专利名称：腺病毒转染的初级细胞以及路径图谱绘制方法
背景技术：
发明领域本发明涉及路径图谱绘制领域，特别是非永生细胞系免疫细胞的路径图谱绘制。本发明还涉及调控胞内信号传递路径表达的领域。
相关领域的说明胞内信号传递路径是这样的一组基因，其表达受到由初始刺激起始的基因到基因的相互作用级联的控制。换言之，胞内信号传递路径的初始刺激直接地或者通过路径中的另一基因间接地控制该路径中每一个基因的表达。已知的信号传递路径参与包括免疫应答、发育、有丝分裂和炎症等在内的广泛的生物活动，而且包括但不限于促分裂原活化蛋白激酶(“MAPK”)路径，蛋白激酶A(“PKA”)信号传递路径，蛋白激酶C(“PKC”)信号传递路径，I型干扰素信号传递路径，钙调磷酸酶(“CaN”)信号传递路径，κB细胞顺式作用核因子(“NFκB”)信号传递路径以及IκB激酶(“IKK”)信号传递路径。尽管在广泛的疾病状态中都牵涉到信号传递路径缺陷，但在许多情况下，我们对于初始刺激和最终的细胞应答之间的信号传递路径知之甚少。
路径图谱绘制通常是指阐明路径初始刺激和最终应答之间的步骤。就本发明来说，“路径图谱绘制”是指确定候选顺式作用调节元件是否直接或间接地受给定信号传递路径的控制。已知的路径图谱绘制方法采用来自培养的细胞系的宿主细胞，该宿主细胞已用含有有效地连接于待测调节元件的报告基因的DNA质粒转染。本领域已很好地确立了报告基因的使用。参见Kain，SR和Ganguly，S，《最新分子生物学实验方法汇编》中第9.6单元的“基因报告系统综述”(Overview of Genetic Reporter Systems，Unit9.6 in Current Protocols in Molecular Biology)，编辑Ausubel，FM等人(Wiley and Sons，NY，1995)。
转染是指将外来DNA导入宿主细胞如培养的哺乳动物细胞中。已证明转染是分析基因及其相关基因产物的功能、调节和相互作用的强有力工具。本领域已经很好地确立了转染细胞的操作。化学和物理转染方法包括DEAEdextran(Fox RM等人，《生物化学》(Biochemistry)10月4日；16(20)4470-7，PMID 911769(1977))，磷酸钙(Pear，W.S.，Nolan，G.P.，Scott，M.L.，& Baltimore，D.《美国国家科学院院报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)90，8392(1993))，脂质体介导的转染(Zhang WW等人，《生物技术》(Biotechniques)11月；15(5)868-72(1993))，微注射(Colbere-Garapin F和Garapin AC，《发育生物学标准》(Dev Biol Stand)；55267-71，PMID6329857(1983))以及电穿孔(Neumann E和Kakorin S，《癌症研究和治疗技术》(Technol Cancer Res Treat.)10月；1(5)329-40(2002))。本领域也已很好地确立了重组腺病毒载体在转染中的用途。参见Berkner，KI和Sharp，PA《核酸研究》(Nucelic Acids Res.)116003-6020(1983)；Berkner，KI和Sharp，PA《生物技术》(BioTechniques)6616-629(1988)；Bett，AJ，Haddara，W，Prevec，L和Graham，FL《美国国家科学院院报》(PNAS)USA 918802-8806(1994)；Hitt，M，Addison，CL和Graham，FL《药理学进展》(Adv.Pharmacol.)40137-206(1997)。其中，重组腺病毒业已被用来转染心脏组织(Ardehali，A.J.Thor.Cardiovas.Surg.111246-252(1996))和淋巴细胞(Leon，RP，Hedlund，T，Meech，SJ，Li，S，Schaack，J，Hunger，SP，Duke，RC和DeGregori，J《美国国家科学院院报》(PNAS)USA 9513159-13164(1998))。人类腺病毒系双链DNA病毒，其通过受体介导的内吞作用而进入细胞。这些病毒由于易于培养和操作且显示出广泛的体内体外宿主范围而被认为非常适合用于基因转移。腺病毒能够感染静止的以及复制中的靶细胞，并持续存在于染色体之外，而不是整合到宿主染色体组中。重组腺病毒能够容纳相对较大的外来DNA片段(大约7kb)，并具备高滴度病毒产量的优点。
用于路径图谱绘制的报告基因构建体的已知载体包括pCRE-d2EGFP质粒，该产品可由BD Biosciences Clontech商购获得。该质粒含有有效地连接于绿色荧光蛋白(“GFP”)报告基因的环腺苷酸应答元件(“CRE”)，并且可用来测量诸如Jun N-端激酶(“JNK”)信号传递路径、p38MAPK信号传递路径以及蛋白激酶A(“PKA”)信号传递路径中的活性。该质粒使用pUC复制起点在大肠杆菌(E.coli)中进行繁殖，并使用病毒fl起点用于产生单链DNA。该质粒以比基于腺病毒载体低得多的转染效率在真核细胞中转染，并且只有用于培养的真核细胞系而非初级真核细胞培养物时才足够有效。由于已知的用于免疫细胞路径图谱绘制的载体不能足够行之有效地用于初级免疫细胞，使用现有技术的方法的路径图谱绘制目前仅可用于培养的细胞系。然而，与其非永生化对应物相比，永生化的培养细胞系倾向于具有显著不同的蛋白表达模式。人们期望能够对高等生物体的初级宿主细胞进行路径图谱绘制而无需不必要地破坏其细胞的正常表达模式。人们特别期望能够对初级免疫细胞进行路径图谱绘制而不必将其转换成永生化细胞系。
发明概述一方面，本发明涉及确定已知调节免疫细胞信号传递路径表达的刺激是否能够调节候选顺式元件表达的方法，其步骤包括用具有有效地连结于候选顺式元件的报告基因的重组腺病毒转染免疫细胞；测量报告基因活性的基底水平；对免疫细胞施加刺激；以及测量响应所述刺激的报告基因活性。在另一方面，所述刺激调控着调节蛋白的表达。又在另一方面，所述方法还包括共转染调节蛋白的表达系统。在可选的方面，所述刺激是引入候选调节化合物。在另一方面，报告基因为荧光素酶、绿色荧光蛋白(“GFP”)、β-半乳糖苷酶(“GAL”)、氯霉素乙酰转移酶(“CAT”)或抑制基因如IκBsd。另一方面，所述顺式元件与炎症相关。另一方面，所述顺式元件为AP-1、CRE、ISRE、NFAT、NFκB或SRE。另一方面，所述免疫细胞为巨噬细胞、CD4+T细胞或未成熟树突细胞。
一方面，本发明涉及抑制免疫细胞信号传递路径表达的方法，其步骤包括用含有有效地连结于属于该信号传递路径的顺式元件的抑制基因的重组腺病毒转染免疫细胞，并诱导该抑制基因表达。在另一方面，信号传递路径为NFκB信号传递路径。又在另一方面，抑制基因为IκBsd。在另一方面，所述免疫细胞为巨噬细胞、CD4+T细胞或未成熟树突细胞。
附图的简短说明
图1A表示转染了能够表达绿色荧光蛋白的重组腺病毒(“AdV:GFP”)的巨噬细胞。
图1B表示转染了能够表达绿色荧光蛋白的重组腺病毒(“AdV:GFP”)的树突细胞。
图1C表示T淋巴细胞中绿色荧光蛋白的表达。
图1D表示B淋巴细胞中绿色荧光蛋白的表达。
图2表示两种不同的细胞培养物，一种转染了能够表达IκB超显性突变体的重组腺病毒(“Adv:IκBsd”)，另一种转染了能够表达绿色荧光蛋白的重组腺病毒(“AdV:GFP”)，每一种都以相差和碘化丙锭染色表示。
图3A为表示IκB超显性突变体(“IκBsd”)阻断NFκB信号传递路径的示意图。
图3B为表示树突细胞成熟期间NFκB激活的抑制对炎症细胞因子表达的影响的图表。
图4为表示基于重组腺病毒的启动子/报告基因系统的示意图。
图5A为表示经刺激后CD4+T细胞中CRE顺式元件的激活的图表。
图5B为表示经刺激后CD4+T细胞中AP-1顺式元件的激活的图表。
图5C为表示经刺激后CD4+T细胞中NFκB顺式元件的激活的图表。
图5D为表示经刺激后CD4+T细胞中ISRE顺式元件的激活的图表。
图6A为表示巨噬细胞中顺式元件的激活的图表。
图6B为表示树突细胞中顺式元件的激活的图表。
图7A为表示假定路径图谱绘制试验的结果的示意图。
图7B为表示假定路径图谱绘制试验的结果的示意图。
发明详述本发明提供了确定顺式作用调节元件在初级免疫细胞的信号传递路径中的作用的方法和组合物。为本发明的目的计，“顺式作用调节元件”与“顺式元件”互换使用，是指有效地连接于编码序列的多核苷酸调节元件，其中所述调节元件调控所述编码序列的表达。为本发明的目的计，“胞内信号传递路径”与“信号传导路径”、“信号传递路径”以及“路径”互换使用，是指基因的集合，它们的调节直接或间接地受给定的初始刺激调控。在典型的信号传递路径中，初始刺激激活第一顺式元件，其激活相应的第一调节蛋白的产生。第一调节蛋白随之激活该路径中的第二顺式元件，其依次又激活第二调节蛋白的产生。第二调节蛋白随之又激活第三顺式元件，等等。在这个实例中，初始刺激间接地调控第三顺式元件。为本发明的目的计，顺式元件如果直接或间接地受某路径的初始刺激调控，则将该顺式元件鉴定为属于该路径。为本发明的目的计，“初始刺激”是指调控路径活性的任何现象。初始刺激包括但不限于调节蛋白表达的增加或减少、病毒感染、过敏原接触、DNA损伤和胞外应激等。胞外应激的实例包括但不限于热激、渗透应激、pH应激和电离辐射。
许多人类疾病都源于免疫细胞如巨噬细胞，T细胞以及树突细胞信号传递路径中的一种或多种缺陷。例如，其中，p38促分裂原活化蛋白激酶(“MAPK”)路径业已牵涉到导致关节炎、败血症和HIV病毒感染的原因。同样地，I型干扰素信号传递路径的缺陷也会造成对病毒感染的应答不足。下文描述一些已知的信号传递路径及其已知的组成顺式元件。
顺式作用调节元件及其路径顺式作用调节元件亦称之为顺式元件，是有效连接于编码序列的多核苷酸调节元件，其中所述调节元件调控所述编码序列的表达。顺式作用调节元件的实例包括但不限于激活蛋白1(“AP-1”)、环腺苷酸应答元件(“CRE”)、干扰素刺激的应答元件(“ISRE”)、核因子激活的T细胞(“NFAT”)，κB细胞核因子(“NFκB”)以及血清应答(“SRE”)。
顺式作用激活蛋白1(“AP-1”)增强子元件受转录因子c-jun和c-fos调控。顺式作用AP-1增强子元件出现在c-jun N-端蛋白激酶(“JNK”)信号传递路径之中。JNK信号传递路径为一类促分裂原活化蛋白激酶(“MAPK”)路径，MAPK信号传递路径牵涉到针对多种形式胞外应激的细胞应答以及对凋亡的细胞敏感性。
顺式作用环腺苷酸应答元件(“CRE”)增强子元件受转录因子ATF2和CREB调控。顺式作用CRE增强子元件出现在JNK信号传递路径、p38信号传递路径以及蛋白激酶A(“PKA”)信号传递路径之中。和JNK信号传递路径一样，p38信号传递路径是一类促分裂原活化蛋白激酶(“MAPK”)路径，并牵涉到针对多种形式胞外应激和炎症细胞因子的细胞应答。PKA信号传递路径牵涉到有丝分裂。
顺式作用干扰素刺激的应答元件(“ISRE”)增强子元件受转录因子STAT1和STAT2调控。顺式作用ISRE增强子元件出现在I型干扰素信号传递路径之中。I型干扰素信号传递路径牵涉到针对病毒感染的细胞应答。
顺式作用核因子激活的T细胞(“NFAT”)增强子元件受转录因子NFAT调控。顺式作用NFAT增强子元件出现在蛋白激酶C(“PKC”)信号传递路径和钙调磷酸酶(“CaN”)的信号传递路径之中。PKC信号传递路径牵涉到组胺在血管收缩中的作用。CaN信号传递路径牵涉到心脏肥大。
顺式作用κB细胞核因子(“NFκB”)增强子元件受转录因子NFκB调控。顺式作用NFκB增强子元件出现在IκB激酶(“IKK”)信号传递路径和NFκB信号传递路径之中。IKK和NFκB信号传递路径牵涉到针对多种形式胞外应激的细胞应答。
顺式作用血清应答元件(“SRE”)增强子元件受转录因子Elk-1和SRF调控。顺式作用SRE增强子元件出现在MAPK信号传递路径和JNK信号传递路径之中。
上文所列的顺式元件已知属于各自的路径或上文所列的路径。但是，还存在许多顺式元件其信号传递路径的归属尚未确定。本发明的一个实施方案提供了一种确定候选顺式元件是否属于给定路径的方法。在这个实施方案中，首先将含有有效地连接于报告基因的候选顺式元件的报告基因构建体转染到宿主初级细胞如免疫细胞之中。然后以激活待研究路径的方式刺激该宿主细胞。然后测量该报告基因的活性。如果报告基因的活性响应刺激而受到调控，则确定该候选顺式元件属于该待研究路径。
报告基因构建体的构建和递送本发明的一个实施方案使用含有有效地连接于候选顺式元件的报告基因的重组报告基因构建体。在一个实施方案中，通过基于腺病毒的载体将该重组报告基因构建体递送到宿主细胞中。图4为显示基于重组腺病毒的载体的示意图。在一个实施方案中，该载体衍生自5型腺病毒基因组，如市售的BD ADENO-X DNA，其长度大约为33kb，并已介由缺失大部分的E1和E3区而被改变。该重组报告基因插入物含有候选顺式元件、位于所述候选顺式元件上游的转录阻遏物以及位于所述候选顺式元件下游的报告基因。
该上游转录阻遏物(“TB”)元件降低报告基因的本底转录水平，并可能包括一个或多个转录中止元件或聚腺苷酸化位点。典型的报告基因包括但不限于荧光素酶、β-半乳糖苷酶(“GAL”)、氯霉素乙酰转移酶(“CAT”)、绿色荧光蛋白(“GFP”)及它们的变体，包括但不限于去稳定化的变体。在下文更为详细说明的一个实施方案中，报告基因为能够阻断信号传递路径表达的超显性突变体。
在一个实施方案中，重组报告基因插入物侧接I-Ceu I限制性位点和PI-Sce I限制性位点，并在体外连接到用I-Ceu I和PI-Sce I预切的线性化的BD ADENO-X DNA上。将所得的DNA在大肠杆菌中培养，并将纯化的质粒转染到HEK293细胞中。重组病毒通过将全长重组腺病毒DNA转染到HEK293细胞中进行拯救，然后扩增以产生高滴度的贮液。
确定候选顺式元件是否属于某一路径包含候选顺式元件的报告基因构建体一经克隆到基于腺病毒的载体中，则通过将载体与宿主细胞在足够的感染复数(MOI)下接触并孵育足够长的时间而将报告基因构建体转染到宿主细胞中。下文的实施例中提供了适当的MOIs和孵育时间的实例。
一旦宿主细胞经包含候选顺式元件的报告基因构建体转染后，就对报告基因活性的基底水平进行测量。然后，对细胞施加已知能激活待研究路径的刺激。例如，如果待研究路径为p38 MAPK路径，则所施加的刺激可以是炎症细胞因子或细胞应激，如热击或高渗介质。在施加刺激之后，再次测量报告基因的活性，并与其基底水平的活性进行比较。如果报告基因的活性随着施加刺激而受到调控，则确定该候选顺式元件属于该待研究路径。
实施例以下的实施例为非限制的。例如，也考虑使用未列出的其它顺式元件，正如使用未列出的其它报告基因和调节基因一样。就本发明的目的来说，“离体”是指使用初级细胞培养物，而不是使用永生化的细胞系。
实施例初级人类免疫细胞中的重组腺病毒感染本实施例中，利用能够组成型地表达绿色荧光蛋白的重组腺病毒(“AdV:GFP”)研究了所有主要细胞类型的初级人类免疫细胞对腺病毒感染的易感性。这样的重组腺病毒可从Quantum Biology商购获得。本实施例中，由AdV:GFP成功转染的初级人类免疫细胞类型包括骨髓巨噬细胞、体外分化的未成熟树突细胞(“iDCs”)以及外周血单核细胞(“PBMCs”)。iDCs是由利用IL-4和GM-CSF从PBMCs中负选择的CD14+细胞制备的。巨噬细胞和iDCs用Adv:GFP以每个细胞10-330范围的感染复数感染，随即孵育16-24小时。然后在荧光显微镜下检查细胞的GFP表达。
图1A显示了转染的骨髓巨噬细胞中的GFP表达，而图1B显示了100MOI下转染的iDC中的GFP表达。在此MOI下，高达90％的细胞表现出可检测的GFP表达。
新鲜的外周血单核细胞(“PBMCs”)用AdV:GFP以每个细胞100-1000范围的MOI感染。在感染24小时后，用特异于CD4和CD19的单克隆抗体标记感染的细胞。
图1C显示了CD4+T淋巴细胞中的GFP表达，而图1D显示了用AdV:GFP以300MOI感染的CD19+B淋巴细胞中的GFP表达。在这两个图中，GFP表达都是用可由BD Biosciences商购的FACSCalibur分析仪在515nm利用FL1设置测量的。两图中所示的荧光强度移位表明在这两种培养物中大多数细胞均表现出可检测的GFP表达。
实施例用AdV:IκBsd阻断巨噬细胞中的NFκB信号传递路径本实施例中，构建了能够组成型表达超显性IκB突变体的重组腺病毒(“AdV:IκBsd”)。IκBsd突变体包含人IκBa的两个点突变，即丝氨酸32和丝氨酸36都变成了丙氨酸。从而，IκBsd突变体不能由IκB激酶-b磷酸化。这样，IκBsd突变体能够通过防止蛋白酶体介导的IκBa降解而阻断NFκB信号传递路径。在没有NFκB信号传递路径的情况下，例如当其被超显性IκB突变体所阻断时，TNF-α处理诱导包括巨噬细胞在内的多种细胞的凋亡。
本实施例中，骨髓巨噬细胞由AdV:GFP感染作为对照，或由AdV:IκBsd感染。然后用10nM的TNF-α处理两组巨噬细胞。通过碘化丙锭(“PI”)染色测量细胞凋亡，PI在不出现细胞通透的情况下对DNA进行染色。
如图2所示，NFκB信号传递路径保持完好无损的对照组AdV:GFP表现出最低的细胞凋亡诱发率，低于总细胞数的5％(未感染的对照细胞和未经TNF-α处理的感染细胞也表现出低于5％的细胞凋亡诱发率)。相比之下，AdV:IκBsd细胞显示了高于75％的细胞凋亡诱发率。从而证明AdV:IκBsd有效地阻断了巨噬细胞中的NFκB信号传递路径。
实施例用AdV:IκBsd阻断树突细胞中的NFκB信号传递路径本实施例中，测定了在体外分化的人类树突细胞(“iDCs”)中的NFκB信号传递路径的阻断效应。图3A为表示经脂多糖(“LPS”)或CD40配体(“CD40L”)激活的iDC的信号传递路径的示意图，其中NFκB信号传递路径为IκBsd所阻断。LPS激活TLR4；CD40L激活CD40。
本实施例中，iDC如下获得首先，通过密度梯度离心获得外周血单核细胞(“PBMCs”)。一种密度梯度离心介质为FICOLL PAQUE，可从Amersham Biosciences商购获得。然后通过磁去分选(magnetic depletion)非单核细胞而从PBMCs中分离出单核细胞。最后，利用IL4和GM-GSF对单核细胞处理6天，从单核细胞中分离出iDCs。
本实施例中，随之对分离iDCs的静息培养物(1)进行模拟感染，(2)用AdV:GFP以100的感染复数进行感染作为对照，或(3)用AdV:IκBsd以100的感染复数进行感染(就本发明的目的来说，“感染复数”(“MOI”)是指感染单位与被感染细胞的比率。除非另有说明，感染复数均表达为感染单位与HEK293T细胞的比率)。经过16-24小时的孵育期后，随之对每组iDCs(1)进行模拟激活，(2)用浓度为1μg/ml的LPS激活，或(3)用浓度为1μg/ml的CD40L激活。在iDC成熟期间，NFκB激活的抑制对炎性细胞因子表达的影响通过对选择性细胞因子和趋化因子的实时PCR分析以及对多种细胞因子分泌的血细胞计数珠分析法进行。激活后4-8小时，提取RNA，并通过TaqMan实时PCR测量多种细胞因子和趋化因子的表达水平。同样，在激活后8小时收集上清液，并通过血细胞计数珠分析法检查细胞因子的分泌。
图3B为表示相对于AdV:GFP感染细胞的AdV:IκBsd感染细胞中选定细胞因子的表达的图表。本实施例中，证明AdV:IκBsd有效地阻断了激活的树突细胞中的NFκB信号传递路径。具体来说，该图显示IL-12、IL-10、IL-8和IL-6的表达显著降低。
实施例AdV:IκRsd与S0101627的比较本实施例中，利用超显性IkB的表达或已知的IkB激酶β抑制剂化合物S0101627的抑制作用的并行比较，全面研究了在LPS或CD40配体激活树突细胞期间NFkB信号传递路径的抑制。本实施例中，对iDCs(1)进行模拟感染，(2)用AdV:GFP感染作为对照，或(3)用AdV:IkBsd感染12个小时，接着用LPS或CD40L进行激活。激活时，对没有感染的iDC用S0101627进行处理。激活后8小时，收集上清和细胞，进一步处理，并分别进行炎性细胞因子的血细胞计数珠分析以及选择性细胞因子/趋化因子表达的实时PCR对分析。细胞因子和趋化因子表达的实时PCR数据分别示于表1和表2中。
表1.化学抑制剂(cmpd)或利用腺病毒(AdV:IkB)通过生化抑制NFkB信号传递路径时选择性细胞因子的表达
表2.化学抑制剂(cmpd)或利用腺病毒(AdV:IkB)通过生化抑制NFkB信号传递路径时选择性趋化因子的表达
这些结果表明了与S0101627化合物相当的高转染效率和对NFκB信号传递路径的高抑制效率。
实施例产生能够表达处于与炎症相关的选择性顺式元件的控制之下的报告基因或调节基因的重组腺病毒本实施例举例说明了用于对与炎症相关的信号传递路径进行图谱绘制的重组腺病毒构建体的构建。后面的实施例将对其使用进行说明。本实施例中，基于可由BD Biosciences Clontech商购获得的BD ADENO-X多核苷酸构建了重组腺病毒。也考虑使用其它重组腺病毒，故ADENO-X的使用不应视为是限制性的。ADENO-X病毒DNA长度大约为33kb。其衍生自5型腺病毒基因组，并已通过缺失大部分的腺病毒E1和E3区而被改变。图4提供了重组腺病毒载体以及其中插入的启动子/报告基因系统的示意图。
如图4所示，插入物包含位于顺式作用增强子元件上游的转录阻遏物，其有效地连接于荧光素酶报告基因。图4中所示的6个顺式元件仅为示例而非限制。除了所列出的以外，也考虑使用其它的顺式元件。也考虑可以使用其它报告基因来代替荧光素酶。同样也考虑插入物含有调节基因，如IκBsd超显性突变体来代替报告基因。
如图4所示，插入物被克隆到重组腺病毒的E1区。通过将该重组腺病毒构建体转染到HEK293细胞中而进行拯救，然后进行扩增以制备高滴度的腺病毒贮液。经过两个循环的扩增后，通常能够在HEK293中获得大约1×109pfu/ml的病毒滴度。
实施例利用报告基因重组腺病毒对初级人类免疫细胞进行感染本实施例利用能够表达处于特定顺式元件的控制之下的报告基因的重组腺病毒来对特定的信号传递路径进行图谱绘制。表3列出了用来产生这些重组腺病毒的与炎症相关的顺式元件及其相应的转录因子和信号传递路径。
表3.与炎症相关的信号传递路径
在本实施例中，利用前一实施例的报告基因重组腺病毒感染初级人类免疫细胞。然后对感染的细胞进行刺激，并观察响应该刺激的报告基因活性。
施加给感染细胞的刺激取决于感染细胞的类型。例如，CD4+T细胞用PMA/离子霉素(“PI”)或在蛋白质G的存在下用抗CD3和CD28的抗体刺激。或者，巨噬细胞如衍生自从CD14+单核细胞的附着在板上的巨噬细胞用脂多糖(“LPS”)来刺激。类似地，树突细胞如体外分化的树突细胞用LPS刺激。
刺激后经过一定的时间，收集细胞并测量荧光素酶活。荧光素酶活可通过酶分析法使用产生光子的底物并利用光度计测量光子来测量。
本实施例中，CD4+T细胞是如下制备的首先，通过密度梯度离心获得外周血单核细胞(“PBMCs”)。一种密度梯度离心介质为FICOLLPAQUE，可从Amersham Biosciences商购获得。然后通过磁去分选CD8+T细胞、B细胞、NK细胞以及单核细胞而将CD4+T细胞从PBMCs中分离出来。
本实施例中，分离的CD4+T细胞的静息培养物随之用含在特定顺式元件控制之下转录的荧光素酶基因的重组腺病毒感染。本实施例中，利用4种重组腺病毒构建体感染4种不同的静息CD4+T细胞培养物，每个构建体包含以下四种顺式元件之一CRE、AP-1、NFκB和ISRE。感染后再孵育16个小时后，随之对细胞(1)进行模拟刺激(“C”)，(2)用20ng/ml的PMA和0.5ug/ml的离子霉素(“PI”)刺激，或(3)用10ng/ml的抗-CD3mAb、5ug/ml的抗-CD28mAb和10ug/ml的蛋白质G(“3-28”)刺激。然后在刺激后8小时、24小时和48小时收集细胞并测量荧光素酶活。荧光素酶活可用光度计测量。图5A为表示用含CRE顺式元件的重组腺病毒感染的CD4+T细胞的荧光素酶活的图表。图5B为表示用含AP-1顺式元件的重组腺病毒感染的CD4+T细胞的荧光素酶活的图表。图5C为表示用含NFκB顺式元件的重组腺病毒感染的CD4+T细胞的荧光素酶活的图表。图5D为表示用含ISRE顺式元件的重组腺病毒感染的CD4+T细胞的荧光素酶活的图表。这些图显示，在PI刺激后48小时，CRE和AP-1顺式元件显著活化，而其它顺式元件和刺激组合未见明显活化。
对CD14+结合在板上的巨噬细胞也进行了类似的实验。本实施例中，巨噬细胞如下获得首先，通过密度梯度离心获得外周血单核细胞(“PBMCs”)。一种密度梯度离心介质为FICOLL PAQUE，可从AmershamBiosciences商购获得。然后通过磁去分选非单核细胞而从PBMCs中分离出单核细胞。最后，通过在无胎牛血清(“FBS”)存在时将单核细胞附着到组织培养板上而将巨噬细胞从单核细胞中分离出来。
本实施例中，分离的巨噬细胞的静息培养物随之用含在特定顺式元件控制之下转录的荧光素酶基因的重组腺病毒感染。本实施例中，使用4种重组腺病毒构建体感染4种不同的巨噬细胞培养物，每个构建体含有以下四种顺式元件之一CRE、AP-1、NFκB和ISRE。巨噬细胞以每个细胞100的感染复数进行感染。感染后再孵育16个小时后，随之对巨噬细胞进行模拟刺激(“对照“)或用浓度1μg/ml的脂多糖(“LPS”)刺激。在刺激后24小时收集细胞并用光度计测量荧光素酶活。图6A为显示四组巨噬细胞荧光素酶活的图表，它们分别为四种重组腺病毒之一感染，每种重组腺病毒分别含AP-1顺式元件、CRE顺式元件、ISRE顺式元件和NFκB顺式元件。该图显示，AP-1和CRE顺式元件具有显著的基底水平活化和显著的刺激活化。
对体外分化的树突细胞(“iDCs”)也进行了类似的实验。本实施例中，iDCs如下获得首先，通过密度梯度离心法得外周血单核细胞(“PBMCs”)。一种密度梯度离心介质为FICOLL PAQUE，可从Amersham Biosciences商购获得。然后通过磁去分选非单核细胞而从PBMCs中分离出单核细胞。最后，利用IL4和GM-GSF对单核细胞处理6天，从单核细胞中分离出iDCs。
本实施例中，分离的iDCs的静息培养物随之用含在特定顺式元件控制之下转录的荧光素酶基因的重组腺病毒感染。本实施例中，使用3种重组腺病毒构建体感染3种不同的iDCs培养物，每个构建体含以下三种顺式元件之一AP-1、NFκB和ISRE。iDCs以每个细胞100的感染复数进行感染。感染后再孵育16小时后，随之对iDCs进行模拟刺激(“C”)或用浓度1μg/ml的脂多糖(“LPS”)刺激。在刺激后2小时、4小时、8小时和24小时收集细胞并用光度计测量荧光素酶活。图6B包含三个图表，分别表示AP-1、NFκB和ISRE刺激的时间曲线。这些图表证明了所有三种顺式元件的显著刺激。这些图表还显示了不同的活化时间曲线。
实施例在药物开发过程中使用腺病毒报告基因系统来进行靶标确认和体外化合物激活前面的实施例证明了初级人类免疫细胞在受到特定刺激后转录因子的选择性活化以及活化时间曲线。这些观察结果使得人们能够利用这些基于腺病毒的转录因子激活报告基因系统在药物开发过程中来进行靶标确认和化合物激活。图7A和7B为说明这一过程的示意图。
本实施例中，靶细胞用不同的重组腺病毒报告基因感染，如图7A和7B第一至六列所示。然后向培养物中加入刺激。孵育了特定的时间后，再测量荧光素酶活。实心圆代表假定的荧光素酶活。没有刺激处理，则可能记录到没有或不可检测的荧光素酶活。如果刺激激活了转录因子与其应答元件的结合，如c-jun与AP-1增强子元件的结合，则会诱导转录，并能够检测到荧光素酶活。图7A中A和B行所代表的不同刺激物可能激活不同的信号传递路径。
一旦确立了这一点，则可联合报告基因腺病毒实现靶基因的显性负突变如IκBsd的共感染。靶标所潜在涉及到的特定信号传递路径的激活可能降低其经特定刺激后的激活作用(记录为降低的荧光素酶活)。图7B为表示存在和不存在显性负突变共感染时重组腺病毒报告基因的活性示意图。
权利要求
1.一种确定刺激是否能够激活免疫细胞中的候选顺式作用调节元件的方法，其中所述顺式作用调节元件受至少一种转录因子或增强子的调节，且其中所述刺激已知能够调控信号传递路径的表达，所述方法包括步骤(a)用重组腺病毒转染所述免疫细胞，所述重组腺病毒含有有效地连接于所述候选顺式作用调节元件的报告基因；(b)测量报告基因活性的基底水平；(c)对所述免疫细胞施加所述刺激；和(d)测量响应所述刺激的报告基因的活性。
2.权利要求1的方法，其中所述刺激包括调控调节蛋白的表达，并且所述施加步骤(c)包括调控所述调节蛋白的表达。
3.权利要求2的方法，还包括用所述调节蛋白的表达系统共转染所述免疫细胞的步骤。
4.权利要求1的方法，其中所述施加步骤(c)包括引入候选调节化合物。
5.权利要求1的方法，其中所述报告基因选自荧光素酶、绿色荧光蛋白(“GFP”)、β-半乳糖激酶(“GAL”)、氯霉素乙酰转移酶(“CAT”)。
6.权利要求1的方法，其中所述报告基因为抑制基因。
7.权利要求6的方法，其中所述抑制基因为IκBsd。
8.权利要求1的方法，其中所述顺式作用调节元件受与炎症相关的调节蛋白调控。
9.权利要求1的方法，其中所述顺式作用调节元件选自AP-1、CRE、ISRE、NFAT、NFκB和SRE。
10.权利要求1的方法，其中所述免疫细胞选自巨噬细胞、CD4+T细胞以及未成熟树突细胞。
11.一种抑制免疫细胞中信号传递路径表达的方法，包括步骤(a)用重组腺病毒转染所述免疫细胞，其中所述重组腺病毒含有有效地连接于顺式作用调节元件的抑制基因，其中所述顺式作用调节元件属于所述信号传递路径；和(b)诱导所述抑制基因表达。
12.权利要求11的方法，其中所述信号传递路径为NFκB信号传递路径。
13.权利要求11的方法，其中所述抑制基因为IκBsd。
14.权利要求11的方法，其中所述免疫细胞选自巨噬细胞、CD4+T细胞和未成熟树突细胞。
全文摘要
用含有有效地连接于顺式元件的报告基因的载体转染初级细胞培养物。在该细胞培养物中诱导候选调节蛋白的表达，并分析其对顺式元件的影响作用。
文档编号C12N15/861GK1886515SQ200480034585
公开日2006年12月27日 申请日期2004年12月1日 优先权日2003年12月1日
发明者韩昌洙, 李黎 申请人:安万特药物公司