注射用三重霉素中三组分的hplc测定法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种分析方法，具体涉及一种注射用三重霉素中三组分的HPLC测定 法。
【背景技术】
[0002] 注射用三重霉素，又名强化苄星青霉素，为苄星青霉素、普鲁卡因青霉素、青霉素 钠按国际单位比2 :I: 1混合的无菌粉末。苄星青霉素为青霉素的二苄基乙二胺盐，普鲁 卡因青霉素为青霉素的普鲁卡因盐，二者均为青霉素长效品种，抗菌活性成分为青霉素，肌 注后慢慢游离出青霉素，使血浓度维持时间延长，显示长效作用。三者混合使其具有长期， 中期和即时起效的优势，可以维持1-4周血液中的有效浓度。该复方制剂国内未见分析报 道。目前，对注射用三重霉素中苄星青霉素、普鲁卡因青霉素、青霉素钠的检测方法主要是 通过HPLC法分别单独测定，存在测定步骤繁琐，测定时间长的缺陷。
[0003] 有鉴于此，需要发明一种简单、快速的注射用三重霉素中三组分的HPLC测定法。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种注射用三重霉素中三组分的 HPLC测定法，利用相同的液相条件可以同时检测三组分的含量，具备方法简便、准确、稳定 性好的特点。
[0005] 为了实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
[0006] -种注射用三重霉素中三组分的HPLC测定法，其具体包括如下步骤：
[0007] 1)对照品溶液的配制
[0008] 配制含有普鲁卡因，二苄基乙二胺和青霉素工作对照品的对照品溶液；
[0009] 2)供试品溶液的配制
[0010] 配制供试品注射用三重霉素的供试品溶液；
[0011] 3)色谱条件
[0012] 色谱柱：C1S反相色谱柱，流动相：体积比为81 : 19的缓冲盐溶液-乙腈，所述缓 冲盐溶液内含0.21111〇1/1磷酸二氢钾和0.16%的三乙胺，？11值为5.6，流速 ：1.01111/111111，检 测波长：215nm，进样量：10y1 ;
[0013] 4)含量计算方法
[0014] 按外标法以峰面积计算供试品中普鲁卡因、二苄基乙二胺和青霉素的含量。
[0015] 作为本发明进一步的改进，所述步骤1)中对照品溶液的配制方法如下：
[0016] 称取普鲁卡因工作对照品12mg，二苄基乙二胺对照品20mg和青霉素工作品80mg， 置100mL量瓶中，加乙腈IOml振摇使均匀分散后，加甲醇IOml充分振摇使溶解，用磷酸盐 缓冲液稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液，所述磷酸盐缓冲液的配制方法为：取磷酸二氢 钾6. 8g和磷酸氢二钾I. 14g于1000 ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。
[0017] 作为本发明进一步的改进，所述步骤2)中供试品溶液的配制方法如下：
[0018] 称取供试品50mg，置50ml量瓶中，加乙腈IOml振摇使均匀分散后，加甲醇IOml充 分振摇使溶解，立即用磷酸盐缓冲液稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液，所 述磷酸盐缓冲液的配制方法为：取磷酸二氢钾6.Sg和磷酸氢二钾I. 14g于1000 ml容量瓶 中，加水稀释至刻度，摇匀。
[0019] 作为本发明进一步的改进，所述步骤4)计算供试品中普鲁卡因、二苄基乙二胺和 青霉素的含量后，通过以下方法计算苄星青霉素、普鲁卡因青霉素和青霉素钠的效价：
[0020] 按每Img的青霉素相当于1780青霉素单位计算供试品中普鲁卡因青霉素、苄星青 霉素、青霉素钠的效价，每Img含青霉素总效价=青霉素含量X1780,苄星青霉素效价=二 苄基乙二胺含量X4953,普鲁卡因青霉素效价=普鲁卡因含量X2519,青霉素钠效价=青 霉素总效价-苄星青霉素效价-普鲁卡因青霉素效价。
[0021] 作为本发明进一步的改进，所述色谱柱为封尾完全完全的C18色谱柱。
[0022] 作为本发明进一步的改进，所述步骤3)中缓冲盐溶液通过氢氧化钾调pH至5. 6。
[0023] 在本发明中三重霉素的三组分中，由于组分酸碱性差异较大，为了寻找合适的流 动相pH值，发明人进行了大量的工作。普鲁卡因和二苄基乙二胺为有机碱，流动相pH增大， 保留时间延长；青霉素为有机酸，pH增大，保留时间缩短。pH大于6时，二苄基乙二胺出峰 晚，峰拖尾严重；pH小于5,普鲁卡因出峰太快，不易与溶剂峰或杂质峰分离。pH在5~6 时，三者有较合适的保留时间。为减小二苄基乙二胺的拖尾，加入适量的三乙胺。三乙胺浓 度增大，普鲁卡因和二苄基乙二胺保留时间缩短，青霉素保留时间延长。三重霉素的降解物 主要为青霉素的降解物，加入0.3%以上三乙胺，普鲁卡因不易与青霉素降解物峰分离。乙 腈比例在17%~19%调节，筛选pH值及三乙胺浓度，使普鲁卡因和青霉素有合适的保留时 间，并与相邻峰有效分离。二苄基乙二胺对pH值，三乙胺浓度，盐浓度均较敏感，盐浓度增 大，二苄基乙二胺保留时间缩短，而盐浓度对另两者影响较小。通过调节盐的浓度，使二苄 基乙二胺处于合适的峰位，恰与青霉素降解物峰分离完全。
[0024] 与现有技术相比，本发明所取得的有益效果如下：
[0025] 本发明一次检测能同时完成三重霉素的三个组分的含量测定，可以快速的提供检 测报告，为企业生产和销售产品提供有效技术保障，方法操作简单，降低了检测技术人员的 劳动强度，提高了工作效率，本发明方法具备重现性好、灵敏度高、准确性强、便于标准化操 作的优点。
【附图说明】
[0026] 附图1为本发明方法测定三重霉素中三组分含量的典型液相图谱；
[0027] 附图2为热破坏后的图谱；
[0028] 附图3为酸破坏后的图谱；
[0029] 附图4为碱破坏后的图谱；
[0030] 附图5为光破坏后的图谱；
[0031] 附图6为氧化破坏后的图谱；
[0032] 在附图中：1普鲁卡因、2二苄基乙二胺、3.青霉素。
【具体实施方式】
[0033] 以下结合附图对本发明进行进一步详细的叙述。
[0034] 以下实施例中所用仪器与试药如下：
[0035] Waters2695型高效液相色谱仪；Waters2487型紫外检测器。
[0036] 供试品注射用三重霉素（石药集团中诺药业有限公司，规格：苄星青霉素600000 单位，普鲁卡因青霉素300000单位，青霉素300000单位，批号：SP090810,H091005);青 霉素钠工作对照品（石药集团中诺药业有限公司，批号：1〇1118-1，含量：93.5%)，二苄 基乙二胺二乙酸盐工作对照品（重庆市春瑞医药化工有限公司，批号：20110110,含量： 66.3% )，盐酸普鲁卡因工作对照品（重庆市春瑞医药化工有限公司，批号：20110416,含 量：86. 3% );乙腈为色谱纯，三乙胺，磷酸二氢钾为分析纯。
[0037] 实施例1
[0038] 一种注射用三重霉素中三组分的HPLC测定法，其具体包括如下步骤：
[0039] 1)对照品溶液的制备精密称取普鲁卡因工作对照品约12mg，二苄基乙二胺对照 品约20mg和青霉素工作品约80mg，置100mL量瓶中，加乙腈IOml振摇使均匀分散后，加甲 醇IOml充分振摇使溶解，立即用磷酸盐缓冲液稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。
[0040] 2)供试品溶液的制备精密称取供试品约50mg，置50ml量瓶中，加乙腈IOml振摇 使均匀分散后，加甲醇IOml充分振摇使溶解，立即用磷酸盐缓冲液（取磷酸二氢钾6.Sg和 磷酸氢二钾I. 14g于1000 ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀）稀释至刻度，摇匀，滤过，取 续滤液作为供试品溶液；
[0041] 3)色谱条件及测定法
[0042] 色谱柱：依利特SinoChromC18 (250mmX4. 60mm，5ym)，流动相：缓冲盐溶液（内 含0.21111〇1/1磷酸二氢钾和0.16%的三乙胺）（用氢氧化钾调节？11值为5.6)-乙腈 (81 : 19)，流速l.Oml/min，检测波长215nm，进样量10yl。普鲁卡因、二苄基乙二胺和 青霉素峰的理论板数分别为12020,10802,12034 ;相邻两个主峰之间的分离度分别为21. 6 和14. 2 ;连续进样5次，普鲁卡因、二苄基乙二胺和青霉素峰面积的RSD分别为0. 10%、 0? 22%和 0? 09%。
[0043] 4)含量计算方法
[0044] 分别取供试品溶液和对照品溶液各10y1，注入液相色谱仪，记录色谱图，典型图 谱见附图1，按外标法以峰面积计算供试品中普鲁卡因、二苄基乙二胺和青霉素的含量。测 出普鲁卡因、二苄基乙二胺和青霉素的含量后经过以下方法计算苄星青霉素、普鲁卡因青 霉素和青霉素钠的效价：
[0045] 按每Img的青霉素相当于1780青霉素单位，根据各主成分的分子式及分子量，计 算供试品中普鲁卡因青霉素、苄星青霉素、青霉素钠的效价，推导公式如下：每Img含青霉 素总效价=青霉素含量X1780,苄星青霉素效价=二苄基乙二胺含量X4953,普鲁卡因青 霉素效价=普鲁卡因含量X2519,青霉素钠效价=青