专利名称：即开即用型猪精液稀释液的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种即开即用型猪精液稀释液，特别是指采用氟化喹啉诺酮(fluoroquinolones)类抗生素，以增加精液稀释剂在液体化后的抑菌效果、使用品质及保存期限的精液稀释液配方。
背景技术：
传统猪、牛、羊、马等家畜动物在进行人工繁殖时，通常必需先由雄性动物取得精液。以公猪为例，采精时，公猪射精的正常量为150ml至500ml，平均200ml至250ml。在精液中，除精子外，其余部分则为精浆。精浆为运输媒介，含有丰富的有机营养物质，例如柠檬酸(citric acid)、肌醇(inositol)、麦角组织胺基硫、果糖、甘油磷酸化胆碱(glyceryl-phosphorycholine)、山梨聚糖醇(sorbitol)、维生素C(ascorbic acid)及各种氨基酸(amino acid)、胜肽(peptides)、蛋白质、脂质、脂肪酸、生化酵素等。此外，还包含可抑制细菌滋生的免疫球蛋白(immunoglobulins，主要为IgA)、多种内泌素及抗氧化剂(antioxidants)。
在取得精液后，接着初步过滤精液中的粘质成分，并利用适当的精液稀释液(semen extender)稀释精液。所述精液稀释液的主要作用在于(1)、增加精液量，提供更多雌性动物配量使用；(2)、提供精子所需的营养成分，以避免精子发生冷休克(cold shock)，保持精液中的精子活动力；(3)、维持渗透压及调节pH值，缓冲不良物质的危害；(4)、提供抑菌成分，以抑制杂菌滋生，延长精子存活时间；及(5)、方便精液的有效保存与冷冻、运输。
目前市面上已商业化的精液稀释剂商品通常是将成分干制成粉状，直到要使用时才将精液稀释剂的干制粉末利用蒸馏水调配稀释。目前的精液稀释剂大概可分为短效型及长效型。短效型的精液稀释剂在加入蒸馏水后大约可用以保存精液1至3天，例如Beltsville Liquid(BL-1)、Beltsville ThawingSolution(BTS)、Illinois Variable Temperature(IVT)及Kiev等。长效型的精液稀释剂在加入蒸馏水后大约可保存精液5至7天，例如Zorlesco、Modena、M Modena、SCK-7、Bütschwil、MR-A、BW25、Reading、Androhep、V.S.P.、X-cell、Vital、Acromax等。
如上所述，精液稀释剂通常添加有抑菌成分，所述抑菌成分通常选自抗生素，其与精液的变质及保存期限有极大相关性。早期使用的抗生素有青霉素(penicillin)+链霉素(streptomycin)，目前使用的抗生素则有健他霉素(gentamicin)、双去氧卡那霉素(dibekacin)、艾米康丝菌素(amikacin)、林可霉素(lincomycin)、新霉素(neomycin)、观霉素(spectinomycin)等。上述最常使用的为氨基配糖体类的抗生素(健他霉素、双去氧卡那霉素、艾米康丝菌素)，其有效抑制常见的钩端螺旋体(Leptospira)及霉浆菌(mycoplasma)等采精过程容易出现的有害菌。此外，也有使用新的抗生素的，例如头孢(ceftiofur)、安普霉素(apramycin)等。目前市场上常见的公猪稀释液及其使用的抗生素有下列数种[1]中国台湾地区长生精(Semengra，短效型)浓度1g/L的链霉素；速保精(Sperm-up，短效型)浓度160mg/L的健他霉素；康氏稀释液(短效型)磺胺剂(sulfonamide)；[2]其他Androhep(长效型)浓度400mg/L的健他霉素；MerckIII(中长效型)浓度1g/L的新霉素；BTS(短效型)浓度250mg/L的健他霉素；XCellTM(长效型)健他霉素；ModenTM(长效型)健他霉素或林可霉素+观霉素。
虽然，上述稀释液广泛使用于猪的人工授精及育种领域，然而这些家畜精液的稀释液在实际使用上仍存在部分操作问题，例如[1]、市售精液稀释剂通常将精液稀释剂的成分干制成粉状，直到要使用时才将精液稀释剂的干制粉末利用蒸馏水调配稀释，无法即开即用。此外在现场调配精液稀释剂时，可能增加误差及污染机会。也就是粉剂的精液稀释剂存在操作便利性及使用品质的问题。[2]、精液在采精过程中可能受到非致病性及致病性细菌的污染。虽然可在精液稀释液添加上述抗生素，以抑制这些细菌，但是一般抗生素在液态如无抗氧化剂的添加时，效价(力价)将随时间延长而下降，抑菌能力也降低。基于上述因素，确实有必要进一步改良上述精液的稀释液。
发明内容
有鉴于上述的缺点，本发明采用即开即用型液态稀释液，同时解决一般常用抗生素在液态保存时有变质及力价严重下降的状况的问题。
本发明的主要目的是提供一种即开即用型精液稀释液，采用氟化喹啉诺酮(fluoroquinolones)类抗生素，以避免精液稀释剂在液体化后抗生素变质及力价下降的问题，使本发明具有即开即用的特性并可延长保存期限、确保使用品质、保存抑菌效果及操作便利性的功效。
根据本发明的即开即用型精液稀释液，其包含精液稀释剂成分，其含有一种以上的营养物质；及氟化喹啉诺酮(fluoroquinolones)类抗生素成分。
本发明的即开即用型精液稀释液，可应用于猪等家畜动物精液的稀释与保存，由于其中所含的精液稀释剂成分含有一种以上营养物质，可以提供精子能量来源、调节酸碱值、维持渗透压及精子膜安定性。所述氟化喹啉诺酮类抗生素成分具有高安定性及耐贮存性，在液体化后仍可长时间保持抑菌能力及不变质，一旦开封使用时，可有效提供精液抑菌能力，达到稀释及保存精子的作用，用以使所述精液稀释剂成分在液体化后仍可长时间保持抑菌效果及使用品质，进而延长精液稀释剂成分在液体化后的有效保存期限。
综上所述，本发明的精液稀释液是利用氟化喹啉诺酮(fluoroquinolones)类的抗生素具有广效性、强效性的效果，且其液态安定性很好，而使精液稀释剂的成分在调配成液体化后，也能维持六个月以上的有效保存期限及良好使用品质。这样，本发明确实具有即开即用的特性，并能相对增加操作便利性、准确性及抑菌效果。
具体实施例方式
为了让本发明的上述及其它目的、特征、优点能更明显易懂，下文将列举本发明的优选实施例作详细说明。
本发明的猪精液稀释液主要是将氟化喹啉诺酮(fluoroquinolones)类的抗生素，应用在一般常见的猪精液稀释配方成分(但不再包含原配方使用的抗生素)中，例如Kiev配方，并以液态方式长期保存。本发明使用的精液稀释剂仍然是可以包含一种以上的营养物质，其至少能用以提供精子能量来源、调节酸碱值、维持渗透压及精子膜安定性。本发明使用的氟化喹啉诺酮类抗生素则用以使上述精液稀释剂在液体化后，仍可长时间保持抑菌效果及良好品质，并且可维持六个月以上的有效保存期限，供开封后可立即使用。换而言之，各种干制粉末状的传统的精液稀释剂将能改成液体化包装进行贮存、贩售、运送及使用。这样，本发明确实能在不影响稀释液效果及品质前提下，达到消费者使用便利及减少操作误差及污染机会的效果。
本发明中所述的氟化喹啉诺酮(fluoroquinolones)类的抗生素具有较高的分子安定性、广泛的抗菌范围及优异的抗菌效果，其可有效抑制格兰氏阳性菌、格兰氏阴性菌及霉浆菌等家畜身上常见的非致病性及致病性细菌。本发明的氟化喹啉诺酮(fluoroquinolones)类抗生素可选自环丙沙星(ciprofloxacin)、丹奴氟沙星(danofloxacin)、诺氟沙星(norfloxacin)、恩诺沙星(enrofloxacin)、氧氟沙星(ofloxacin)、奥比沙星(orbifloxacin)、马波沙星(marbofloxacin)、氟甲喹(flumequine)、欧索林酸(oxolinic acid)、甲磺酸培氟沙星(difloxacin)、培氟沙星(pefloxacin)、依诺沙星(enoxacin)所组成的族群中的至少一种抗生素，它们的分子式如下 环丙沙星(ciprofloxacin) 诺氟沙星(norfloxacin) 丹奴氟沙星(danofloxacin)恩诺沙星(enrofloxacin) 氧氟沙星(ofloxacin) 奥比沙星(orbifloxacin) 马波沙星(marbofloxacin) 氟甲喹(flumequine)
欧索林酸(oxolinic acid) 甲磺酸培氟沙星(difloxacin) 培氟沙星(pefloxacin) 依诺沙星(enoxacin)在本发明的优选实施例中，试验组是采用环丙沙星(ciprofloxacin)搭配目前本领域中常见使用的Kiev精液稀释剂配方。所述Kiev精液稀释剂的液体调配如下先以450ml的蒸馏水溶解30克的葡萄糖(dextrose monohydrate)，再溶解1.85克的柠檬酸钠(sodium citrate·2H2O)、1.85克的EDTA钠盐(EDTA·2Na·2H2O)、0.6克的重碳酸钠(sodium bicarbonate)，以蒸馏水溶解补足至总量500ml，即得到Kiev精液稀释液。本实施例中，环丙沙星(ciprofloxacin)加入Kiev精液稀释液的试验组添加量为10.0mg/500ml、50.0mg/500ml、100.0mg/500ml(即20.0mg/L、100.0mg/L、200.0mg/L)。
在本发明的优选实施例中，所使用的对照组为常见的MIII(MINITB，Merck)、长生精(Sperm-up)及ModenaTM等商业干制粉末配方的水溶液，其成分类似Kiev精液稀释液配方，但另外使用不同抗生素或抗氧化剂(如背景技术所述)，使用时可利用蒸馏水溶解稀释成1000ml即成对照稀释液。同时，本发明还以多种传统抗生素加入Kiev精液稀释液，例如青霉素+健他霉素、青霉素+链霉素、新霉素、健他霉素、安普霉素等，其同样用以做为对照稀释液。
在本发明的优选实施例中，用于测试的对象为杜格克、蓝瑞斯品种的公猪的精液，其是以假母台驾乘方式诱导公猪射精，以便采集富含精子的精液部分，为求均一性，将各公猪采得的精液相互混合成混合精液(heterospermicsemen)，以供进行试验。
在精液以1∶4的稀释比例加入试验组及对照组的精液稀释液中后，贮存于16±1℃恒温箱中，精液采集日当天为第0天。每天观察精子活动力、精子存活率、稀释液外观颜色变化及精子头巾完整性(acrosome-intactspermatozoa)等条件各一次，连续观察四至六天，记录于表一及表二中。
表一、环丙沙星抗生素(溶于500ml的Kiev稀释液)及市售MerckIII稀释液对精子活动力、存活率及精子头巾完整性的影响。(标准差p＜0.05)
表二、各种传统抗生素(溶于500ml的Kiev稀释液)及市售稀释液对精子活动力的影响。(标准差p＜0.05)
由表一可知，本发明使用的环丙沙星的各试验组除了第0天外，在第2、4及6天的精子活动力、存活率及头巾完整性(与授精成功率有相关性)普遍优于市售的MerckIII稀释液配方。再者，高、中、低浓度的环丙沙星实验组表现并无显著差异。由上述结果可知，环丙沙星具有较广的安全范围，添加10.0mg/500ml至100.0mg/500ml(即10.0mg/L至200.0mg/L)的环丙沙星的Kiev稀释液对精液具有较佳的保存效果。
由表二可知，添加传统抗生素新霉素、健他霉素或安普霉素的对照组在室温下保存1个月，或青霉素+链霉素的对照组在室温下保存3个月即发生颜色变化，且这四种对照组的精子活动力在1、3、4天之后多数表现低于市售的MerckIII稀释液配方。再者，由青霉素+链霉素或健他霉素的对照组可知，两者大约只可保存精液2-3天不变质，主要是由于抗生素本身的力价将迅速下降。
将本发明的产品进行田间测试(farm)，试验于热季(5-7月)进行，公猪精液品质与母猪繁殖性能均遭受严厉挑战。实验结果请参见表三，由表三中可以得知，使用试验组与各对照组(MIII、Semengra、Kang稀释液(Kang’sextender)，见注2)的稀释液稀释公猪精液，并用于母猪的人工授精，结果显示受孕率及分娩率均无显著差异(P＞0.05)。总产仔猪数分析结果方面，除了猪场A稍低外(10.3±0.3及10.5±0.4)，其余试验组均高于对照组，其中猪场E有显著(P＜0.05)差异(10.3±0.2及9.6±0.2)。
结果显示，试验处理组采用的抗生素100mg/500ml环丙沙星不仅不会影响精液品质，且对精子活动力、存活力、头巾完整性都没有不利的影响，只有贮存于18℃时有结晶析出。而50mg/ml、10mg/500ml的环丙沙星均无结晶析出，且抗生素力价在30℃、6个月的条件下分别为95.61％及91.32％，仍能维持稳定的力价。利用50mg/500ml的环丙沙星进行测试，由表四结果可以得知，处理组与对照组在母猪繁殖性能上均无差异，显示Kiev配方添加50mg/500ml环丙沙星同样可获得良好的表现。
表三、Kiev稀释液中添加100mg/500ml环丙沙星对母猪繁殖性能的影响1
注1在Kiev稀释液中添加100mg/500ml的环丙沙星。
注2对照组田间试验A、E使用MIII稀释液；田间试验B、C使用Semengra稀释液；田间试验D使用Kang稀释液。
±SD平均值±标准差。
注a、b在同一列内不具有上标的具体差距(p＜0.05)。
表四、Kiev稀释液中添加50mg/500ml环丙沙星对母猪繁殖性能的影响1
注1在Kiev稀释液中添加50mg/500ml的环丙沙星。
注2对照组田间试验A、B使用MIII稀释液。
±SD平均值±标准差。
上述本发明的环丙沙星稀释液经贮存七个月后，以同样方式进行精子实验室保存测试及进行田间测试，均与新鲜未经贮存的稀释液结果相同。显然本发明选用的抗生素在液态具有相当稳定性，且可有效保存至少七个月。
综上所述，与添加各种传统抗生素的稀释液仅能以干粉状态或短时间的液态保存而无法具有长期液体化耐贮性的特性相比较，本发明通过采用氟化喹啉诺酮(fluoroquinolones)类的广效性、安定性抗生素，确实能使精液稀释剂(如Kiev稀释液)的成分在调配成液体化后，也能维持6个月以上的有效保存期限及良好使用品质。因此，本发明确实能相对增加操作便利性、准确性并且达到抑菌效果。
再者，本发明的优选实施例中的环丙沙星(ciprofloxacin)也可置换成其它氟化喹啉诺酮(fluoroquinolones)类抗生素成员，例如可以选自丹奴氟沙星(danofloxacin)、诺氟沙星(norfloxacin)、氧氟沙星(ofloxacin)、奥比沙星(orbifloxacin)、马波沙星(marbofloxacin)、氟甲喹(flumequine)、欧索林酸(oxolinic acid)、甲磺酸培氟沙星(difloxacin)、培氟沙星(pefloxacin)、依诺沙星(enoxacin)所组成的族群中的至少一种抗生素，这样同样能使精液稀释剂(如Kiev稀释液)的成分在调配成液体化后，也能维持6个月以上的有效保存期限及良好使用品质。
权利要求
1.一种即开即用型猪精液稀释液，其包含精液稀释剂成分，其含有一种以上的营养物质；及氟化喹啉诺酮类抗生素成分。
2.依据权利要求1所述的即开即用型猪精液稀释液，其中所述氟化喹啉诺酮类抗生素成分为环丙沙星。
3.依据权利要求2所述的即开即用型猪精液稀释液，其中环丙沙星加入精液稀释液中的添加量为20.0mg/L至200.0mg/L。
4.依据权利要求2或3所述的即开即用型猪精液稀释液，其中环丙沙星加入精液稀释液中的添加量为100.0mg/L。
5.依据权利要求1所述的即开即用型猪精液稀释液，其中所述氟化喹啉诺酮类抗生素成分为丹奴氟沙星。
6.依据权利要求1所述的即开即用型猪精液稀释液，其中所述氟化喹啉诺酮类抗生素成分为恩诺沙星。
7.依据权利要求1所述的即开即用型猪精液稀释液，其中所述氟化喹啉诺酮类抗生素成分为诺氟沙星。
8.依据权利要求1所述的即开即用型猪精液稀释液，其中所述氟化喹啉诺酮类抗生素成分为氧氟沙星。
9.依据权利要求1所述的即开即用型猪精液稀释液，其中所述氟化喹啉诺酮类抗生素成分为奥比沙星。
10.依据权利要求1所述的即开即用型猪精液稀释液，其中所述氟化喹啉诺酮类抗生素成分为马波沙星。
11.依据权利要求1所述的即开即用型猪精液稀释液，其中所述氟化喹啉诺酮类抗生素成分为氟甲喹。
12.依据权利要求1所述的即开即用型猪精液稀释液，其中所述氟化喹啉诺酮类抗生素成分为欧索林酸。
13.依据权利要求1所述的即开即用型猪精液稀释液，其中所述氟化喹啉诺酮类抗生素成分为甲磺酸培氟沙星。
14.依据权利要求1所述的即开即用型猪精液稀释液，其中所述氟化喹啉诺酮类抗生素成分为培氟沙星。
15.依据权利要求1所述的即开即用型猪精液稀释液，其中所述氟化喹啉诺酮类抗生素成分为依诺沙星。
16.依据权利要求1所述的即开即用型猪精液稀释液，其中所述精液稀释剂成分含有葡萄糖。
17.依据权利要求1所述的即开即用型猪精液稀释液，其中所述精液稀释剂成分含有柠檬酸钠。
18.依据权利要求1所述的即开即用型猪精液稀释液，其中所述精液稀释剂成分含有EDTA钠盐。
19.依据权利要求1所述的即开即用型猪精液稀释液，其中所述精液稀释剂成分含有重碳酸钠。
全文摘要
一种即开即用型猪精液稀释液，其包含一精液稀释剂成分及一氟化喹啉诺酮(fluoroquinolones)类抗生素成分。所述精液稀释剂成分含有一种以上的营养物质，可用于提供精子能量来源、调节酸碱值、维持渗透压及精子膜安定性。所述氟化喹啉诺酮类抗生素成分具有高安定性及耐贮存性，其用以使所述精液稀释剂成分在液体化后仍可长时间保持抑菌效果及使用品质，进而延长精液稀释剂成分在液体化后的有效保存期限。
文档编号C12N5/06GK1814749SQ20051000737
公开日2006年8月9日 申请日期2005年2月4日 优先权日2005年2月4日
发明者谢来安, 吴明勋 申请人:谢来安