专利名称：戊糖－5－磷酸酯的制备方法
技术领域：
本发明涉及戊糖-5-磷酸酯的制备方法。具体而言，涉及用作合成作为医药品和功能化学品制备原料之一的核苷类起始物质的戊糖-5-磷酸酯的制备方法。
背景技术：
戊糖-5-磷酸酯作为合成核苷类的起始物质是有用的。例如，公开了利用磷酸戊糖变位酶(phosphopentomutase)将2-脱氧核糖-5-磷酸酯变成2-脱氧核糖-1-磷酸酯，然后利用核苷磷酸化酶使其与各种核酸碱基进行糖基化，进而制备各种脱氧核糖核苷类的方法(专利文献1)。该制备方法中使用的2-脱氧核糖-5-磷酸酯是利用DNA的酶水解调制而成，但该调制方法以DNA为原料，价格昂贵，而且分离·精制的步骤多。
另外，还公开了使脱氧核糖激酶与2-脱氧核糖以及作为磷酸供给体的三磷酸腺苷(ATP)作用，生成2-脱氧核糖-5-磷酸酯的方法(非专利文献1)。但是，该方法中使用的ATP价格昂贵。
还公开了利用价格比ATP便宜的多聚磷酸作为磷酸供给体，利用来源于小牛肠道的碱性磷酸酯酶将有机羟基化合物磷酸化的方法(专利文献2)。该文献中记载了使用醇类化合物甘油、糖类化合物D-葡萄糖和D-核糖作为有机羟基化合物的实验。D-葡萄糖和D-核糖等糖类的分子中存在多个羟基，但没有明确将磷酸基团导入存在于该糖类分子内的羟基中的哪一个羟基。
根据反应最适pH的不同，磷酸酯酶分为酸性磷酸酯酶和碱性磷酸酯酶。作为利用酸性磷酸酯酶的磷酸化反应已经公开了核苷以及葡萄糖的磷酸化反应(非专利文献2、非专利文献3)。但是，迄今为止还没有利用酸性磷酸酯酶的戊糖磷酸化反应的示例。
专利文献1WO01/14566专利文献2特开平01-27484非专利文献1Arch.Biochem.Biophys.，164，1974非专利文献2J.Biosci.Bioeng.，92，2001非专利文献3Org.Biomol.Chem.，1，200
发明内容本发明的目的是提供简便制备戊糖-5-磷酸酯的方法。
本发明人等为解决上述课题，进行了深入研究，结果发现通过在酸性磷酸酯酶的存在下，使戊糖与多聚磷酸反应，能选择性地只生成戊糖-5-磷酸酯，从而完成了本发明。
即，本发明涉及在酸性磷酸酯酶的存在下，使戊糖与磷酸供给体反应的戊糖-5-磷酸酯的制备方法。
本发明能利用2-脱氧核糖等戊糖与焦磷酸等磷酸供给体选择性且简便地制备2-脱氧核糖-5-磷酸酯等戊糖-5-磷酸酯。
表示使焦磷酸与焦磷酸钾的混合溶液浓度相对脱氧核糖(以下简称为“dR”)在100mM～700mM之间变化时的反应结果。
dR/焦磷酸和焦磷酸钾的混合溶液＝100/100[2]dR/焦磷酸和焦磷酸钾的混合溶液＝100/300[3]dR/焦磷酸和焦磷酸钾的混合溶液＝100/500[4]dR/焦磷酸和焦磷酸钾的混合溶液＝100/700[图2]表示使反应液中的活性值在0.73U/mL～7.3U/mL(0.5～5.0mg湿菌体/mL)之间变化时的反应结果。
0.73U/mL(0.5mg湿菌体/mL)[2]1.5U/mL(1.0mg湿菌体/mL)[3]3.6U/mL(2.5mg湿菌体/mL) 7.3U/mL(5.0mg湿菌体/mL)具体实施方式
在本说明书中，“戊糖”是指“核糖、木糖、阿拉伯糖、来苏糖、1～3位的羟基被氢原子取代的核糖、1～3位的羟基被氢原子取代的木糖、1～3位的羟基被氢原子取代的阿拉伯糖、1～3位的羟基被氢原子取代的来苏糖、1～3位的羟基被碳原子数为1～5的烷氧基取代的核糖、1～3位的羟基被碳原子数为1～5的烷氧基取代的木糖、1～3位的羟基被碳原子数为1～5的烷氧基取代的阿拉伯糖或1～3位的羟基被碳原子数为1～5的烷氧基取代的来苏糖”。
通过在酸性磷酸酯酶的存在下，使戊糖与磷酸供给体反应，能制备戊糖-5-磷酸酯。
作为本发明中使用的戊糖，例如，可以列举核糖、木糖、阿拉伯糖、来苏糖、2-脱氧核糖、2-脱氧木糖、2-脱氧阿拉伯糖、2-脱氧来苏糖、1-甲氧基核糖、1-甲氧基木糖、1-甲氧基阿拉伯糖、1-甲氧基来苏糖、1-甲氧基-2-脱氧核糖、1-甲氧基-2-脱氧木糖、1-甲氧基-2-脱氧阿拉伯糖以及1-甲氧基-2-脱氧来苏糖等。上述化合物可以为D构型，也可以为L构型。
戊糖中存在手性碳原子。作为本发明中使用的戊糖优选3位或4位的立体构型为(3S、4R)或(3R、4S)的戊糖。
作为本发明中使用的戊糖，较优选核糖、阿拉伯糖、2-过氧核糖以及1-甲氧基-2-脱氧核糖。
作为本发明中使用的磷酸供给体，只要能在酸性磷酸酯酶的存在下向戊糖供给磷酸基团，制备戊糖-5-磷酸酯即可，没有特别限定，例如，可以举出多聚磷酸或其盐。
作为多聚磷酸或其盐，可以举出焦磷酸、三聚磷酸、四聚磷酸、以及上述化合物的钠盐或钾盐等碱金属盐。
上述磷酸供给体可以单独使用，也可以二种或二种以上并用。
在上述磷酸供给体中，优选焦磷酸或焦磷酸的钾盐。
作为本发明中使用的酸性磷酸酯酶，只要能催化将磷酸基团导入戊糖5位碳原子上的反应即可，没有特别限定，可以使用来源于各种生物体的酸性磷酸酯酶。例如，可以举出来源于无花果曲霉(Aspergillusficuum)等霉菌的肌醇六磷酸酶、来源于出芽酵母(Saccharomycescerevisiae)、许旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)等酵母的肌醇六磷酸酶、来源于产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、蟑螂埃希氏菌(Escherichia blattae)、植生克雷伯氏菌(Klebsiella planticola)、摩氏摩根氏菌(Morganella morganii)、中间普雷沃氏菌(Prevotella intermedia)、斯氏普罗威登斯菌(Providencia stuartii)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)、弗氏志贺氏菌(Shigella flexneri)、运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)等细菌的酸性磷酸酯酶、来源于鸡等动物的酸性磷酸酯酶、来源于马铃薯等植物的酸性磷酸酯酶等，上述化合物中有的可以作为市售品得到。其中，优选来源于弗氏志贺氏菌(Shigella flexneri)(志贺氏菌(Shigella)属)、许旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)(许旺酵母(Schwanniomyces)属)、无花果曲霉(Aspergillus ficuum)(曲霉(Aspergillus)属)的酸性磷酸酯酶。
近年来，随着分子生物学和基因工程学的发展，使利用公知的基因工程学的方法制备和获得目的基因变得容易。因此，通过解析上述微生物产生的酸性磷酸酯酶的分子生物学性质或氨基酸序列等，能从该微生物株中获得编码该酸性磷酸酯酶的基因，构建插入了该基因和表达必须的控制区域的基因重组质粒，将其导入任意的宿主，能制成产生酸性磷酸酯酶的基因重组体。
此处所谓的表达必须的控制区域是指启动子(promoter)序列(包括控制转录的操纵子(operator)序列)·核糖体结合序列(SD序列)·转录终止序列等。以细菌为宿主时，作为启动子序列的具体例子，可以举出来源于大肠杆菌的色氨酸操纵子的trp操纵基因、乳糖操纵子的lac操纵基因、来源于λ噬菌体的PL启动子以及PR启动子、来源于枯草芽孢杆菌的葡萄糖酸合成酶启动子、碱性蛋白酶启动子、中性蛋白酶启动子、α-淀粉酶启动子等。另外，还可以利用tac启动子之类被单独改变·设计的序列。作为核糖体结合序列，可以举出来源于大肠杆菌或来源于枯草芽孢杆菌的序列，只要是在大肠杆菌或枯草芽孢杆菌等所希望的宿主内发挥功能的序列即可，没有特别限定。例如，可以利用通过DNA合成制备的在16S核糖体RNA的3’末端区域连接有4个碱基或4个碱基以上互补序列的共有序列(consensus sequence)。另外，如果能利用位于酸性磷酸酯酶上游的SD序列，则优选利用SD序列。转录终止序列未必是必须的，可以利用ρ因子非依赖性序列，例如，脂蛋白终止子(terminator)、trp操纵子终止子等。上述控制区域在重组质粒上的序列顺序优选从5’末端上游开始依次排列启动子序列、核糖结合序列、编码酸性磷酸酯酶的基因、转录终止序列。此处所谓的质粒的具体例子可以利用大肠杆菌中的具有可自主复制区域的pBR322、pUC18、pBluescript II SK(+)、pKK223-3、pSC101、或枯草芽孢杆菌中的具有可自主复制区域的pUB110、pTZ4、pC194、ρ11、φ1、φ105等作为媒介物(vector)。另外，作为能在2种或2种以上宿主内进行自主复制的质粒的例子，可以利用pHV14、TRp7、YEp7和pBS7等作为媒介物。
此处所谓的任意宿主可以列举后述实施例中记载的大肠杆菌(Escherichia coli)为代表例，但并不限定于大肠杆菌，还包括枯草芽孢杆菌(Baccilus subtilis)等芽孢杆菌属菌、酵母或放线菌等其他微生物菌株。
以酵母作为宿主时，作为启动子序列的具体例子可以列举eno-1启动子、半乳糖苷酶启动子、醇氧化酶启动子等。作为质粒的具体例子，可以列举能在酵母内进行自主复制的pESC、pPIC、pAO、pMET、pYES、pTEF、pNMT等，上述质粒也可以在大肠杆菌内进行自主复制。作为宿主的具体例子，可以列举酵母或裂殖酵母菌、甲醇酵母(Pichia)等。
在本发明的制备方法中可以使用来源于具有酸性磷酸酯酶生成能力的微生物及高等生物的细胞、利用编码酸性磷酸酯酶的基因进行形质转化的细胞本身以及上述细胞的破碎物，还可以使用将该细胞、该细胞的破碎物以及该细胞的破碎物经硫酸铵沉淀或柱色谱等处理精制的含有酸性磷酸酯酶活性的馏分赋予载体上形成的固定化物。
上述反应中使用的戊糖与磷酸供给体的摩尔比没有特别限定，通常，在其中一方相对另一方多于1倍摩尔的条件下进行反应。例如，在磷酸供给体相对戊糖为大于1倍摩尔、小于或等于20倍摩尔的条件下进行反应。虽然在相对戊糖存在较多磷酸供给体的条件下进行反应能增加戊糖-5-磷酸酯的生成量，但是，如果相对戊糖存在过多磷酸供给体，则造成磷酸的废弃多，故不优选。所以，优选在磷酸供给体相对戊糖为大于或等于3倍摩尔、小于或等于7倍摩尔的条件下进行反应。
反应液中的戊糖浓度没有特别限定，通常，在0.05～2M的范围内进行反应，优选在0.1～1.0M的范围内进行反应。
反应液中的磷酸供给体的浓度，只要在不影响酸性磷酸酯酶的酶活性的范围内，就没有特别限定，通常，在0.05～2M的范围内进行反应，优选在0.1～1.0M的范围内进行反应。
反应液中的酸性磷酸酯酶的活性值只要是能生成戊糖-5-磷酸酯的量即可，没有特别限定，通常，在1～1000U/mL的范围内进行反应，优选在大于或等于1.5U/mL的范围内进行反应。但是，反应液中的酸性磷酸酯酶的活性值即使下降到4U/mL，戊糖-5-磷酸酯的生成量也不发生变化，如果低于4U/mL，则戊糖-5-磷酸酯酶的生成量也开始下降。所以，较优选反应液中的酸性磷酸酯酶的活性值在大于或等于4U/mL的范围内。
反应温度只要在生成戊糖-5-磷酸酯的温度范围内即可，没有特别限定，通常，在20～40℃的范围内进行反应，优选在30～37℃的范围内进行反应。
反应液的pH只要在生成戊糖-5-磷酸酯的范围内即可，没有特别限定，通常，在pH为3.0～6.0的范围内进行反应，优选在3.5～4.0的范围内进行反应。
酸性磷酸酯酶中存在可以利用镁离子等二价金属离子提高磷酸酯酶活性的酶，所以，可以根据需要使反应液中具有二价金属离子之类多价金属化合物等。
利用上述反应能得到与反应使用的戊糖对应的戊糖-5-磷酸酯。D构型的戊糖能得到D构型的戊糖-5-磷酸酯，L构型的戊糖能得到L构型的戊糖-5-磷酸酯。
本发明人等发现通过使用3位和4位的立体构型为(3S、4R)或(3R、4S)的戊糖能选择性地分别得到对应的3位和4位的立体构型为(3S、4R)或(3R、4S)的戊糖-5-磷酸酯。即，本发明的制备方法作为选择性制备戊糖-5-磷酸酯的方法是有用的。
例如，通过在来源于弗氏志贺氏菌(志贺氏菌属)、许旺酵母(许旺酵母属)或无花果曲霉(曲霉属)的酸性磷酸酯酶的存在下，使核糖、阿拉伯糖、2-脱氧核糖或1-甲氧基-2-脱氧核糖与焦磷酸或焦磷酸的钾盐反应，能分别得到核糖-5-磷酸酯、阿拉伯糖-5-磷酸酯、2-脱氧核糖-5-磷酸酯或1-甲氧基-2-脱氧核糖-5-磷酸酯。
作为本发明的制备方法的一个实施方式，例如，可以列举使戊糖和磷酸供给体存在于调整至所希望的pH的缓冲液中，向其中加入酸性磷酸酯酶使其反应的方法。
上述反应得到的戊糖-5-磷酸酯可以利用使其作为金属盐从反应液中沉淀的方法或柱色谱等公知的分离方法进行分离。
下面，利用实施例详细说明本发明，但本发明并不限定于以下实施例。需要说明的是，利用高效液相色谱(以下简称为“HPLC”)对下面实验中生成的目标化合物进行分析。HPLC分析条件如下所示。
色谱柱Shodex Asahipak NH2P-504E(昭和电工)流动相50mM磷酸二氢钠检测器示差折射计另外，培养得到的菌体的磷酸酯酶活性通过测定从磷酸对硝基苯酯变成对硝基苯酚(ε＝16600M-1cm-1、pH6.0)导致的在410nm处吸光度的增加来求出。磷酸酯酶活性的测定条件如下所示。
在含有100mM的醋酸缓冲液(pH6.0)、10mM的磷酸对硝基苯酯的溶液中，加入实施例1中配制的培养菌体，于37℃使其反应15分钟。加入1N的NaOH停止反应，测定410nm处吸光度的增加。1单位(U)的定义为能在1分钟内游离出1μmol对硝基苯的酶量。
基于公知的来源于弗氏志贺氏菌2a YSH6000的酸性磷酸酯酶序列制成序列编号1和序列编号2所示的2种引物，以含有编码来源于弗氏志贺氏菌2a YSH6000的酸性磷酸酯酶的基因的质粒为模板进行PCR。配制由10mM的KOD-plus缓冲液、1.5μM的顺向和反向引物、1mM的硫酸镁、0.2mM的dNTPs、2U的KOD-plus聚合酶(TOYOBO)、50ng/μL的模板DNA组成的反应溶液。于94℃下保持2分钟后，将94℃下保持30秒、60℃下保持30秒、68℃下保持1分钟的热循环进行30个循环后，最后在68℃下保持10分钟。结果得到约0.75kb的扩增片段。将得到的片段进行PstI/BamHI处理，与pUC19连接。利用制成的质粒形质转化大肠杆菌DH5α株，从而制成磷酸酯酶活性的表达株。
在带有隔板(baffle)的烧瓶中配制LB broth(Difco)，于120℃下灭菌20分钟后，向其中植入配制的磷酸酯酶活性的表达株，在37℃、120rpm的条件下振荡培养。利用离心分离回收菌体，结果从1L培养液中得到湿重为3.37g的菌体。需要说明的是，该菌体的活性值为4930U。
实施例1在含有100mM的醋酸缓冲液(pH3.5)、100mM的焦磷酸和焦磷酸钾的混合溶液(pH3.5)、100mM的D-2-脱氧核糖的溶液中，添加为能使反应液中的活性值达到7.3U/mL(5mg湿菌体/mL)而利用参考例1中得到的培养菌体调制的菌体液，使其在37℃下反应1小时，利用HPLC分析反应液，可知生成了1.5mM的D-2-脱氧核糖-5-磷酸酯。
实施例2在含有100mM的醋酸缓冲液(pH3.5)、100mM的D-2-脱氧核糖的溶液中，添加焦磷酸和焦磷酸钾的混合溶液(pH3.5)，使其浓度为100mM～700mM，添加为能使反应液中的活性值达到7.3U/mL(5mg湿菌体/mL)而利用参考例1中得到的培养菌体调制的菌体液，使其在37℃下反应。利用HPLC分析反应液，结果如图1所示。
实施例3在含有100mM的醋酸缓冲液(pH3.5)、700mM的焦磷酸和焦磷酸钾的混合溶液(pH3.5)、100mM的各种戊糖的溶液中，添加为能使反应液中的活性值达到7.3U/mL(5mg湿菌体/mL)而利用参考例1中得到的培养菌体调制的菌体液，使其在37℃下反应1小时。作为基质的各种戊糖为L-2-脱氧核糖、D-核糖、D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖。利用HPLC分析反应液，可知生成了9.6mM的来源于L-2-脱氧核糖的L-2-脱氧核糖-5-磷酸酯、16.6mM的来源于D-核糖的D-核糖-5-磷酸酯、4.9mM的来源于D-阿拉伯糖的D-阿拉伯糖-5-磷酸酯、2.8mM的来源于L-阿拉伯糖的L-阿拉伯糖-5-磷酸酯。
实施例4在含有100mM的醋酸缓冲液(pH3.5)、100mM的焦磷酸和焦磷酸钾的混合溶液(pH3.5)、100mM的D-2-脱氧核糖的溶液中，添加为能使反应液中的活性值达到0.73～7.3U/mL(0.5～5.0mg湿菌体/mL)而利用参考例1中得到的培养菌体调制的菌体液，使其在37℃下反应1小时。利用HPLC分析反应液，结果如图2所示。
实施例5在2mL含有2M的焦磷酸和焦磷酸钾的混合溶液(pH4.0)、2M的D-2-脱氧核糖的溶液中，加入60μL(150U)来源于许旺酵母IFO1840的肌醇六磷酸酶的调制液，在37℃下使其反应4小时。来源于许旺酵母IFO1840的肌醇六磷酸酶的调制液根据特开平11-206368中记载的方法配制。利用HPLC分析反应液，可知生成了15mM的D-2-脱氧核糖-5-磷酸酯。
实施例6利用盐酸将含有0.33g焦磷酸钾、2.5g 2-脱氧核糖的溶液的pH调至4.5，稀释至5mL。向其中加入25mg(100U)来源于无花果曲霉NRRL3135的肌醇六磷酸酶(SIGMA)，使其在37℃下反应1小时。利用HPLC分析反应液，可知生成了22mM的D-2-脱氧核糖-5-磷酸酯。
实施例7在1.5mL含有2M的焦磷酸和焦磷酸钾的混合溶液(pH4.0)、2M的1-甲氧基-D-2-脱氧核糖的溶液中，添加为能使反应液中的活性值达到3.9U/mL(4mg湿菌体/mL)而利用参考例1中得到的培养菌体调制的菌体液，使其在37℃下反应22小时。另外，除此以外，还同样调制添加了30μL(75U)实施例6中使用的来源于许旺酵母IFO1840的肌醇六磷酸酶的调制液的反应液、添加了7.5mg(20U)实施例7中使用的来源于无花果曲霉NRRL3135的肌醇六磷酸酶的反应液，反应5小时。利用HPLC分析反应液，可知在添加了调制的培养菌体的情况下，生成了300mM的1-甲氧基-D-2-脱氧核糖-5-磷酸酯，在添加了来源于许旺酵母IFO1840的肌醇六磷酸酶的情况下，生成了20mM的1-甲氧基-D-2-脱氧核糖-5-磷酸酯，在添加了来源于无花果曲霉NRRL3135的肌醇六磷酸酶的情况下，生成了30mM的1-甲氧基-D-2-脱氧核糖-5-磷酸酯。
产业上的可利用性本发明作为简便地制备用作合成核苷类的起始物质的戊糖-5-磷酸酯的方法是有用的。
权利要求
1.一种戊糖-5-磷酸酯的制备方法，该方法是在酸性磷酸酯酶的存在下使戊糖和磷酸供给体反应。
2.如权利要求1所述的制备方法，其中，戊糖为(3S、4R)或(3R、4S)戊糖，戊糖-5-磷酸酯为(3S、4R)或(3R、4S)戊糖-5-磷酸酯。
3.如权利要求1所述的制备方法，其中，戊糖是核糖、阿拉伯糖、2-脱氧核糖或1-甲氧基-2-脱氧核糖，戊糖-5-磷酸酯是核糖-5-磷酸酯、阿拉伯糖-5-磷酸酯、2-脱氧核糖-5-磷酸酯或1-甲氧基-2-脱氧核糖-5-磷酸酯。
4.如权利要求1所述的制备方法，其中，磷酸供给体是多聚磷酸或其盐。
5.如权利要求1所述的制备方法，该方法是在存在相对于戊糖为大于1倍摩尔、小于或等于20倍摩尔的磷酸供给体的条件下进行反应。
6.如权利要求1所述的制备方法，该方法是在存在大于或等于1U/mL的酸性磷酸酯酶的条件下进行反应。
7.如权利要求1所述的制备方法，其中，酸性磷酸酯酶是来源于志贺氏菌属、许旺酵母属或曲霉属的酸性磷酸酯酶。
8.如权利要求1所述的制备方法，其中，酸性磷酸酯酶是来源于弗氏志贺氏菌、许旺酵母或无花果曲霉的酸性磷酸酯酶。
全文摘要
通过使核糖、阿拉伯糖、2－脱氧核糖或1－甲氧基－2－脱氧核糖等戊糖与焦磷酸或其碱金属盐等磷酸供给体在酸性磷酸酯酶的存在下进行反应，能制备核糖－5－磷酸酯、阿拉伯糖－5－磷酸酯、2－脱氧核糖－5－磷酸酯或1－甲氧基－2－脱氧核糖－5－磷酸酯等戊糖－5－磷酸酯。
文档编号C12P19/00GK1882694SQ200480034438
公开日2006年12月20日 申请日期2004年11月9日 优先权日2003年11月11日
发明者甲斐庆一郎, 三宅仁基, 及川利洋 申请人:三井化学株式会社