专利名称：K01－0509物质和其生产方法
技术领域：
本发明涉及抑制细菌III型分泌机制的K01-0509物质和其生产方法。该K01-0509物质与用于含有K01-0509-A1物质和/或K01-0509-A2物质的抗感染治疗药、或预防药的物质相关。
背景技术：
已报道，功能为将细菌致病因子释放至菌体外部的III型分泌机制在例如沙门氏菌属(Salmonella)、耶尔森菌属(Yersinia)、假单胞杆菌属(Pseudomonas)、志贺菌属(Shigella)、肠致病性大肠杆菌(E.Coli)(在下文中有时称为EPEC)、肠出血性大肠杆菌(Enterohaemorrhagil E.coli)和博德特菌属(Bordetella)的细菌中是高度保守(Microbiology and Molecular Biology Reviews，6月，1998，p.381)。
已报道，上文中保持III型分泌机制的细菌通过分泌机制将致病因子释放至菌体外部，部分释放的致病因子转移至宿主细胞中，被转移至宿主细胞中的致病因子主要参与细菌的致病性(Microbiologyand Molecular Biology Reviews，6月，1998，p.382 ff.)。
另一方面，已证明在使用兔子的感染性实验(J.Exp.Med.188(10)，1907-1916，11月16)和使用人志愿者的感染性实验(Infection and Immunity，6月，2000，p.3689-3695)中具有由III型分泌机制分泌的蛋白(在下文有时称为III型分泌蛋白)缺陷的EPEC菌株失去致病性。从这些事实看来，抑制III型分泌系统和分泌蛋白功能的物质预期可表现出用于治疗或预防感染性疾病的药物的功效，其提供了不杀死细菌而仅使致病性消失的新思路。
发明内容
在这种情况下，通过本发明解决的问题是发现使病原菌的致病性消失的抗感染性疾病的新试剂。
为了解决上述的这些问题，我们已继续对微生物代谢进行了研究，并且发现在被称为从奄美大岛收集的土壤样品中新分离的K01-0509菌株的培养基中产生了具有针对III型分泌系统的抑制性活性的物质。此外，通过从显示针对III型分泌系统的抑制性活性的培养物中分离和纯化活性成分，我们已发现以下文中化学结构式[I]和[II]表示的物质。因为具有这些化学结构的物质不是已知的化学物质，所以将这些物质称为K01-0509-A1物质和K01-0509-A2物质，统称为K01-0509物质。
本发明基于这些知识完成。
本发明的一个方面提供了由下式[I]表示的K01-0509-A1物质； 本发明的一个方面提供了由下式[II]表示的K01-0509-A2物质(A1物质的立体异构体)； 本发明的另一方面提供了由下式[I]所示K01-0509-A1物质
和下式[II]所示K01-0509-A2物质组成的K01-0509物质； 本发明的另一方面提供了用于生产K01-0509-A1物质的方法，其包括培养属于链霉菌属(Streptomyces)并具有产生K01-0509-A1物质的能力的微生物，在培养基中积累K01-0509-A1物质和从培养物中分离K01-0509-A1物质。
本发明的另一个方面提供了用于生产K01-0509-A2物质的方法，其包括培养属于链霉菌属并具有产生K01-0509-A2物质的能力的微生物，在培养基中积累K01-0509-A2物质和从培养物中分离K01-0509-A2物质。
本发明的又一方面提供了生产由K01-0509-A1物质和K01-0509-A2物质组成的组合物的方法，其包括培养属于链霉菌属并具有产生K01-0509-A1物质和K01-0509-A2物质的能力的微生物，在培养基中积累K01-0509-A1物质和K01-0509-A2物质和从培养物中分离含有K01-0509-A1物质和K01-0509-A2物质的组合物。
本发明的又一方面提供了生产K01-0509-A1物质的方法，其中属于链霉菌属并具有产生K01-0509-A1物质能力的微生物是链霉菌属的种K01-0509 FERM BP-08504。
本发明的又一方面提供了生产K01-0509-A2物质的方法，其中属于链霉菌属并具有产生K01-0509-A2物质能力的微生物是链霉菌属的种K01-0509 FERM BP-08504。
本发明的又一方面提供了生产由K01-0509-A1物质和K01-0509-A2物质组成的组合物的方法，其中属于链霉菌属并具有产生K01-0509-A1物质和K01-0509-A2物质的能力的微生物是链霉菌属的种K01-0509 FERM BP-08504。
本发明的又一方面提供了其为链霉菌属的种K01-0509 FERMBP-08504的微生物。
具有产生由上文中的式[I]和[II]表示的K01-0509-A1物质和K99-0509-A2物质或其组合物的能力的微生物(下文中称为“K01-0509物质产生微生物”)属于链霉菌属，例如，由本发明者新分离的链霉菌属的种K01-0509菌株是用于本发明的最有效的一例菌株。
本发明的链霉菌属的种K01-0509的菌学性质如下(I)形态学性质营养菌丝在多种琼脂培养基中生长良好，并且没有观察到断裂菌丝。气生菌丝体在酵母-麦芽提取物琼脂培养基上和甘油-天冬酰胺琼脂培养基上生长旺盛，并表现从白至浅灰的颜色。在显微镜下观察，在气生菌丝体上观察到20个以上孢子的链，其形态学形式是线性链，孢子大小为大约0.6-0.8×1.0-1.8μm的圆柱形。孢子表面光滑。没有观察到菌核(sclerotia)、孢子囊和游动孢子。
(II)多种培养基上的培养性质下表显示通过E.B Shirling和D.Gottlieb(Internationaljournal of Systematic Bacteriology，16313，1966)的方法确定的本发明的产生菌株的培养特征。以Color Harmony Manual，第四版(Container Corporation of America，Chicago，1958)作为标准颜色确定色调，记入色卡名称并同时在括号内标明颜色代码。除非另外指出，结果是在27℃下在多种培养基中培养两周观察的结果。
培养特征
(III)生理学性质(1)黑色素的形成(a)酪氨酸琼脂 阴性(b)蛋白胨-酵母-铁琼脂培养基 阴性(c)色氨酸-酵母液体 阳性(d)简单明胶培养基(21-23℃) 假阳性(2)硝酸盐还原 阴性(3)明胶液化(简单明胶培养基)(21-23℃)阴性(4)淀粉水解 阳性(5)脱脂牛奶的凝固(37℃) 阳性(6)脱脂牛奶的蛋白胨化(37℃) 阳性(7)生长温度 10-38℃
(8)碳源的利用(Pridham-Gottlieb琼脂培养基)利用 D-葡萄糖、L-阿拉伯糖不利用D-木糖、D-甘露醇、L-鼠李糖、D-果糖、肌醇、棉子糖、蜜二糖、蔗糖(9)纤维素的分解阴性(IV)细胞壁的组成成分细胞壁的2，6-二氨基庚二酸是LL类型。主要的甲基萘醌类是MK-9(H8)。
(V)结论本发明菌株的菌学性质总结如下。细胞壁中的2，6-二氨基庚二酸是LL类型，主要的甲基萘醌类是MK-9(H6)和MK-9(H8)。孢子链的形态是线性链，由长孢子链形成并具有光滑孢子表面。培养中的多种特征表现出棕色色调的营养菌丝和白色至灰色系的气生菌丝。在胰化蛋白胨-酵母液体中观察到黑色素的产生。
根据上文中的结果，基于“Bergey’s Manual of SystematicBacteriology，第四卷，1989”中所描述的，本菌株被鉴定为属于链霉菌属的菌株。
基于用于专利程序目的的国际承认的微生物保藏之布达佩斯条约，将所述菌株作为链霉菌属的种K01-0509于2003年10月6日保藏在国际专利生物保藏机构，National Institute of AdvancedIndustrial Science and Technology，AIST Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-Ken，305-8566日本，永久保藏号为FERM BP-08504。
可以认为链霉菌属K01-0509菌株是用于本发明的K01-0509物质产生菌株的优选例子。然而，因为微生物的菌学特征一般非常容易突变，因而是不稳定的。天然突变或通过紫外辐射或化学诱变例如通过N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍和甲磺酸乙基酯等诱变是众所周知的。属于链霉菌属并具有产生由上文中式[I]和[II]表示的K01-0509物质或上述物质的组合物的菌株，包括人工突变体和天然突变体或其组合，可用于本发明。
在本发明的K01-0509物质的生产中，首先将属于链霉菌属的K01-0509物质产生菌株培养在优选的培养基中。优选地用于本发明的K01-0509物质生产的营养源是微生物可同化的碳源、可降解的氮源以及无机盐、含有维生素等的营养培养基(如果需要的话)。可同化的碳源的例子是糖类，例如葡萄糖、果糖、麦芽糖、乳糖、半乳糖、糊精和淀粉等，以及植物油脂类例如大豆油等，其可单独地或一起使用。
氮源的例子是蛋白胨、酵母提取物、肉提取物、大豆粉、棉籽粉、玉米浸渍液、麦芽提取物、酪蛋白、氨基酸、尿素、铵盐和硝酸盐等，其可单独地使用或一起使用。如果需要的话，加入盐例如磷酸盐、镁盐、钙盐、钠盐、钾盐、重金属盐例如铁、锰、铜、钴或锌盐、维生素和适合用于生产K01-0509物质的物质。
在液体培养中，如果发生发泡激烈现象，优选地可加入抗发泡剂例如液体石蜡、动物油、植物油、硅油和表面活性剂等。只要含有上述营养源，可在液体或固体培养条件下进行上述培养，一般地，优选地可使用液体培养基进行培养，在少量生产的情况下，优选地使用培养瓶进行培养。
在使用大罐进行的大规模生产中，为了防止生产过程中微生物生长的延迟，优选一开始可将产生菌株接种和培养在相对少量的培养基中，随后再将培养物转移至大罐中并继续培养。在这种情况下，如果需要，用于预培养的培养基和用于生产培养的培养基的成分可以相同或不同。
在通风搅拌条件下的培养中，可使用常规的方法，例如，使用螺旋桨和其它机械搅拌器进行搅拌、旋转或摇动发酵罐，可应用通过泵入和吹入空气。用于通风的空气应当进行灭菌。培养温度可在适合K01-0509物质产生菌株生产K01-0509物质的范围之内，通常在20-30℃，优选地在27℃左右进行培养。培养pH值通常在pH 5至pH8，优选地大约pH 7。培养时间依赖于培养条件，通常为3天左右。因此而获得的积累在培养物中的K01-0509物质通常存在于培养上清液中。可单独地、重复地或以方法的任何顺序组合使用用于从微生物培养物中分离代谢物的方法从培养上清液中分离K01-0509物质。
通过从培养上清液中收集可进行K01-0509物质的分离和收集。使用已知的用于收集水溶性物质的方法，以其组合或重复的方式处理培养上清液，从而获得K01-0509物质，所述方法是例如色谱，诸如吸附色谱、凝胶过滤色谱和高效液相色谱等。
下文说明本发明的K01-0509物质的物理化学特性。
1.K01-0509-A1物质(1)性质白色粉末(2)分子式C23H40N8O8HRFAB-MS(m/z)[M+H]+计算值557.3047，实测值557.3052(3)分子量556FAB-MS(m/z)[M+H]+557，[M+Na]+579(4)紫外吸收光谱(在水中)如
图1中所显示的，终端吸收(5)红外吸收光谱(KBr片剂)如图2中显示的，在1564，1682cm-1处具有特异性最大吸收λmax。
(6)比旋光度[α]D27＝-5.00°(c＝0.1，甲醇)(7)溶剂中的溶解性可溶于水、二甲基亚砜(DMSO)和甲醇，不溶于乙腈、乙酸乙酯、氯仿和丙酮。
(8)酸性、中性和碱性分组碱性物质。
(9)氨基酸分析L-丙氨酸和L-缬氨酸(1∶1)。
(10)使用Varian NMR 400MHz(图3)测量1H核磁共振光谱(在重水中)。氢的化学位移(ppm)为0.92(3H)、0.92(3H)、1.39(3H)、1.44、1.55(3H)、1.57、1.71、1.76、1.77、1.93、2.11、3.48、3.61、3.79、3.97、4.07、4.17、4.23、4.27、4.43和4.44。
(11)使用Varian NMR100MHz(图4)测量13C-核磁共振光谱(在重水中)。碳的化学位移(ppm)为18.2、19.1、20.1、21.1、29.6、30.3、32.5、38.8、52.2、53.1、53.3、53.8、54.0、56.0、62.4、74.1、76.7、158.9、158.9、168.4、172.1、176.6和179.2。
如上所示，通过详细分析K01-0509-A1物质的各种物理化学性质和光谱数据，确定K01-0509-A1物质具有式[1]中所显示的化学结构。
2.K01-0509-A2物质(1)性质白色粉末(2)分子式C23H40N8O8HRFAB-MS(m/z)[M+H]+计算值557.3047，实测值557.3023(3)分子量556FAB-MS(m/z)[M+H]+557，[M+Na]+579(4)紫外吸收光谱(在水中)如图5中所示，终端吸收(5)红外吸收光谱(KBr片剂)如图6中所示，在1564，1682cm-1处具有特异性最大吸收λmax。
(6)比旋光度[α]D26＝-7.4°(c＝0.1，甲醇)(7)溶剂中的溶解性可溶于水、二甲基亚砜(DMSO)和甲醇，不溶于乙腈、乙酸乙酯、氯仿和丙酮。
(8)酸性、中性和碱性分组碱性物质。
(9)氨基酸分析L-丙氨酸和L缬氨酸(1∶1)。
(10)使用Varian NMR 400MHz(图7)测量1H核磁共振光谱(在重水中)。氢的化学位移(ppm)为0.92(3H)、0.92(3H)、1.39(3H)、1.44、1.53(3H)、1.57、1.71、1.76、1.77、1.93、2.12、3.48、3.61、3.79、3.99、4.07、4.09、4.23、4.27、4.44和4.50。
2.使用Varian NMR100MHz(图8)测量13C-核磁共振光谱(在重水中)。碳的化学位移(ppm)为17.0、19.2、20.1、21.1、30.1、30.4、32.6、38.8、52.2、53.2、53.8、54.0、54.9、59.8、62.4、74.2、76.8、158.9、158.9、168.3、172.1、176.6和179.0。
如上所示，通过对K01-0509-A2物质的多种物理化学性质和光谱数据的详细分析，确定K01-0509-A2物质具有式[II]中所显示的化学结构。
在下文中详细说明本发明的K01-0509物质的生物学特性。通过下列方法测定针对III型分泌系统的抑制性活性和抗细菌活性。
(1)肠致病性大肠杆菌III型分泌系统依赖性溶血抑制性活性的测定法根据由Omura等人(WO 02/057760A1和相应的美国专利6,586,200B2)建立的用于检测抑制细菌III型分泌系统和其分泌蛋白功能的物质的方法进行检测。将一个菌环量的肠致病性大肠杆菌cesT缺陷型菌株(WO 02/057760A1)接种在LB液体培养基(2.5％的LB介质，Funakoshi Co.Ltd.，日本)(5ml)并不加摇动在37℃培养12小时。将细菌培养液(1％)接种至含有酪蛋白氨基酸的M9培养基中不摇动的在37℃进一步培养4小时
。将培养液在3500rpm下离心15分钟以收集细菌细胞沉淀。在含有酪蛋白氨基酸的M9培养基(5ml)中悬浮细菌沉淀以制备受试细菌液。
通过在4℃、2500rpm下离心红细胞悬浮液5分钟来洗涤红细胞三次，所述红细胞悬浮液是通过向绵羊红细胞(8ml)(从NipponBiological Materials Center，日本获得)中加入4℃的生理盐水(40ml)制备的。测量红细胞沉淀的重量。按其比率将含有酪蛋白氨基酸的M9培养基(2ml)加入红细胞沉淀(1g)中以制备红细胞悬浮液。将由此制备的大肠杆菌悬浮液和红细胞悬浮液等量混合。将混合液(90)加入至96孔微量培养板(Corning Inc.，U.S.A)中，所述96孔板之前已加入了样品(5μl)和含有酪蛋白氨基酸的M9培养基(10μl)。将板在1500rpm下离心10分钟并在37℃下开始溶血反应，进行90-150分钟。反应后，立即加入冷却的PBS(-)(150μl)(0.8％的氯化钠(Kanto Chemical Inc.，日本)、0.115％的磷酸氢二钠(Kanto Chemical Inc.，日本)、0.02％的磷酸二氢钾(Wako PureChemical Industries Ltd.，日本)和0.02％的氯化钾(Kanto ChemicalInc.，Japan))以制备悬浮液。将通过离心获得的上清液(100μl)转移至另一个96孔微量培养板(Corning Inc.，U.S.A)中。对于洗脱的血红蛋白使用自动微量培养板读出计(Bio-Instruments Inc.，U.S.A)在550nm测量吸光度。通过下面的方程式计算溶血抑制性活性。
抑制率(％)＝100-[(A-C)/(B-C)×100]其中A当加入样品时在OD 550nm的数据B红细胞和仅有肠致病性大肠杆菌时的混合液在OD550nm的数据C红细胞单独存在时的OD550nm的数据。
结果如下。
的K01-0509-A1物质的溶血抑制性活性IC50为4.2μg/ml，K01-0509-A2物质的IC50为3.2μg/ml。经证明，两种物质都抑制III型分泌系统。
(2)通过纸盘方法对针对肠致病性大肠杆菌和多种受试微生物的抗菌活性的测定所使用的受试微生物是肠致病性大肠杆菌E2348/69(野生型菌株)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ATCC 6633、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)ATCC 9341、大肠杆菌NIHJ和野油菜黄单孢菌水稻致病变种(Xanthomonas campestris pv.Oryzae KB88)。所用的培养基是营养琼脂培养基(0.5％的蛋白胨(Kyokuto PharmaceuticalIndustrial Co.，Ltd.，日本)、0.5％肉提取物(KyokutoPharmaceutical Industrial Co.，Ltd.，日本)、0.8％琼脂(ShimizuShokuhin K.K.，日本)、pH调节至7.0)。通过纸盘法(直径6mmAdvantech Co.Ltd.，日本)估计活性，在培养24小时后测量抑制性区带。
结果，对于10μg/盘的K01-0509-A1和10μg/盘的K01-0509-A2，所有的受试微生物中没有显示抑制性区带。
如详细描述的，预期本发明的K01-0509物质可作为选择性抑制III型分泌系统而本身不表现出抗细菌活性的新型抗感染性疾病药物。
附图简述图1显示K01-0509-A1物质(在水中)的紫外吸收光谱。
图2显示K01-0509-A1物质(KBr片剂)的红外吸收光谱。
图3显示K01-0509-A1物质(在重水中)的质子核磁共振光谱。
图4显示K01-0509-A1物质(在重水中)的碳核磁共振光谱。
图5显示K01-0509-A2物质(在水中)的紫外吸收光谱。
图6显示K01-0509-A2物质(KBr片剂)的红外吸收光谱。
图7显示K01-0509-A2物质(在重水中)的质子核磁共振光谱。
图8显示K01-0509-A2物质(在重水中)的碳核磁共振光谱。
实施本发明的最优模式通过说明性实施例来说明本发明，但本发明不限于所述实施例的范围之内。
实施例将菌环量的通过琼脂斜面培养基[1.0％的淀粉(Wako PureChemical Industries Ltd.，日本)、0.3％的N-Z胺(Wako PureChemical Industries Ltd.，日本)、0.1％的肉提取物(KyokutoPharmaceutical Industrial Co.，Ltd.，日本)、0.3％的CaCO3(KantoChemical Inc.，日本)和1.2％的琼脂(Shimizu Shokuhin K.K.，日本)，pH调节至7.0]培养的K01-0509菌株接种至500ml锥形瓶中的培养基(100ml)[2.4％的淀粉(Wako Pure Chemical Industries Ltd.，日本)、0.1％葡萄糖Wako Pure Chemical Industries Ltd.，日本)、0.3％的蛋白胨(Kyokuto Pharmaceutical Industrial Co.，Ltd.，日本)、0.5％的酵母提取物(Oriental Yeast Co.，Ltd.，日本)和CaCO3(Kanto Chemical Inc.，日本)，pH调节至7.0]中，并使用旋转摇床(210rpm)在27℃下培养3天以获得种子培养物液体。将种子培养物(200ml)接种至30L的小型发酵罐中的生产性培养基(20升)(2.4％的淀粉(Wako Pure Chemical Industries Ltd.，日本)、0.1％的葡萄糖(Wako Pure Chemical Industries Ltd.，日本)、0.3％的蛋白胨(Kyokuto Pharmaceutical Industrial Co.，Ltd.，日本)、0.3％的肉提取物(Kyokuto Pharmaceutical Industrial Co.，Ltd.，日本)、0.5％的酵母提取物(Oriental Yeast Co.，Ltd.，日本)、0.4％的碳酸钙(Kanto Chemical Inc.，日本)、5.0×10-4％的七水合硫酸铁(Kanto Chemical Inc.，日本)、5.0×10-4％的四水合氯化镁(Kanto Chemical Inc.，日本)、5.0×10-4％的五水合硫酸铜(KantoChemical Inc.，日本)和5.0×10-4％的六水合氯化钴(Wako PureChemical Industries Ltd.，日本))中，在37℃下培养4天。
使用Sharpless离心机将培养4天的培养液(总共54升)离心从而分成上清液和微生物细胞。将上清液上样于活性碳柱(φ75×150mm，Wako Pure Chemical Industries Ltd.，日本)中，用水(1.5升)洗涤，用20％和40％的丙酮(各1.5升)洗脱活性成分，在减压下浓缩并冻干。将获得的粗提物质(21.5g)溶解于少量水中并上样于Amberlite IRC-50(H+)柱(φ46×110mm，Organo Corp.，日本)中，用水(300ml)洗涤。用1N HCl(600ml)洗脱活性成分，中和，并通过电透析方法脱盐，减压浓缩并冻干以获得粗提取物(823mg)。
将粗提取物(200mg)溶解在少量水中，装入业已用0.1％的三氟乙酸水溶液平衡的ODS柱(φ10×30mm，Senshu Scientific Co.，日本)中，用0.1％的三氟乙酸水溶液(10ml)洗涤，用20％的甲醇(在0.1％三氟乙酸水溶液中)(5ml)洗脱，在减压下浓缩并冻干。用相同的方式处理剩下的粗提物质(623mg)，从而获得活性物质(103mg)。将活性物质(103mg)溶解在少量水中，使用制备型HPLC(柱DevelosilC30-UG-5，φ20×250mm，Nomura Chemical Co.，Ltd.，日本)进行纯化。在流速为5ml/分钟的8％的甲醇(在0.1％三氟乙酸水溶液中)等度流动相中监测210nm的UV吸收。观察到在第88分钟的保留时间上显示活性的峰并收集该峰。在减压浓缩收集溶液并冻干。
将所得的活性物质(8.3mg)溶解在少量的水中并使用制备型HPLC(柱Develosil C30-UG-5，φ20×250mm，Nomura Chemical Co.，Ltd.，日本)进行纯化。在流速为5ml/分钟的3％的乙腈(在0.05％磷酸水溶液中)等度流动相中监测在210nm的UV吸收。观察到在27分钟和30分钟的保留时间上显示活性的峰并收集该峰。在真空中浓缩收集的溶液继续脱盐、并上样于用0.1％三氟乙酸水溶液平衡的ODS柱(φ5×10mm，Senshu Scientific Co.，日本)中，用0.1％的三氟乙酸水溶液(5ml)洗涤，用含有0.1％(终浓度)三氟乙酸的100％的甲醇(5ml)洗脱活性物质，在真空浓缩中并冻干，从而获得白色粉末状K01-0509-A1物质(1.1mg)和K01-0509-A2物质(1.5mg)。
工业实用性如上文中所说明的，在培养基中培养具有产生K01-0509-A1物质和K01-0509-A2物质的能力、属于链霉菌属的由菌株K01-0509代表的微生物，分离具有针对III型分泌系统的抑制性活性的K01-0509-A1物质和K01-0509-A2物质。这些物质可预期用作对治疗或预防具有III型分泌系统的肠致病性革兰氏阴性细菌感染选择性有效的药物。
权利要求
1.由式[I]表示的K01-0509-A1物质；
2.由式[II]表示的K01-0509-A2物质； 其是K01-0509-A1物质的立体异构体。
3.K01-0509物质的组合物，其由具体的式[I]表示的K01-0509-A1物质； 和/或具体的式[II]表示的K01-0509-A2物质组成； 所K01-0509-A2物质是K01-0509-A1物质的立体异构体。
4.用于生产权利要求1中描述的K01-0509-A1物质的方法，其包括在培养基中培养属于链霉菌属并具有产生K01-0509-A1物质的能力的微生物，在培养基中积累K01-0509-A1物质并从培养物中分离K01-0509-A1物质。
5.用于生产权利要求2中描述的K01-0509-A2物质的方法，其包括在培养基中培养属于链霉菌属并具有产生K01-0509-A2物质的能力的微生物，在培养基中积累K01-0509-A2物质并从培养物中分离K01-0509-A2物质。
6.用于生产组合物的方法，其包括在培养基中培养属于链霉菌属并具有产生K01-0509-A1物质和/或K01-0509-A2物质的能力的微生物，在培养基中积累K01-0509-A1物质和/或K01-0509-A2物质并从培养物中分离K01-0509-A1物质和/或K01-0509-A2物质。
7.用于生产权利要求4的K01-0509-A1物质的方法，其中所述属于链霉菌属并具有产生K01-0509-A1物质的能力的微生物是链霉菌属的种K01-0509 FERM BP-08504。
8.用于生产权利要求5的K01-0509-A2物质的方法，其中所述属于链霉菌属并具有产生K01-0509-A2物质的能力的微生物是链霉菌属的种K01-0509 FERM BP-08504。
9.用于生产权利要求6的由K01-0509-A1物质和/或K01-0509-A2物质组成的组合物的方法，其中所述属于链霉菌属并具有产生K01-0509-A1物质和/或K01-0509-A2物质的微生物是链霉菌属的种K01-0509 FERM BP-08504。
10.一种微生物，其为链霉菌属的种K01-0509 FERM BP-08504。
11.权利要求10的微生物，其中所述微生物是链霉菌属的种K01-0509 FERM BP-08504的突变体。
全文摘要
本发明由如下组成在培养基中培养具有产生K01－0509－A1物质和/或K01－0509－A2物质的能力、属于链霉菌属的微生物，在培养基中累积K01－0509－A1物质和/或K01－0509－A2物质，并从培养物中分离K01－0509－A1物质和/或K01－0509－A2物质。如此所得这些物质可预期用作治疗对具有III型分泌系统的肠致病性革兰氏阴性细菌感染选择性有效的药物。
文档编号C12N1/20GK1878788SQ200480033109
公开日2006年12月13日 申请日期2004年2月9日 优先权日2004年2月9日
发明者大村智, 供田洋, 阿部章夫, 岩月正人, 高桥洋子 申请人:社团法人北里研究所