类问题的方法、装置，则可以在医学研究和临床现场广泛地进行蛋白组学分析，可以更迅速地进行高精度的检查、诊断，并可以期待成为探索尚无有效治疗方法的疑难疾病的原因或开发其早期的诊断法的强有力的工具。
如上所述，在进行临床蛋白组学分析时，有必要除去成为妨碍的过剩的高分子量蛋白质。要求一种与2D-PAGE、液相色谱等虽然具有很高的分离能力、但繁杂而费时的方法比较，简便并且在短时间内具有很高的分离能力的设备。
虽然最近，作为有效的改良过的清蛋白除去法，发表了使用Affi-GelBlue凝胶的方法(非专利文献3)、使用“Gradiflow”体系的方法(非专利文献4)等，但是仍没有实现用于获得更多信息的分析用溶液的报道。
以血浆中的清蛋白的除去为指标，作为所要求的方法的条件，是使血浆成分高速流动、不出现蛋白质变性作用、进行用于实现高机能化的微细加工、不十分昂贵等。尚未发现解决这些问题的装置或设备。
非专利文献1安德森·NL(Anderson NL)，安德森·NG(AndersonNG)著，“人血浆蛋白组学历史、特征和诊断前景(The human plasmaproteomehistory，character，and diagnostic prospects)”，分子与细胞蛋白组学(Molecular & Cellular Proteomics)，(美国)，美国生物化学与分子生物学协会，有限公司(The American Society for Biochemistry andMolecular Biology，Inc.)，2002年，第1卷，p845-p867。
非专利文献2日本生化学会编，《新生化学实验讲座(第1卷)蛋白质(1)分离·纯化·性质》，东京化学同人，1990年非专利文献3细胞工程分册，《生物实验イラストレイテツド 5》，秀润社，2001年非专利文献4N.Ahmed et al.，Proteomics，On-line版，2003年06月23日非专利文献5D.L.Rothemund等，(2003)，Proteomics，第3卷，279-287页)专利文献1日本，特表2002-542163号公报专利文献2日本，专利3297707号公报发明内容鉴于上述情况，本发明要解决的课题是提供一种从含有生物体成分的溶液中有效地分离·除去在临床蛋白组学分析时成为妨害的多余的高分子量蛋白质，来调制适用于蛋白组学分析的生物体成分的组成改变了的含生物体成分的溶液的制备方法及装置。
本发明中，作为第1发明组，包含以下发明。
1.一种清蛋白相对于总蛋白质的浓度组成比小于0.3的生物体成分的组成发生改变了的溶液的调制方法，其特征在于，将含有生物体成分的溶液，提供至至少β2-微球蛋白与清蛋白的透过比率为50或其以上的分离膜，使其透过分离膜；2.如上所述的溶液的调制方法，其特征在于，上述分离膜的透过比率为70或其以上；3.如上述任一项所述的溶液的调制方法，其特征在于，上述浓度组成比小于0.1；4.如上述任一项所述的溶液的调制方法，其特征在于，生物体成分组成改变了的溶液的总蛋白质中的β2-微球蛋白的组成比率，相对于含生物体成分溶液的总蛋白质中的β2-微球蛋白的组成比率，为10倍或其以上；5.如上所述的溶液的调制方法，其特征在于，上述倍率为100倍或其以上；6.如上述任一项所述的溶液的调制方法，其特征在于，分离膜的膜内的流路为非对称结构；7.如上述任一项所述的溶液的调制方法，其特征在于，生物体成分是血液、血浆、血清等血液来源物、尿、腹水、唾液、泪液、脑脊髓液、胸水或来自细胞的蛋白质提取溶液；8.一种蛋白组学分析用溶液，是通过上述任一项所述的调制方法得到的；9.一种生物体成分中含有的蛋白质的分析方法，其特征在于，在通过上述任一项的方法制备生物体成分组成改变了的溶液后，对上述溶液中含有的蛋白质进行分析；10.如上述9所述的蛋白质的分析方法，蛋白质的分析方法为选自质量分析、电泳分析和液相色谱中的至少1种；11.一种调制生物体成分组成改变了的蛋白组学分析用溶液的装置，是具有内置有β2-微球蛋白与清蛋白的透过比率为50或其以上的分离膜的组件的装置，其特征在于，组件至少具有在分离膜的原液侧的含生物体成分的溶液的原液入口和经由分离膜透过的透过液的出口。
另外，本发明中，作为第2发明组，包含以下发明。
1.一种用于调制生物体成分组成改变了的溶液的液流回路，其特征在于，具备以下结构组件，其内置分离膜，具有与上述分离膜的原液侧流路连接的原液入口和原液出口以及分离膜的透过液的出口，溶液循环回路，其连接上述原液入口和上述原液出口、在中途具有泵和分离用目标液入口，稀释液流入口，其设置于上述分离用目标液入口的上游的位置、或上述溶液循环回路中途的位置；2.一种用于调制生物体成分组成改变了的溶液的装置，其特征在于，含有至少2个上述液流回路，1个液流回路的分离目标液出口与另外1个液流回路的分离目标液入口通过液体流路直接或间接地相连；3.一种生物体成分组成改变了的溶液的调制方法，是使用内置分离膜的组件使含有生物体成分的溶液流入分离膜的原液侧，并使原液侧的液体通过设置于组件外的溶液循环回路进行循环，取出已透过分离膜的液体作为生物体成分组成改变了的溶液的工艺，其特征在于，在开始流入含有生物体成分的溶液后，使用于含生物体成分溶液的稀释液追加流入到内置于组件中的分离膜的原液侧；4.如上所述的溶液的调制方法，其特征在于，在下述条件下进行分离，所述条件为流入到分离膜的原液侧的含生物体成分的溶液的流量Q1与透过的液体的流量Q2满足0＜Q2/Q1＜1；5.如上所述的溶液的调制方法，Q2/Q1为0.005≤Q2/Q1≤0.5；6.如上述任一项所述的溶液的调制方法，透过的液体的流量Q2与流入到分离膜的原液侧的含生物体成分的溶液和稀释液的流量之和Q3满足0.5≤Q2/Q3≤1.5；7.如上所述的溶液的调制方法，Q2/Q3约为1；8.如上述任一项所述的溶液的调制方法，其特征在于，稀释液使用生理盐水或缓冲溶液；9.如上述任一项所述的溶液的调制方法，其特征在于，生物体成分是血液、血浆、血清等血液来源物、尿、腹水、唾液、泪液、脑脊髓液、胸水或来自细胞的蛋白质提取溶液；10.一种生物体成分组成改变了的溶液的调制方法，其特征在于，使用2个组件，使用利用第1组件用上述任一调制方法得到的溶液，进一步用第2组件进行上述任一种调制方法。
进而，本发明中，作为第3组发明，包含下述发明。
1.一种由生物体成分来调制组成改变了的溶液的方法，是通过对含有生物体成分的溶液进行至少2个工序的处理，由含生物体成分溶液来调制生物体成分组成改变了的溶液的方法，其特征在于，连接使用至少2个工序，所述工序选自(1)吸附一部分或全部分子量大于等于清蛋白的蛋白质的工序；(2)通过分子筛来分级分子量大于等于清蛋白的蛋白质，并将一部分或全部除去的工序；及(3)浓缩蛋白质的工序。
2.如上所述的溶液的调制方法，其特征在于，上述(1)工序中，使用含有下述原料的材料，所述原料选自纤维素、乙酸纤维素、聚碳酸酯、聚砜、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸酯、聚酰胺、聚1，1-二氟乙烯、聚丙烯腈、聚酯、聚氨酯、聚苯乙烯、聚乙烯和聚丙烯中的1种或其以上；3.如上述任一项所述的溶液的调制方法，其特征在于，上述(2)工序中，使用含有下述原料的分离膜，所述原料选自纤维素、乙酸纤维素、聚碳酸酯、聚砜、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸酯、聚酰胺、聚1，1-二氟乙烯、聚丙烯腈、聚酯、聚乙烯和聚丙烯中的1种或其以上；4.如上述任一项所述的溶液的调制方法，其特征在于，上述(3)工序中，使用含有下述原料的分离膜，所述原料选自纤维素、乙酸纤维素、聚碳酸酯、聚砜、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸酯、聚酰胺、聚1，1-二氟乙烯、聚丙烯腈、聚乙烯和聚丙烯中的1种或其以上；5.如上述任一项所述的溶液的调制方法，将表面固定有下述物质的原料用于工序(1)或工序(2)，所述物质为选自聚乙烯亚胺、氨基甲基吡啶、多酚、蓝色色素、2价金属离子和含烷基化合物中的1种或其以上；6.如上述任一项所述的溶液的调制方法，其特征在于，将下述物质添加至工序(1)或工序(2)中的水溶液中，所述物质选自表面活性剂、乳化剂、有机溶剂、乙醇、乙二醇类、聚丙二醇、聚乙烯亚胺、氨基甲基吡啶、硫酸精蛋白、硫酸铵、多酚、蓝色色素、离液盐和含烷基化合物中的1种或其以上；7.如上述任一项所述的溶液的调制方法，其特征在于，含生物体成分的溶液含有来源于人体成分的检测物质；8.一种由含有生物体成分的溶液来调制组成改变了的溶液的装置，其特征在于，具有选自下述装置中的至少2种装置，上述选出的装置之间通过流路来连接，所述装置为(1)吸附一部分或全部分子量大于等于清蛋白的蛋白质的装置、(2)通过分子筛来分级一部分或全部分子量大于等于清蛋白的蛋白质的装置、及(3)浓缩蛋白质的装置；9.一种调制权利要求29所述的溶液的装置，具有可与液相色谱、电泳装置或质量分析装置相连接的液流出路。
通过本发明公开的这些方法或装置，可在短时间内从以血液、血清、血浆为代表的生物体成分调制出溶液，所述溶液可以检测出多数目前难以检测出的微量的蛋白质。
本发明的实施例1、3中使用的分离系统的简图。(1个膜分离单元)[图2]本发明的实施例2中使用的分离系统的示意图。(2个膜分离单元)[图3]本发明的实施例4中使用的分离系统的简图。(3个膜分离单元)[图4]本发明的实施例5、6中使用的分离系统的简图。(是具有膜分离功能和吸附功能的单元为3个、浓缩单元为1个的例子)[图5]显示属于第3发明组的一例装置的示意图。
生物体成分的组成改变了的溶液的电泳照片。
实施例2中得到的生物体成分的组成改变了的溶液的2维电泳照片。
人类血清溶液的2维电泳照片。
符号的说明1阀门2溶液循环回路3循环用泵4处理液回收口5第1工序组件6第2工序组件7第3工序组件8注入用泵100注入用泵101三向阀门102溶液循环回路103循环用泵
104膜分离单元处理液回收口105分离膜组件106组件的下部罐202第2阶段溶液循环回路203第2阶段循环用泵204第2阶段的膜分离单元的处理液回收口205第2分离膜组件206第2阶段的组件的下部罐302第3阶段溶液循环回路303第3阶段循环泵304第3阶段的膜分离单元的处理液回收口305第3分离膜组件306第3阶段的组件的下部罐402浓缩单元溶液循环回路403浓缩单元的循环泵404浓缩单元的滤液出口405浓缩膜组件406浓缩用组件的下部罐407浓缩单元的处理液回收口具体实施方式
首先对本发明中共同的部分进行说明。
本发明中所说的“生物体成分的组成改变了的溶液”是指，以血液等来源于生物体的溶液即含有生物体成分的溶液作为原液，进行特定处理而改变了蛋白质组成的溶液。这里所说的“血液”，是指人类等动物血液，也包含由血清、血浆等血液中的一部分成分组成的溶液。所谓“来源于生物体的溶液”，除了血液之外至少可列举出，尿、唾液、泪液、脑脊髓液、腹水、胸水或来自细胞的蛋白质提取溶液等作为生物体相关物质含有蛋白质的溶液。
另外，本发明中所说的“分离膜组件”是指，在外壳中收纳分离膜而成的组件。在该外壳中具备，被分离溶液流入的入口和流出的出口、及透过分离膜被分离后的溶液流出的透过液流出口。对上述外壳的原材料并无特别的限定，可列举出聚碳酸酯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚砜、聚醚砜等塑料制品。
本发明中获得的含有生物体成分的溶液的组成改变了的溶液，优选用于蛋白质分析、特别是蛋白组学分析。作为分析方法，无特别限定，可以列举出LC、2D-PAGE、核磁共振(NMR)、MALDI-TOF-MS、ESI-MS等。这些方法，由于以高含有率含有清蛋白等在部分溶液中大量存在的蛋白质，所以成为分析灵敏度降低的分析方法，而通过使用本发明中得到的溶液，可成为高灵敏度分析。另外，对于使用MS、电泳的蛋白组学分析是有用的。对本发明的溶液调制装置可以直接或间接地连接的MS，没有特别的限定，但是优选为电子喷雾离子化型、大气压离子化型、四极杆(QQQ)型、扇形磁场型、飞行时间型、MS/MS、MSn、FT-MS型、离子捕捉型和它们的组合型。另外，还包含MS/MS或MSn(例如MS3)那样的串联MS。在串联MS的情况下，所有类型的MS都可适用，特别地，使用离子捕捉、四极杆-飞行时间(Q-TOF)、FT-MS、及四极杆与离子捕捉的扇形器件的组合，效率优良。由此，可选择性的检测出MS/MS和/或MSn测定中产生的峰。
通过使用本发明的方法或精制装置得到的溶液，并使用上述分析装置，如果进一步发展就可收集到各种微量蛋白质成分的结构信息。这些不仅限于肽·质谱指纹(peptide-mass fingerprintPMF)，还包含各肽的一级结构信息(氨基酸序列)。
接下来对第1发明组进行说明。
在第1发明组中，为了得到生物体成分的组成改变了的、特定的清蛋白的浓度组成比小于0.3的溶液，采用下述方法，即，将含有生物体成分的溶液提供至β2-微球蛋白的筛分系数(sieving coefficient)除以清蛋白的筛分系数的值即透过比率为50或其以上的分离膜，收集透过分离膜的液体。另外，为了进行该方法，使用下述装置该装置具有内置有β2-微球蛋白与清蛋白的透过比率为50或其以上的分离膜的组件，组件至少具有在分离膜的原液侧的含生物体成分溶液的原液入口、及经由分离膜透过的透过液的出口。在上述装置的组件中，也可在分离膜的原液侧具有含生物体成分的溶液的原液出口。
上述分离膜的透过比率优选为70或其以上，更优选为140或其以上，不特别设置上限值，但是在该值过高的膜分离单元中，所期望的分子量小于1.5万的蛋白质的回收量有可能减少，因此优选为10000或其以下。该分离膜优选使用中空丝膜。在被用于透过蛋白质时，中空丝膜迄今为止被广泛用作被称作人工肾脏的透析组件的材料。人工肾脏中使用的分离膜被设计为尽量不使清蛋白等蛋白质透过，可使肌酸酐、尿素等低分子成分透过，使血液流到中空丝内腔侧，从中空丝外腔流出生物体所不需要的低分子蛋白质，由此净化血液。在第1发明组的分离膜中，优选通过中空丝膜从中空丝内腔侧透过到外侧的方法。特别优选通过在中空丝内腔侧尽量不使清蛋白等高分子量成分透过，另一方面，主要使分子量1.5万或其以下的蛋白质成分透过，来获得溶液的方法。虽然使用平膜的分离膜也可以获得同样的结果，但是由于利用中空丝膜容易增大单位处理液体量的表面积，并且操作上的压力损失小，所以可有效地实施本发明。
对第1发明组中使用的分离膜的原材料，没有特别限制，可以使用含有下述高分子的原材料，所述高分子选自纤维素、三乙酸纤维素等纤维素类聚合物、聚碳酸酯、聚砜、聚醚砜等聚砜类聚合物、聚甲基丙烯酸甲基酯等聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸酯、聚酰胺、聚1，1-二氟乙烯、聚丙烯腈、聚酯、聚乙烯和聚丙烯中的1种或其以上。其中，近年透析器等中经常使用的聚砜，由于分级特性良好，因而是优选的原材料。关于膜结构，优选分离膜的膜内的流路为非对称结构，进一步优选为由致密层与支持层的多层结构构成的非对称结构，所述支持层是空隙率高的维持膜强度的支持层。使用电子显微镜以1000倍的观察条件观察膜的剖面结构，由此来判断该非对称结构。通过观察是否存在沿膜的厚度方向不能充分确认空孔的层、和可以确认空孔的层这两者，来进行判断。在可以确认这两层的情况下，确认为非对称结构。
另外，在该非对称结构中，优选原液所接触的面的附近的空孔最为致密。这是因为可以减少溶质引起的膜表面的堵塞。
第1发明组中使用的分离膜优选尽量不吸附蛋白质，从这一观点出发，优选表面为亲水性的膜。特别是亲水性膜可以抑制对蛋白组学分析提供重要信息的蛋白质的吸附，具有可以毫不浪费地回收的效果。作为亲水性膜，只要经亲水性化，就无特别限制，可以列举出，亲水性单体与疏水性单体共聚而成的膜；亲水性高分子与疏水性高分子共混制膜而成的膜；或在由疏水性高分子构成的膜的表面结合、附着亲水性聚合物而成的膜；对由疏水性高分子构成的膜的表面进行了化学处理、等离子处理、放射线处理的膜。作为提供亲水性成分的化学结构，无特别限制，优选为聚乙二醇等聚醚、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚甲基丙烯酸羟基乙酯、聚丙烯酰胺等亲水性高分子。
进而，可根据需要，进一步进行浓缩蛋白质的工序，即从通过使用上述分离膜进行透过而获得的液体中除去水分等溶剂。
在浓缩工序中，使用作为平面滤膜的、中空丝膜等的分离膜的、具有分子筛效果的多孔膜，利用分离筛进行浓缩。在样品为少量时，可使用在市售的离心分离器用试管中贴付有平面过滤膜的浓缩装置，另一方面，在有大量样品时，使用中空丝是有效的。
对在浓缩工序中可以使用的膜的材料并无特别限制，可以使用含有下述高分子的原材料，所述高分子选自纤维素、三乙酸纤维素等乙酸纤维素类聚合物、聚碳酸酯、聚砜或聚醚砜等聚砜类聚合物、聚甲基丙烯酸甲基酯等聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸酯、聚酰胺、聚1，1-二氟乙烯、聚丙烯腈、聚酯、聚乙烯及聚丙烯中的1种或其以上。其中，近年来透析器等中经常使用的聚砜，由于可制得具有分级特性和高透水性的膜，因而是优选的原材料。
关于在浓缩工序中使用的膜的结构，可以使用具有接近于均一结构的海绵状结构的膜、由致密层与空隙率高的维持膜强度的支持层的多层结构构成的非对称膜中的任一种。关于浓缩工序中使用的膜的分子分级性能，优选使用具有在生理盐水中不透过肽类程度的分子分级性能、例如截止值为0.5kDa或其以下，优选为0.1kDa或其以下的性能的膜或超滤膜。
在作为第1发明组的调制目的的生物体成分的组成改变了的溶液中，分子量小于1.5万的蛋白质的存在比例必须很高，使用分子量为1.16万的β2-微球蛋白作为本发明中上述存在比例的指标。另外，还必须减少清蛋白、免疫球蛋白、运铁蛋白等高分子量的蛋白质，这里，以分子量接近6万的清蛋白为指标。以清蛋白为指标的理由为，在血液的情况下，清蛋白的量为最多，在使用膜的方法的情况下，如果充分除去清蛋白，则通常还可同时除去免疫球蛋白等较大的分子。
另外，为了使用所得到的生物体成分组成改变了的溶液，进行良好的蛋白组学分析，生物体成分的组成改变了的溶液的总蛋白质中的β2-微球蛋白的组成相对于含生物体成分溶液的总蛋白质中的β2-微球蛋白的组成，优选为10倍或其以上，更优选为100倍或其以上，特别优选为1000倍或其以上。这是因为在质量分析装置等中可注入到装置中的蛋白质的质量有限，因此这样可提高测定灵敏度。
如上所述可得到总蛋白质中分子量6万或其以上的蛋白质的组成比率较低的液体，为了进行高灵敏度分析，蛋白质中的清蛋白的组成比优选小于0.3，进一步优选小于0.1，更进一步优选小于0.01。
以下，使用附图来对第1发明组的一个形态例进行说明。
图1为显示调制第1发明组的溶液的一例装置的示意图。液体的流向如箭头所示。血清等生物体成分检测物质或含有其的含生物体成分溶液，从注入泵100通过三相阀门101，注入第1分离膜组件105，该组件内置有第1工序的具有特定透过比率的分离膜，利用循环泵103、在由管形成的溶液循环回路102中进行液体输送、循环。在第1工序中透过分离膜的透过液，从作为透过液出口的第1阶段膜单元处理液回收口104处获得。该形态是工序1的基本单位(单元)。通过此操作得到所期望的蛋白组学分析用液体。在想要进一步除去高分子量蛋白质时，可以连接多个组件。图2示出了连接2个组件进行2段式处理的例子，图3示出了连接3个组件进行3段式处理的例子。透过的液体通过与透过液出口的膜分离单元的处理液回收口处直接连接的管子，注入下一步工序的单元中。从存在于工序最下游的单元处的回收口(图1的装置中为104，图2的装置中为204，图3的装置中为304)获得目标溶液。
图4为在图3的装置中进一步连接了具有浓缩功能的组件的装置，目标溶液从浓缩单元的处理液回收口407处回收。
下面对第2发明组进行说明。
在第2发明组中，作为生物体成分组成改变了的溶液的调制方法，是使用内置分离膜的组件，使含有生物体成分的溶液流入到分离膜的原液侧，使原液侧的液体通过设置于组件之外的溶液循环回路进行循环，并取出透过分离膜的溶液的工艺，其特征在于，在流入含生物体成分的溶液后，使用于生物体成分的溶液的稀释液追加流入内置于组件中的分离膜的原液侧。另外，在第2发明组中，作为生物体成分的组成改变了的溶液的调制装置，其特征在于，具备组件，其内置分离膜、并具有与上述分离膜的原液侧流路连接的原液入口及原液出口、以及分离膜的透过液的出口；溶液循环回路，其连接上述原液入口和上述原液出口、在中途具有泵和分离用目标液入口；以及稀释液流入口，其设置于上述分离用目标液入口的上游的位置、或在上述溶液循环回路中途的位置。
在第2发明组中，所谓分离膜，也是指多孔性的分离膜，可使用平面过滤膜、筒式过滤膜等的平膜型分离膜、中空丝膜等中空状分离膜中的任一种。特别地，中空丝膜可增大单位液体处理量的膜表面积，也可减少压损，可以有效地使用。为了增大单位液体处理量的膜表面积，中空丝膜的内径优选较小，优选为1000μm或其以下，更优选为500μm或其以下。另外，平面过滤膜具有制膜容易且可廉价地制作的优点。作为膜原材料，可列举出例如，选自纤维素、乙酸纤维素、聚碳酸酯、聚砜、聚甲基丙烯酸甲基酯等聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸酯、聚酰胺、聚1，1-二氟乙烯、聚丙烯腈、聚酯、聚乙烯和聚丙烯及它们的衍生物中的1种或其以上的原材料。
在第2发明组中使用的分离膜中，优选使用分子量小于1.5万的蛋白质与分子量大于等于6万的蛋白质的透过率比为50或其以上的分离膜。其他的优选的特性、形状与第1发明组中关于分离膜所述的内容相同。
在关于第2发明组中的溶液的调制的发明中，在分离膜的原液侧，使含有生物体成分的溶液流入，然后使用于含生物体成分的溶液的稀释液流入。这是因为，追加稀释液可以防止在膜表面过度浓缩，防止分离膜的透过比率的恶化。另外，优选在稀释液中使用生理盐水或“缓冲溶液”。作为“缓冲溶液”，可列举出MES、BIS-TRIS、ADA、ACES、PIPES、MOPSO、BIS-TRIS PROPANE、BES、MOPS、TES、HEPES、DIPSO、MOBS、TAPSO、TRIZMA、HEPPSO、POPSO、TEA、EPPS、TRICINE、GLY-GLY、BICINE、PBS、TAPS、AMPD、TABS、AMPSO、CHES、CAPSO、AMP、CAPS、CABS等。上述缓冲溶液以缩写表示，详细的内容可参照和光纯药工业(株)、シグマアルドリツチジヤパン(株)等试剂制造商的产品目录或MSDS(安全性数据单)。
所谓流入组件的含生物体成分的溶液的流量Q1，是流入组件且在回路中流动的液体的流量，优选大于已被分离的液体被输送的流量Q2。这是因为考虑到防止分离膜表面处的浓缩、防止堆积物在膜表面的层积、防止膜孔的堵塞等。进而，流入分离膜组件的液体的流量Q1与被分离后的液体被输送的流量Q2的比率Q2/Q1，优选为0.5或其以下。另外，在流入分离膜组件的液体的流量Q1与分离后的液体被输送的流量Q2的比率Q2/Q1为0的情况下，由于不进行过滤，而只靠扩散进行物质移动，因而分离的速度变慢，所以优选为0.005或其以上。
透过分离膜的流量Q2与流入组件的稀释液的流量Q3优选满足0.5≤Q2/Q3≤1.5的关系，Q2/Q3进一步优选为0.9～1.1，即约为1。
进而，准备2个组件，在第1组件中，如上所述，在追加流入稀释液的同时，得到生物体成分的组成改变了的溶液，然后使该溶液流入第2组件，进而如果在追加流入稀释液的同时，进一步调制生物体成分的组成改变了的溶液，则可调制更适合于蛋白组学分析的除去了高分子量蛋白质的溶液。进一步，还可准备第3、第4等追加的组件，进行同样的工序。
另外，通过根据需要进一步从上述使用1个组件或多个组件的工序中得到的液体中，除去水等溶剂来进行浓缩蛋白质的工序，可以得到生物体成分的组成改变了的溶液。对于该浓缩工序中使用的膜的原材料、结构、性能，与在第1发明组中对浓缩工序所说明的内容相同。
下面，对第3发明组进行说明。
根据第3发明，通过具有吸附、利用筛分的分级和浓缩这3个处理蛋白质的工序中的至少2个工序，可有效地调制含有大量目标蛋白质成分的溶液。
第3发明组中的涉及液体的调制方法的发明，其特征在于，具有选自下述工序中的至少2个工序，所述工序为(1)吸附分子量大于等于清蛋白的蛋白质的工序；(2)通过分子筛来分级分子量大于等于清蛋白的蛋白质，除去其一部分或全部的工序；(3)对蛋白质进行浓缩的工序。
另外，作为调制第3发明组中的含有生物体成分的溶液组成改变了的溶液的装置，其特征在于，具有选自下述装置中的至少2种装置，并且所选出的装置之间通过流路相连接，所述装置为(1)将分子量大于等于清蛋白的蛋白质的一部分或全部吸附的装置；(2)通过分子筛来将分子量大于等于清蛋白的蛋白质的一部分或全部进行分级的装置；(3)浓缩蛋白质的装置。在上述装置中，从蛋白质分析的简便性出发，优选具有可与液相色谱、电泳装置或质量分析装置连接的溶液的流出路径。
在第3发明组中所说的成为分子量基准的清蛋白，是指来源于人、牛、其他哺乳动物和鸟类的清蛋白，根据作为对象的生物体来决定，但在本发明中，优选以人的清蛋白作为基准。所谓分子量大于等于清蛋白的蛋白质，主要是指，高于清蛋白(分子量6～7万)的分子量的蛋白质。是否是高于清蛋白的分子量，可以通过所谓SDS-PAGE(sodiumdodecylsulphate-polyacrylamide gel electrophoresis含有十二烷基硫酸钠的聚丙烯酰胺凝胶电泳)的方法进行判断。
下面，对第3发明组中的赋予特征的3个工序或装置进行说明。
(1)将分子量大于等于清蛋白的蛋白质的一部分或全部进行吸附的工序或装置此处所说的“吸附”是指，可以溶解在水中的蛋白质通过与存在于工序中的物质相互作用，而被该物质捕捉。
对本工序的吸附中使用的原材料，没有特别限定，可以使用纤维素、三乙酸纤维素等纤维素类聚合物、聚碳酸酯、聚砜、聚醚砜等聚砜类聚合物、聚甲基丙烯酸甲基酯等聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸酯、聚酰胺、聚1，1-二氟乙烯、聚丙烯腈、聚酯、聚氨酯、聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯中的任一种原材料的高分子。
另外，作为原材料的形状，可列举出，球状珠子或纤维等形态；以长纤维、短纤维等纤维为原材料来形成编织物、织物、无纺布等布帛的平面状的形态；中空丝的形态，在各种形态中，表面凹凸大的形状由于具有增大吸附表面积的效果，因此是优选的。另外，如果为平膜或中空丝膜等透过型分离膜，则由于可以合并进行低分子蛋白质的分离，因此是优选的。
作为基体材料本身的特性，为了不吸附目标溶液中必需的不希望被除去的低分子量蛋白质，可以适当选择使用表面亲水化了的材料；为了选择性吸附清蛋白等高分子量蛋白质，可以选择使用进行了疏水化的材料。
作为具有亲水性表面的基体材料，可以列举出，亲水性单体与疏水性单体共聚成的材料；亲水性高分子与疏水性高分子混合成的材料；或在由疏水性高分子构成的表面结合、附着亲水性聚合物的材料；对疏水性高分子构成的表面进行了化学处理、等离子处理、防射线处理的材料。作为亲水性成分，优选使用聚乙二醇等聚醚、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚甲基丙烯酸羟基乙酯等亲水性高分子。作为疏水性基体材料，可以使用下述材料使用了疏水性物质的材料、在表面导入有疏水性配体的材料。作为疏水性成分，可列举出例如，甲基丙烯酸酯、丙烯酸酯、乙烯、丙烯等烯烃类；丙烯腈、甲基丙烯腈等具有碳-碳双键的化合物构成的加成聚合物；聚砜、纤维素等聚合物。
进而，还可以使用固定了下述物质中的至少任一种或其以上而成的材料，所述物质为聚乙烯亚胺、氨基甲基吡啶、多酚、蓝色色素、2价金属离子(Zn2+、Ni2+、Co2+、Cu2+等)、具有疏水性基团(甲基、苄基、苯基、氯甲基、辛基、十二烷基等)的化合物(例如乙醇、异丙醇、酰胺甲基化聚苯乙烯)等。
(2)通过分子筛来分级分子量大于等于清蛋白的蛋白质，并将其一部分或全部除去的工序在本工序中，优选使用具有平膜或中空丝膜等形态、具有分子筛效果的多孔膜。特别是如果使用中空丝膜，可以极大地增加分离膜的表面积，因此是有效的。
对本工序中优选使用的膜的原材料并无特别限定，可使用纤维素、三乙酸纤维素等乙酸纤维素类聚合物、聚碳酸酯、聚砜或聚醚砜等聚砜类聚合物、聚甲基丙烯酸甲基酯等聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸酯、聚酰胺尼龙、聚1，1-二氟乙烯、聚丙烯腈、聚酯、聚乙烯、聚丙烯中的任一种原材料的高分子。其中，近年来透析器等中经常使用的聚砜，因为在进行筛分的不同分子量的物质中，其对低分子量的物质相对于高分子量的物质的筛分系数比很大，分级特性良好，因此是优选的原材料。关于膜结构，可以使用下述膜中的任一种，即，具有接近于均一结构的海绵状结构的膜；包含致密层与支持层的多层结构的非对称结构的膜，所述支持层是空隙率高的、用于维持膜强度而设置的、厚度很厚的支持层。非对称结构的认定方法、非对称结构优选方式，与第1发明组中说明的内容相同。
作为在分级工序中使用的膜，就膜表面的性质而言，有亲水性膜和疏水性膜。
作为亲水性膜，可以列举出，亲水性单体与疏水性单体共聚成的膜；亲水性高分子与疏水性高分子共混制膜而成的膜；或在由疏水性高分子构成的膜的表面结合、附着有亲水性聚合物的膜；对由疏水性高分子构成膜的表面进行了化学处理、等离子处理、防射线处理等的膜。对亲水性成分并无特别限制，优选为聚乙二醇等聚醚、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚甲基丙烯酸羟基乙酯等亲水性高分子。这些亲水性膜可以抑制所必需的蛋白质的吸附，具有无浪费地进行回收的效果。
另一方面，在疏水性膜中，只要是可作为膜原材料使用的物质，就无特别限制，可以使用下述物质混入有疏水性成分的物质、或在膜表面导入有疏水性配体的物质。作为疏水性成分，可列举出例如，甲基丙烯酸酯、丙烯酸酯、乙烯、丙烯等烯烃类、丙烯腈、甲基丙烯腈、聚1，1-二氟乙烯等由具有碳-碳双键的加成聚合性化合物形成的聚合物、或聚砜、纤维素等聚合物。
进而，还可以使用通过吸附或化学反应固定了下述物质中的任一种或其以上而成的原材料，所述物质为聚乙烯亚胺、氨基甲基吡啶、多酚、蓝色色素、2价金属离子(Zn2+、Ni2+、Co2+、Cu2+等)、具有疏水性基团(甲基、苄基、苯基、氯甲基、辛基、十二烷基等)的化合物(例如乙醇、异丙醇、酰胺甲基化聚苯乙烯)等。
关于膜的分子分级性能，优选使用在生理盐水中不能通过清蛋白的程度的分子分级性能，例如截止值在50kDa或其以下，进一步在30kDa或其以下的物质。
在工序(1)和工序(2)中，在投入的水溶液中加入各种试剂，可提高吸附或分级性能。具体而言，在工序中使用的水溶液中，可使用表面活性剂、乳化剂、有机溶剂、乙二醇、聚丙二醇、聚乙烯亚胺、氨基甲基吡啶、硫酸精蛋白、硫酸铵、多酚、蓝色色素、离液盐、具有疏水性基团(甲基、苄基、苯基、氯甲基、辛基、十二烷基等)的化合物(例如乙醇、异丙醇)等中的至少1种或其以上。
例如，通过适当加入可以促进清蛋白凝集的硫酸铵、聚乙二醇、聚乙烯亚胺、离液盐等，可以使高分子成分的蛋白质发生凝集，促进巨分子化，并促进吸附，抑制从分离膜的漏出，有效地抑制高分子成分的透过。相反，通过适当添加两性表面活性剂、阴离子型表面活性剂等表面活性剂，可抑制蛋白质之间的相互作用，并通过分子筛有效地进行分级。
(3)浓缩蛋白质的工序所谓浓缩工序，是指对溶液中的蛋白质进行浓缩的工序。这里所说的浓缩工序，当然可以从水溶液中除去水，也可以除去分子量小于等于1kDa的低分子成分。在本工序中，平面过滤膜或中空丝组件的膜，使用多孔膜，通过分子筛进行浓缩。从分子分级性能出发，该工序中使用的膜与上述(2)中的分级工序中使用的分离膜不同。进而，在上述(2)的分级工序中，在使用分离膜的情况下，将透过膜的液体作为所希望的溶液；与在(3)的浓缩工序中，不透过膜的残留的液体成为所希望的溶液，在这一点上是不同的。
在样品为少量的情况下，使用在市售的离心分离器用试管中贴付有平面过滤膜的浓缩装置是有效的，而在有大量样品的情况下，使用中空丝是有效的。
对浓缩工序中可以使用的分离膜的原材料并无特别限定，可以使用纤维素、三乙酸纤维素等纤维素类聚合物、聚碳酸酯、聚砜或聚醚砜等聚砜类聚合物、聚甲基丙烯酸甲基酯等聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸酯、聚酰胺、聚1，1-二氟乙烯、聚丙烯腈、聚酯、聚氨酯、聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯中的任一种原材料的高分子。其中，近年来透析器等中经常使用的聚砜，由于分级特性良好(即，在进行筛分的分子量不同的物质中，对于低分子量的物质相对于高分子量的物质的筛分系数比很大)，因此是优选的原材料。关于膜结构，可以使用下述膜中的任一种，即，具有接近于均一结构的海绵状结构的膜；包含致密层与下述支持层的多层结构的非对称结构的膜，所述支持层是空隙率高、且为了维持膜强度而设置的厚度较厚的支持层。关于非对称结构的认定方法、优选的状态，与第1发明组中说明的内容相同。
关于浓缩工序中使用的膜的分子分级性能，可以使用在生理盐水中不能通过肽的程度的分子分级性能、即截止值为0.5kDa或其以下、进一步为0.015kDa或其以下的分离膜或超滤膜。
在该第3发明组中，用溶液流路来连接各工序的装置、使得可以连续运转，由此可获得能够简便且自动地连续运转的效果。但是，也可以使各工序独立进行运转。可使用与液体流路连接的泵进行液体输送，但在小规模的装置的情况下，也可使用注射器进行液体输送。不依靠分离膜而通过离心管型装置进行浓缩时，也可以进行离心操作。
在第3组的发明方法中，虽然是一个工程，但在该工程为具有2个或其以上的功能的工程的情况下，重复进行该工程2次或其以上的方法也包含在本发明的范围内，所述2个或其以上功能由选自(1)分子量大于等于清蛋白的蛋白质的吸附工序；(2)通过分子筛来分级分子量大于等于清蛋白的蛋白质，除去其一部分或全部的工序；(3)浓缩蛋白质的工序实现。在第3发明组的装置中，虽然是一个装置，但在该装置是具有2个或其以上的功能的装置的情况下，连接2个或其以上该装置的装置也包含在本发明的范围内，所述2个或其以上的功能由选自(1)分子量大于等于清蛋白的蛋白质的吸附装置；(2)通过分子筛来分级分子量大于等于清蛋白的蛋白质，除去其一部分或全部的装置；(3)浓缩蛋白质的装置实现。
上述(1)～(3)的工序中，通过进一步重复同一工序，可进一步减少清蛋白相对于总蛋白质质量的比率，获得所谓提高作为分析对象的低分子量的蛋白质的比率的优良效果。关于是重复进行同一工序、还是使用不同的2个工序，可根据最初提供的生物体成分中含有的蛋白质组成的程度进行设计。
根据第3发明组所述的调制方法，在健康成人的血浆的情况下，随着其中的蛋白质组成的不同，通过操作1次本发明，可得到分子量为50kDa或其以上的高分子量蛋白质的除去率为90％或其以上，分子量小于50kDa的蛋白质的平均回收率为70％或其以上，分子量小于50kDa的蛋白质的平均浓缩率为10倍或其以上的效果。
另外，可将1次处理的时间控制在1～6小时以内。另外，从防止来自别的检测物质的污染和生化危害的观点出发，优选使用一次一系列的装置，本发明的方法中使用的装置可制成可废弃处理型，从避免来自检测物质的污染及确保分析的重现性的观点出发，有很大优势。
在第3组的发明中，该发明适合于从含生物体成分的水溶液含生物体成分的溶液、特别是人的血浆、尿、唾液、泪液、脑脊髓液、腹水、胸水等中分离生物分子特别是蛋白质成分。上述所示的膜和中空丝组件的尺寸及液体的流速，依赖于作为原材料的血浆、尿等生物体材料的质和量进行适当的决定，但是在以所谓桌上规模(desk-size)进行实施的时候，血浆以1～400mL，优选以5～100mL进行实施，流速以1～20mL/min，优选以2～10mL/min进行实施。
以下，对于属于第3发明组的使含生物体成分的水溶液含生物体成分的溶液的组成发生改变的方法及以此为目的的装置的一个形态例，使用图进行说明。
图5为属于第3发明组的装置之一例的示意图，为按照吸附、分级、浓缩的顺序的3工序的例子。液体的流向以箭头所示。血清等材料的检测物，或含有其的含生物体成分的水溶液含生物体成分的溶液，经过注入用泵8、阀门1注入至具有吸附、分级和浓缩的任一种功能的第1工序组件5中，通过泵3输送液体至由管子形成的溶液循环回路2中，进行循环。在第1工序中处理得到的溶液，由处理液4得到。该形态是所谓的单工序单位。图5示出3段式的例子，第2工序的组件6与第3工序的组件7相连。得到的溶液通过连接于处理液回收口的管子注入至下一个工序的组件中。
通常，在通过分子筛进行分级的工序的情况下，工序的出口即处理液的回收口成为透过液的出口；吸附工序的情况下的出口成为设置在溶液循环回路中途的出口，但是在使用透过型的膜进行吸附时，透过液的出口成为工序的出口。浓缩工序的情况下的出口成为设置于溶液循环回路的中途的出口。在图5的形态中，各循环用泵被设置于各工序的下游，该循环用泵也可被设置于各工序的上游。
在所选出的工序中、浓缩工序处于最下游的情况下，各工序的处理可以同时进行，可以在短时间内进行以前分别需要花费长时间进行的处理。
实施例
<透过比率的测定方法>
将人血清(SIGMA社H1388或同等品)在3000rpm、15分钟的条件下进行离心处理，除掉沉淀物以后，以0.45μm的过滤器进行处理。
准备内置有分离膜的分离膜组件，通过用管子连接原液(人血清)侧入口和原液侧(人血清)出口，来构成溶液循环回路。在溶液循环回路的中途，从原液侧出口至原液侧入口的方向上，按照顺序设置有样品罐、可不经循环地废弃溶液的切换阀门、使溶液流入溶液循环回路的流入路径、循环原液的泵、样品罐。另外，从组件的过滤侧出口开始连接管子，按顺序设置有用于进行过滤的泵、过滤的液体的出口(样品罐)。通过流入路径，对分离膜组件充填PBS(日本制药社制ダルベツコPBS(-))水溶液。(以下、将该水溶液简单称作“PBS”)。从原液侧入口开始、以原液循环流量1m/min、过滤流量0.2ml/min的流速、在20℃下对人血清开始进行过滤。在过滤过程中，通过切换位于溶液循环回路中途的用于废弃溶液的阀门，来无返回地废弃组件出口的原液。在保持原样的情况下，在注入人血清开始后的30分钟到60分钟之间，分别从组件原液入口附近的样品罐、组件原液出口附近的样品罐和组件过滤侧出口附近的样品罐中收集样品。测定这些样品中的清蛋白和β2-微球蛋白的浓度，根据这些测定值计算出清蛋白和β2-微球蛋白的筛分系数。此时的原液侧浓度采用从组件入口和出口附近的各样品罐收集的样品的浓度的平均值。然后将得到的β2-微球蛋白的筛分系数除以清蛋白的筛分系数得到的值作为透过比率。另外，本实施例中的清蛋白浓度的测定是委托エスア一ルェル(株)进行测定的，项目编号07214(乳胶凝集免疫法)。该测定中，对于达到清蛋白浓度为0.4mg/L或其以下即达到测定极限或其以下的部分，利用BETHYL社制Human Albumin ELISA Quantitation Kit(Cat No E80-129)进行测定。β2-微球蛋白浓度的测定是委托エスア一ルェル(株)进行测定的，项目编号02103(乳胶凝集免疫法)。
<利用2维电泳的蛋白质分析>
通过2维电泳法对原来的含有生物体成分的溶液及通过本发明的方法得到的“生物体成分的组成改变了的溶液”进行分析。方法如下所述。
1.在生物体成分分离溶液中加入等量的80％蔗糖，作为电泳用样品。
2.将市售的等电点电泳用凝胶IEF-PAGEmini pH3-10 1mm厚(TEFCO制)设置于电泳槽中。
3.加入200ml上部缓冲液(0.05M氢氧化钠)和500ml下部缓冲液(0.01M磷酸)。
4.用上部缓冲液洗涤各孔，在孔中加入20μl10％蔗糖溶液。
5.在孔中加入了蔗糖溶液的下面放置用1.的方法制备的样品。
6.盖上电泳槽，连接电源，以100V30分钟、200V30分钟、进一步以500V60分钟进行电泳。
7.剥离凝胶盒的塑料板，取出凝胶，浸泡在40％的醋酸水溶液中，振荡30分钟。
8.在考马斯亮蓝染色液(CBB染色)中染色5分钟，在脱色液(10％甲醇，7.5％醋酸)中脱色，发现染色带，在换水的同时进行水洗30分钟或其以上。
9.从凝胶中切出1条胶。
10.将切出的凝胶片在SDS-PAGE用电泳缓冲液中浸泡10～20分钟，使之平衡化。SDS-PAGE用电泳缓冲液(以下称为电泳缓冲液)的组成为在3.0gTRIS、14.4g甘氨酸、1.0gSDS中加入蒸馏水制成1000ml的溶液。
11.将市售的SDS-PAGE用凝胶SDS-PAGEmini 4-20％ 1.5mm厚2-Dwell(TEFCO制)设置于电泳槽中。
12.加入电泳缓冲液，用电泳缓冲液洗孔。
13.将9.的凝胶片在不使气泡进入的条件下小心地转移至2维的SDS-PAGEmini的孔中，在小孔中加入1μl市售的分子量标志物rainbowmarker(Amersham)。
14.用1％琼脂糖/电泳缓冲液(调制时稍稍添加能目视观察到着色程度的量的溴酚蓝)制备凝胶。
15.盖上电泳槽，连接电源，以15mA电泳120分钟左右(直至溴酚蓝移动至凝胶的下端部分)。
16.从凝胶盒中取出凝胶，进行CBB染色和银染色。银染色使用市售的银染色IIキツトワコ一(和光纯药社制)试剂盒。
(实施例1)将18重量份聚砜(ソルベ一社制ュ一デル(注册商标)P-3500)和9重量份聚乙烯吡咯烷酮(BASF社制K30)加入至72重量份N，N’-二甲基乙酰胺与1重量份水的混合溶剂中，在90℃下加热14小时进行溶解，得到制膜原液。将该制膜原液通过外径0.3mm、内径0.2mm的孔型双重圆筒型口模的外侧的管子排出。将由58重量份的N，N’-二甲基乙酰胺和42重量份的水构成的溶液作为芯液通过内侧管排出。排出的制膜原液通过了从口模至凝固浴液面的350mm的距离后，导入至100％的水凝固浴中，得到中空丝膜。利用电子显微镜(日立社制S800)确认得到的中空丝膜的结构，结果是具有非对称结构。将10000根得到的中空丝膜插入至与一般的透析器同样具有透析液入口和透析液出口的圆筒状的塑料壳体中，两端部分用树脂密封，制成有效膜面积为1.6m2的中空丝膜组件。用水洗涤该中空丝膜组件，然后在该组件充填有水的状态下照射γ射线。组件的γ射线吸收量为27kGy。
切取该组件的中空丝膜，捆100根，在不闭塞中空丝膜中空部分的情况下，用环氧类的封装剂将两末端固定于玻璃管组件壳体上，制成微型组件。该微型组件的外直径约为7mm，全体长度约为17cm，具有2个与一般的中空丝膜型透析器相同的中空丝的外侧罐。用蒸馏水洗涤该微型组件的中空丝膜和组件内部。
然后，填充PBS(日本制药社制ダルベツコPBS(-))水溶液，得到中空丝膜微型组件(以后简称为微型组件(1))。制备2个该微型组件，使用其中1个测定分离膜的透过比率，结果为70.5。将剩下的1个用于以下实验。
将人血清(SIGMA社H1388，Lot 28H8550)在3000rpm、15分钟的条件下进行离心处理，除掉沉淀物，然后用0.45μm的过滤器进行处理。
盖上微型组件(1)外侧的一个罐，另一个罐连接硅制管，并与透过用蠕动泵相连。另一方面，中空丝膜内侧的液体通过硅制管连接组件的原液入口和原液出口，来形成溶液循环回路，使用蠕动泵来使血清可以循环。另外，在溶液循环回路的中途处设置追加供给PBS的入口。
使用4ml血清、以循环流量5ml/min、过滤流量0.2ml/min的流速在20℃下实施过滤4小时(本工序相当于主要分级比清蛋白更大的蛋白质的工序)。在血清中添加此时过滤的容量份的PBS以确保循环的液体的量恒定。在52.5ml经4小时得到的滤液即生物体成分的组成改变了的溶液中的清蛋白的浓度为61mg/l，α1-微球蛋白浓度为0.4mg/l，β2-微球蛋白浓度为0.066mg/l。使用的人血清中的总蛋白质浓度为53000mg/l，清蛋白浓度为33000mg/l，α1-微球蛋白浓度为16.5mg/l，β2-微球蛋白浓度为1.17mg/l，确认清蛋白的浓度发生大幅下降。
使用Micro BCA Protein Assay(PIERCE社制)，以BSA作为标准曲线，来测定溶液的总蛋白质。滤液中的总蛋白质浓度为275mg/l，清蛋白浓度相对于总蛋白质浓度为0.22。另外，β2-微球蛋白浓度相对于总蛋白质，在人血清中为0.0000223，与此相对，在滤液中为0.00024，增加至10.8倍。
(实施例2)将18重量份聚砜(ソルベ一社制ュ一デル(注册商标)P-3500)和9重量份聚乙烯吡咯烷酮(BASF社制K30)加入至72重量份N，N’-二甲基乙酰胺与1重量份水的混合溶剂中，在90℃下加热14小时进行溶解，得到制膜原液。将该制膜原液通过外径0.3mm、内径0.2mm的孔型双重圆筒型口模的外侧的管子排出。将由58重量份的N，N’-二甲基乙酰胺和42重量份水组成的溶液作为芯液通过内侧管排出。排出的制膜原液通过从口模至凝固浴液面的350mm的距离后，导入至100％的水凝固浴中，得到中空丝膜。利用电子显微镜(日立社制S800)确认得到的中空丝膜的结构，结果是具有非对称结构。将10000根得到的中空丝膜插入至与一般的透析器同样具有透析液入口和透析液出口的圆筒状塑料壳体中，两端部分用树脂密封，制成有效面积为1.6m2的中空丝膜组件。将含有0.1重量％的作为阳离子性亲水性高分子的聚乙烯亚胺(BASF社制，重均分子量100万)的水溶液，填充至该中空丝膜组件的中空丝膜内面侧及外面侧。然后，用γ射线照射该组件。组件的γ射线吸收量为27kGy。切取该组件的中空丝膜，捆100根，在不闭塞中空丝膜中空部的情况下，用环氧类的封装剂将两末端固定于玻璃管组件壳体上，制成微型组件。该微型组件的外直径约为7mm，全体长度约为17cm，与一般的中空丝膜型透析器同样具有2个中空丝的外侧罐。用蒸馏水洗涤中空丝膜和组件内部。然后，填充PBS(日本制药社制ダルベツコPBS(-))水溶液，得到聚乙烯亚胺固定化中空丝膜微型组件(以后简称为微型组件(2))。制备2个该微型组件，使用其中1个来测定分离膜的透过比率，结果为400。将剩下的微型组件用于以下实验。
将人血清(SIGMA社H1388，Lot 28H8550)在3000rpm、15分钟的条件下进行离心处理，除去上清液和沉淀物后，用0.45μm的过滤器进行处理。
首先，与实施例1同样，准备中空丝膜微型组件(微型组件(1))，盖上中空丝外侧的一个罐，另一个罐连接硅制管。用硅制管连接原液入口和出口，使中空丝膜的内侧液体形成溶液循环回路，并在中途设置蠕动泵、使原液可以循环。在溶液循环回路中途设置三向阀门，在一向中通过管子设置注入用泵。进而，微型组件(2)也盖上外侧的一个罐，另一个罐连接硅制管。另外，在该微型组件中，中空丝膜内侧的液体通过连接原液入口和出口，形成溶液循环回路，并在中途设置蠕动泵使溶液可以循环。另外，在该溶液循环回路中途设置三向阀门。
使微型组件(1)的外侧的罐连接的硅制管与设置于微型组件(2)的溶液循环回路中途的三向阀门接合。然后，在这些管和2个组件中充填PBS，制成图2所示那样的微型组件2段串联连接的系统。这里，微型组件(1)的使用，相当于分级分子量大于等于清蛋白的蛋白质的工序；微型组件(2)的使用，相当于具备以下两种功能的工序，所述功能是吸附分子量大于等于清蛋白的蛋白质的功能、及分级分子量大于等于清蛋白的蛋白质的功能。
通过注入用泵，通过管供给血清，在微型组件(1)和微型组件(2)各自的溶液循环回路的循环流量为5ml/min、过滤流量为0.2ml/min的流速的条件下、在20℃实施过滤4小时。通过注入用泵来添加此时过滤出的溶液的容量份的PBS，以确保循环的液体的量恒定。
经4小时后，由组件(2)得到的滤液、即生物体成分的组成改变了的溶液中的清蛋白的浓度为0.62mg/L，α1-微球蛋白浓度为0.036mg/L，β2-微球蛋白浓度为0.05mg/L。使用的人血清中总蛋白质浓度为53000mg/l，清蛋白浓度为33000mg/l，α1-微球蛋白浓度为16.5mg/l，β2-微球蛋白浓度为1.17mg/l，确认清蛋白的浓度发生大幅下降。滤液中的总蛋白质浓度为8.1mg/l，清蛋白的浓度相对于总蛋白质的浓度的比例为0.08。另外，β2-微球蛋白浓度相对于总蛋白质，在人血清中为0.0000223，与此相对，在滤液中为0.00617，增加至277倍。
该样品经过二维电泳进行分析的结果示于图7。
图7为使用3000μl实施例2中得到的生物体成分的组成改变了的溶液而得到的浓缩液的2维电泳照片。由图7可以判明，分子量小于6万时可见很多独立斑点。由本装置分离的样品在低分子量区域得到了很多斑点。
(比较例1)将分离前的人血清作为比较样品进行2维电泳分析。结果示于图8。图8为将0.5μl实施例2中的处理前的人血清作为样品的2维电泳照片。在图8中，斑点宽大，无法确定物质，而且在低分子量区域几乎观察不到斑点。
(实施例3)切下东丽株式会社透析器BS1.8L(Lot.20440312)的两端的树脂粘结部分，得到中空丝膜。得到的中空丝膜的尺寸为内直径200μm、膜厚40μm，利用电子显微镜(日立社制S800)确认得到的中空丝膜的结构，结果为具有非对称结构。
将该中空丝膜捆100根，在不闭塞中空丝膜中空部的情况下，用环氧类的封装剂将两末端固定于玻璃管组件壳体上，制成微型组件。该组件的内直径约为5mm，长约为17cm，与一般的中空丝膜型透析器同样具有2个中空丝膜的内侧罐(血液罐)和2个外侧罐(透析液罐)。用蒸馏水洗涤该微型组件的中空丝膜和组件内部。然后，填充PBS(日本制药社制ダルベツコPBS(-))水溶液，得到中空丝膜微型组件(以下简称为微型组件(3))。制备2个该微型组件，使用其中1个来测定分离膜的透过比率，结果为149。将剩下的1个微型组件用于以下实验。
将人血清(SIGMA社H1388，Lot 122K0424)在3000rpm、15分钟的条件下进行离心处理，除掉沉淀物后，用0.45μm的过滤器进行处理。
如图1所示，在微型组件(1)的外侧罐中，盖上组件的下部罐106，将上部罐作为膜分离单元的处理液回收口104。中空丝膜内侧的液体经硅制管连接原液入口和出口而形成溶液循环回路102，并在中途设置作为蠕动泵的循环用泵103、使血清得以循环。另外，在溶液循环回路102中途设置三向阀门101，在三向阀门101的一向中安装注入用泵。
通过注入用泵，以1.0ml/min的流速加入4ml血清，然后以循环流量10ml/min、过滤流量1.0ml/min的流速在20℃下实施过滤50分钟。此时，在循环回路中加入与通过透过而过滤的容量相当的容量的1.0ml/min的流速的PBS，以确保循环的液体的量恒定。在约50ml经50分钟而得到的溶液中，清蛋白的浓度为32.8mg/l，α1-微球蛋白浓度为0.06mg/l，β2-微球蛋白浓度为0.068mg/l，作为原液使用的人血清中的总蛋白质浓度为48000mg/l，清蛋白浓度为29800mg/l，α1-微球蛋白浓度为13.2mg/l，β2-微球蛋白浓度为1.27mg/l。用作原液的人血清中的总蛋白质质量为192000μg，清蛋白质量为119000μg，α1-微球蛋白质量为52.8μg，β2-微球蛋白质量为5.08μg，与此相对，滤液的总蛋白质质量为56000μg，清蛋白质量为1640μg，α1-微球蛋白质量为3.00μg，β2-微球蛋白质量为3.40μg，可维持β2-微球蛋白的量，并且可大幅度除去清蛋白。通过该结果可知，清蛋白相对于总蛋白质浓度的组成比率为0.15。另外，β2-微球蛋白相对于总蛋白质的组成比率，在血清中为0.0000265，与此相对，在滤液中为0.00613，增加为23倍。
(实施例4，比较例2)使用实施例(3)中得到的中空丝膜(透过比率149)，制成1个微型组件。微型组件的形状、中空丝膜的根数与实施例3相同。下面将该微型组件称为微型组件(4)。另外，将40根实施例3得到的中空丝膜(透过比率149)，固定于内直径约为5mm，长度约为12cm的玻璃管组件壳体上，与实施例1同样制成2个微型组件(以下简称为微型组件(5))。将这些微型组件用于以下实验。
将人血清(SIGMA社H1388，Lot 122K0424)在3000rpm、15分钟的条件下进行离心处理，除掉滤液和沉淀物后，用0.45μm的过滤器进行处理。
首先准备1个微型组件(4)，盖上外侧罐中的一个，另一个罐连接硅制管。中空丝膜的内侧液体通过硅制管连接原液入口和出口，形成溶液循环回路，并在该回路中设置蠕动泵、使溶液得以循环。在上述溶液循环回路中途设置三向阀门，在三向阀门的一个方向上安装注入泵。将此作为第1阶段的膜分离单元。进而，对于微型组件(5)中的一个微型组件，也盖上外侧的一个罐，另一个罐连接硅制管。微型组件(5)的中空丝膜内侧的液体也通过硅制管连接组件的原液入口和出口来形成溶液循环回路，并在该回路中设置蠕动泵、使溶液得以循环。进而，在上述溶液循环回路中途设置三向阀门。将此作为第2阶段的膜分离单元。进而，盖上另一个微型组件(5)的一个外侧罐，另一个罐连接硅制管。第2个微型组件(5)的中空丝膜内侧的液体也通过硅制管连接组件的原液入口和出口、来形成溶液循环回路，并在回路中途设置蠕动泵、使溶液得以循环。进而，在上述溶液循环回路的中途设置三向阀门。将此作为第3阶段的膜分离单元。然后将连接于各组件的外侧的罐的硅制管连接至下一阶段的膜分离单元的三向阀门上，向分离系统全体内填充PBS，制成图3所示的具有3段膜分离单元的分离系统。
图3为在该实施例中使用的分离系统的示意图。液体的流向如箭头所示。血清和稀释液(PBS)从注入泵100开始，经三向阀门101进入溶液循环回路102中，进而通过循环用泵103被输送，注入到第1分离膜组件105(微型组件(4))中，然后，在溶液循环回路102中循环。第1膜分离单元中得到的溶液，从膜分离单元的处理液回收口104处取出。然后，该溶液流入第2阶段的膜分离单元，注入第2阶段的分离膜组件205(第1微型组件(5))，进一步通过第2阶段循环用泵203在第2阶段溶液循环回路202中循环。在第2膜分离单元的第2阶段的分离膜组件205中透过的溶液，从处理液回收口204处取出。进一步，使该溶液流入至第3分离膜单元，注入至第3分离膜组件305(第2个微型组件(5))，进行循环。透过第3分离膜单元的溶液，从处理液回收口304处取出。
详细的条件如下所述。以0.2ml/min的流速将4ml血清加入第1阶段膜分离单元以后，在第1阶段膜分离单元、第2阶段膜分离单元、第3阶段膜分离单元都在流量5.0mL/min的条件下使其在溶液循环回路中循环，并使各分离膜组件的过滤流量以0.2mL/min的流速在20℃下实施4小时的过滤。此时，将经透过而过滤的容量份的PBS以0.2ml/min的流速、经注入泵100加入至第1膜分离单元中，以保持循环的液体量恒定。经4小时而得到的溶液，大约为47ml。使用ザルトリウス社制vivaspin20(3000MWCO型)使该溶液浓缩至4ml，结果清蛋白的浓度为0.38mg/l，β2-微球蛋白浓度为0.583mg/l，用作原液的人血清中的总蛋白质浓度为49000mg/l，清蛋白浓度为31200mg/l，β2-微球蛋白浓度为1.19mg/l。用作原液的人血清的总蛋白质质量为196000μg，清蛋白质量为124800μg，β2-微球蛋白质量为4.76μg，与此相对，滤液的总蛋白质质量为100μg，清蛋白质量为1.5μg，β2-微球蛋白质量为2.3μg，可维持β2-微球蛋白量，并且可以大幅度除去清蛋白。通过该结果可知，清蛋白相对于总蛋白质浓度的组成比例为0.02。另外β2-微球蛋白的浓度相对于总蛋白质，在血清中为0.0000243，与此相对，在滤液中为0.0307，增加为1263倍。
使用ザルトリウス社制vivaspin500(3000MWCO型)来浓缩该样品、直至样品容量为原来的1/10，等量加入样品缓冲液(向0.5ml 0.5M Tris-盐酸(pH6.8)、0.4M甘油、0.8ml 10％SDS、0.1ml 0.1％溴酚蓝中加入蒸馏水制成10ml溶液)，在沸水中加热3分钟的溶液中取25μl进行电泳分析。结果在图6的S3电泳道处示出。将市售的分子量标志物Rainbowmarker(Amersham Biosciences，RPN756)加入至S1电泳道，另外，为进行比较，向实施例4的分离系统处理前的人血清(相当于0.02μl)中加入样品缓冲液、并在沸水中加热3分钟，将所获得的溶液上样至S2电泳道，使S1至S3电泳道的样品同时进行电泳，结果合并示于图6中。
从S2电泳道可知，人血清中，分子量大于等于6万的区域存在大量蛋白质，分子量小于等于1.5万的区域只观察到很少量的蛋白质。与此相对，从S3电泳道可确认，经分离系统处理的实施例4的滤液的浓缩液，分子量大于等于6万的区域蛋白质少，分子量小于等于1.5万的区域有大量的蛋白质。
(实施例5)在照射γ射线之前，从组件上切下实施例1中制成的中空丝膜，准备100根。在50℃、相对湿度13％的气氛下干燥24小时。与实施例4同样操作，用环氧类的封装剂将该中空丝膜的两末端固定于玻璃管组件壳体上，制成微型组件。用蒸馏水洗涤该组件的中空丝膜及组件内部。然后，填充PBS(日本制药社制ダルベツコPBS(-))水溶液，得到浓缩用中空丝膜微型组件(以下简称为微型组件(6))。
进而，盖上微型组件(6)中外侧的一个罐，另一个罐作为滤液出口。该微型组件(6)的中空丝膜内侧的液体通过硅制管连接组件的原液入口和出口、而形成溶液循环回路，并使用蠕动泵以使原液可以循环。另外，在溶液循环回路中途设置三向阀门。并将此作为浓缩膜单元。
新制成实施例4中使用的具有3段膜分离单元的分离系统。用硅制管连接第3阶段的微型组件的处理液回收口和浓缩膜单元的三向阀门。另外，在浓缩膜单元的溶液循环回路的中途，设置由三向阀门构成的浓缩单元的处理液回收口，使浓缩操作过程中只打开溶液循环回路。向系统全体中填充PBS，制成膜分离单元与浓缩蛋白质的单元直接连接的复合系统，所述膜分离单元通过分子筛分级分子量大于等于清蛋白的蛋白质。
图4为该实施例5中使用的分离系统的示意图(膜分离单元和浓缩单元的例子)。液体的流向如箭头所示。血清和稀释液(PBS)经过注入泵100、三向阀门101注入溶液循环回路102中，进一步通过循环用泵103被输送，注入第1分离膜组件105(微型组件(4))中，然后在溶液循环回路102中循环。在第1膜分离单元中处理过的溶液，从膜分离单元的处理液回收口104处获得。然后，该溶液被注入第2分离膜组件205(第1微型组件(5))，在第2阶段循环回路202中循环。用第2膜分离单元处理过的溶液，从处理液回收口第2阶段膜分离单元的处理液回收口204处获得。进一步，使该溶液注入至第3分离膜组件305(第2个微型组件(5))，在第3阶段溶液循环回路302中循环。经第3膜分离单元处理过的溶液，从处理液回收口304处取出。进一步，将该处理液注入至浓缩膜组件405(微型组件(6))，在浓缩单元循环回路402中进行循环。此时，从浓缩膜组件中透过的液体，在浓缩单元的滤液出口404处取出，并废弃。在透过、浓缩操作结束后，通过开放浓缩单元的处理液回收口407而取出残留在浓缩膜组件的循环回路402中的溶液。
具体的条件如下所述。以0.2ml/min的流速将1ml血清加入第1阶段膜分离单元，然后在第1阶段膜分离单元、第2阶段膜分离单元、第3阶段膜分离单元都在流量0.5mL/min的条件下、使其在溶液循环回路中循环，并使各组件的过滤流量以0.2mL/min的流速在20℃下实施4小时的过滤。此时，以0.2ml/min的流速从注入泵100加入所滤过的容量份的PBS，以保持在各分离单元和浓缩单元中循环的液体量恒定。
在运行4小时后，由泵407取出的溶液的清蛋白的浓度为0.490mg/l，β2-微球蛋白浓度为0.502mg/l，作为原液使用的人血清中总蛋白质浓度为49000mg/l，清蛋白浓度为31200mg/l，β2-微球蛋白浓度为1.19mg/l。作为原液使用的人血清中的总蛋白质质量为196000μg，清蛋白质量为124800μg，β2-微球蛋白质量为4.76μg，与此相对，在3.7ml滤液中，清蛋白量为1.81μg，β2-微球蛋白浓度为1.86μg，可维持β2-微球蛋白的量，并且大幅度除去了清蛋白。通过该结果可知，清蛋白相对于总蛋白质浓度的组成比为0.0297。另外，β2-微球蛋白的浓度相对于总蛋白质，在人血清中为0.0000243，与此相对，在滤液中为0.0304，增加为1253倍。
(比较例3)使用采用市售的平膜的分离系统(使用聚醚砜膜)，在3000rpm的条件下，对4.7ml用PBS稀释4倍的血清进行过滤。
清蛋白浓度为5755mg/l，β2-微球蛋白浓度为0.534mg/l，作为原液使用的人血清中的清蛋白浓度为128.5mg/l，β2-微球蛋白浓度为0.446mg/l。作为原液使用的人血清中的清蛋白质量为27049μg，β2-微球蛋白质量为2.51μg，与此相对，滤液中的清蛋白质量为578μg，β2-微球蛋白浓度为2.01μg。β2-微球蛋白与清蛋白的透过比率(这里，将滤液的浓度除以原液浓度得到的值作为透过率，将β2-微球蛋白的透过率除以清蛋白的透过率得到的值作为透过比率)为较低的40。清蛋白的浓度组成比也为较高的0.32。
(实施例6)代替实施例5的内置于微型组件(6)的中空丝膜而使用实施例2的微型组件(2)中使用的中空丝膜，除此以外，制得与实施例5相同复合系统。
与实施例5同样地对1ml血清进行处理，4小时后从处理回收口407取得的液体的清蛋白的浓度为0.3mg/l，β2-微球蛋白浓度为0.515mg/l，作为原液使用的人血清中的总蛋白质浓度为49000mg/l，清蛋白浓度为31200mg/l，β2-微球蛋白浓度为1.19mg/l。作为原液使用的人血清中的总蛋白质质量为196000μg，清蛋白质量为124800μg，β2-微球蛋白质量为4.76μg，与此相对，在3.8ml滤液中，清蛋白质量为1.141μg，β2-微球蛋白量为2.0μg，在维持β2-微球蛋白的量的同时，大幅度除去了清蛋白。通过该结果可知，清蛋白相对于总蛋白质浓度的组成比为0.02。另外，β2-微球蛋白的浓度相对于总蛋白质，在人血清中为0.0000243，与此相对，在滤液中为0.0343，增加为1414倍。
工业可利用性通过本发明的方法或调制装置，可以获得分析精度提高了的含有生物体成分的溶液，该溶液适合用作医药研究和临床现场中的蛋白组学分析的样品。
权利要求
1.一种清蛋白相对于总蛋白质的浓度组成比小于0.3的生物体成分的组成发生改变了的溶液的调制方法，其特征在于，将含有生物体成分的溶液，提供至至少β2-微球蛋白与清蛋白的透过比率为50或其以上的分离膜，使其透过分离膜。
2.如权利要求1所述的溶液的调制方法，其特征在于，上述分离膜的透过比率为70或其以上。
3.如权利要求1所述的溶液的调制方法，其特征在于，上述浓度组成比小于0.1。
4.如权利要求1所述的溶液的调制方法，其特征在于，生物体成分组成改变了的溶液的总蛋白质中的β2-微球蛋白的组成比率，相对于含生物体成分溶液的总蛋白质中的β2-微球蛋白的组成比率，为10倍或其以上。
5.如权利要求4所述的溶液的调制方法，其特征在于，上述倍率为100倍或其以上。
6.如权利要求1所述的溶液的调制方法，其特征在于，分离膜的膜内的流路为非对称结构。
7.如权利要求1所述的溶液的调制方法，其特征在于，生物体成分是血液、血浆、血清等血液来源物、尿、腹水、唾液、泪液、脑脊髓液、胸水或来自细胞的蛋白质提取溶液。
8.一种蛋白组学分析用溶液，是通过权利要求1～7的任一项所述的调制方法得到的。
9.一种生物体成分中含有的蛋白质的分析方法，其特征在于，在通过权利要求1～7任一项的方法来制备生物体成分组成改变了的溶液，然后对上述溶液中含有的蛋白质进行分析。
10.如权利要求9所述的蛋白质的分析方法，蛋白质的分析方法为选自质量分析、电泳分析和液相色谱中的至少1种。
11.一种调制生物体成分组成改变了的蛋白组学分析用溶液的装置，是具有内置有β2-微球蛋白与清蛋白的透过比率为50或其以上的分离膜的组件的装置，其特征在于，组件至少具有在分离膜的原液侧的含生物体成分的溶液的原液入口和经由分离膜透过的透过液的出口。
12.一种用于调制生物体成分组成改变了的溶液的液流回路，其特征在于，具备以下结构组件，其内置分离膜，具有与上述分离膜的原液侧流路连接的原液入口和原液出口以及分离膜的透过液的出口，溶液循环回路，其连接上述原液入口和上述原液出口、在中途具有泵和分离用目标液入口，稀释液流入口，其设置于上述分离用目标液入口的上游的位置、或上述溶液循环回路中途的位置。
13.一种用于调制生物体成分组成改变了的溶液的装置，其特征在于，含有至少2个上述液流回路，1个液流回路的分离目标液出口与另外1个液流回路的分离目标液入口通过液体流路直接或间接地相连。
14.一种生物体成分组成改变了的溶液的调制方法，是使用内置分离膜的组件使含有生物体成分的溶液流入分离膜原液侧，并使原液侧的液体通过设置于组件外的溶液循环回路进行循环，取出已透过分离膜的液体作为生物体成分组成改变了的溶液的工艺，其特征在于，在开始流入含有生物体成分的溶液后，使用于含生物体成分溶液的稀释液追加流入到内置于组件中的分离膜的原液侧。
15.如权利要求14所述的溶液的调制方法，其特征在于，在下述条件下进行分离，所述条件为流入到分离膜的原液侧的含生物体成分的溶液的流量Q1与透过的液体的流量Q2满足0＜Q2/Q1＜1。
16.如权利要求15所述的溶液的调制方法，Q2/Q1为0.005≤Q2/Q1≤0.5。
17.如权利要求14所述的溶液的调制方法，透过的液体的流量Q2与流入到分离膜的原液侧的含生物体成分的溶液和稀释液的流量之和Q3满足0.5≤Q2/Q3≤1.5。
18.如权利要求17所述的溶液的调制方法，Q2/Q3约为1。
19.如权利要求14所述的溶液的调制方法，其特征在于，稀释液使用生理盐水或缓冲溶液。
20.如权利要求14所述的溶液的调制方法，其特征在于，生物体成分是血液、血浆、血清等血液来源物、尿、腹水、唾液、泪液、脑脊髓液、胸水或来自细胞的蛋白质提取溶液。
21.一种生物体成分组成改变了的溶液的调制方法，其特征在于，使用2个组件，使用利用第1组件用权利要求14所述的调制方法得到的溶液，进一步用第2组件进行权利要求14的调制方法。
22.一种由生物体成分来调制组成改变了的溶液的方法，是通过对含有生物体成分的溶液进行至少2个工序的处理，由含生物体成分溶液来调制生物体成分组成改变了的溶液的方法，其特征在于，连接使用至少2个工序，所述工序选自(1)吸附一部分或全部分子量大于等于清蛋白的蛋白质的工序，(2)通过分子筛来分级分子量大于等于清蛋白的蛋白质，并将一部分或全部除去的工序，及(3)浓缩蛋白质的工序。
23.如权利要求22所述的溶液的调制方法，其特征在于，上述(1)工序中，使用含有下述原材料的材料，所述原材料选自纤维素、乙酸纤维素、聚碳酸酯、聚砜、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸酯、聚酰胺、聚1，1-二氟乙烯、聚丙烯腈、聚酯、聚氨酯、聚苯乙烯、聚乙烯和聚丙烯中的1种或其以上。
24.如权利要求22所述的溶液的调制方法，其特征在于，上述(2)工序中，使用含有下述原材料的分离膜，所述原材料选自纤维素、乙酸纤维素、聚碳酸酯、聚砜、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸酯、聚酰胺、聚1，1-二氟乙烯、聚丙烯腈、聚酯、聚乙烯和聚丙烯中的1种或其以上。
25.如权利要求22所述的溶液的调制方法，其特征在于，上述(3)工序中，使用含有下述原材料的分离膜，所述原材料选自纤维素、乙酸纤维素、聚碳酸酯、聚砜、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸酯、聚酰胺、聚1，1-二氟乙烯、聚丙烯腈、聚乙烯和聚丙烯中的1种或其以上。
26.如上述任一项所述的溶液的调制方法，将表面固定有下述物质的原材料用于工序(1)或工序(2)，所述物质为选自聚乙烯亚胺、氨基甲基吡啶、多酚、蓝色色素、2价金属离子和含烷基化合物中的1种或其以上。
27.如权利要求22所述的溶液的调制方法，其特征在于，将下述物质添加至工序(1)或工序(2)中的水溶液中，所述物质选自表面活性剂、乳化剂、有机溶剂、乙醇、乙二醇类、聚丙二醇、聚乙烯亚胺、氨基甲基吡啶、硫酸精蛋白、硫酸铵、多酚、蓝色色素、离液盐和含烷基化合物中的1种或其以上。
28.如权利要求22所述的溶液的调制方法，其特征在于，含生物体成分的溶液含有来源于人体成分的检测物质。
29.一种由含有生物体成分的溶液来调制组成改变了的溶液的装置，其特征在于，具有选自下述装置中的至少2种装置，上述选出的装置之间通过流路来连接，所述装置为(1)吸附一部分或全部分子量大于等于清蛋白的蛋白质的装置、(2)通过分子筛来分级一部分或全部分子量大于等于清蛋白的蛋白质的装置、及(3)浓缩蛋白质的装置。
30.一种调制权利要求29所述的溶液的装置，具有可与液相色谱、电泳装置或质量分析装置相连接的液流出路。
全文摘要
本发明的课题在于提供一种适用于使用质量分析、电泳、液相色谱等的临床蛋白组学分析的含有生物体成分的溶液的调配方法及用于此目的的装置。本发明通过提供下述方法实现了上述课题，即，一种调制溶液的方法，组合使用选自(1)吸附分子量大于等于清蛋白的蛋白质的工序、(2)对分子量大于等于清蛋白的蛋白质进行分级的工序、及(3)浓缩蛋白质的工序中的2个工序；一种调制溶液的方法，通过使用分子量小于1.5万的蛋白质与分子量大于等于6万的蛋白质的透过比率大于等于50的膜分离单元，来进行分离；一种调制溶液的方法，对分离膜组件，在流入生物体成分原液后、流入稀释液，在使液体循环的同时，使一部分液体通过分离膜透过。
文档编号C12M1/00GK1845935SQ20048002546
公开日2006年10月11日 申请日期2004年9月6日 优先权日2003年9月5日
发明者和田茂久, 内海润, 藤田芳司, 菅谷博之, 山田智子 申请人:东丽株式会社