专利名称：利用caps标记鉴定强雌性黄瓜品种满田705的方法
技术领域：
本发明涉及一种植物分子标记技术，确切地说是一种利用CAPS标记鉴定强雌性黄瓜品种满田705的方法。
背景技术：
黄瓜(Cucumis sativus L.)是重要的蔬菜作物，其性别表现复杂多样，主要有雌雄同株异花(Monoecious)、全雌株(Gynoecious)、全雄株(Androdiecious)、两性株(Hermaphroditic)、雄花两性花同株(Andromonoecious)、雄花雌花及两性花同株(Trimonoecious)等不同的性别表现类型。在生产上黄瓜雌花节位的多少和高低是影响产量的主要因素，黄瓜的雌性系往往表现出丰产、早熟、瓜密、采瓜期集中等优点；此外，据统计目前我国生产上80％以上种植的黄瓜品种为杂种一代，而利用雌性系制备杂种一代，具有无需人工除雄和授粉、节约劳力、降低制种成本、杂种纯度高等特点。但在生产实践中，黄瓜的不同性别类型种子外形相像，肉眼难以分辨，通常需要到植株生长的后期——开花期，方能从花的形态上对不同性别类型的黄瓜品种进行区别和鉴定。而在黄瓜育种过程和种子经营销售过程中，存在机械性混杂和不法商人的故意掺假。不同性别类型的黄瓜品种，其种性差异很大，适宜种植的时间和地点都有很大差异。错卖和错买不同性别类型的黄瓜品种会给农民造成很大的经济损失。
因此，在生产实践中，有必要寻找快速精确鉴定不同性别、尤其是雌性系黄瓜品种的方法。由于黄瓜的遗传背景十分狭窄，品种间的遗传多态性远远低于其它作物，一般的分子标记，如RFLP、RAPD、SSR、AFLP等在黄瓜的品种间所能揭示的多态性十分有限(Pan Jun-song，Wang Gang，Li Xiao-zun，He Huan-le，Wu Ai-zhong，Cai Run.Construction of agenetic map with SRAP markers and localization of the gene responsible for thefirst-flower-node trait in cucumber(Cucumis sativus L.).Progress in Natural Science，2005，15(5)407～413)。而SNP(singlenucleotide polymorphism)标记以及根据SNP标记发展出的CAPS标记(cleaved amplified polymorphic sequence)技术能够获得其它分子标记技术不能显示的更加丰富的多态性(Rafalski A.Applications of single nucleotide polymorphisms in cropgenetics.Curr Opin Plant Biol，2002，5(2)94～100)。
发明内容
针对现有技术中存在的不足之处，本发明提供一种能快速、准确鉴定是否为强雌性黄瓜品种满田705的分子标记方法，以及该分子标记方法所使用的引物一种人工设计合成的核苷酸分子。
本发明为达到以上目的，是通过这样的技术方案来实现的提供一种人工设计合成的核苷酸分子，该核苷酸分子是具有下列碱基组成的特定序列正向5′-CACTCGGAACGGTTTACGAT-3′反向5′-AGCCCCTTAAGTTTCCCAAA-3′。
本发明还提供了鉴定强雌性黄瓜品种满田705的分子标记方法，包括以下步骤1)、强雌性黄瓜品种满田705基因组DNA的提取；2)、以权利要求1所述的核苷酸分子为引物(P-ACS2)，对上述基因组DNA进行PCR扩增，扩增出长度为1188bp的ACC合酶基因(CS-ACS2)；3)、对PCR扩增产物经过Xho I酶切后电泳，得到CAPS标记；在所述CAPS标记中，引物对强雌性黄瓜品种满田705有335bp和853bp 2条谱带。
作为本发明的鉴定强雌性黄瓜品种满田705的分子标记方法的一种改进，步骤3)中XhoI酶的酶切位点为强雌性黄瓜品种满田705克隆的基因序列第335bp处。
作为本发明的鉴定强雌性黄瓜品种满田705的分子标记方法的进一步改进，步骤2)的PCR扩增反应中a、反应液的反应体积以100μL为参考，所用物品的组成及含量为10mmol/L的dNTP混合物 0.2μL0.1μmol/L的PCR引物 2μL高保真PCR聚合酶 5U基因组DNA0.2μg10倍的反应缓冲液 10μL无离子水 加到100μL；b、PCR扩增反应在DNA扩增仪上进行，反应条件为94℃预变性5min后，然后按照94℃ 45sec、55℃ 45sec、72℃ 90sec的设置进行30个循环；循环结束后，在72℃下延伸10min，随后于4℃保存备用；
作为本发明的鉴定强雌性黄瓜品种满田705的分子标记方法的进一步改进，步骤3)对PCR扩增产物经过Xho I酶切，酶切后的PCR扩增产物在1.2％的琼脂糖凝胶上电泳1.5h(5V/cm)，溴化乙锭(EtBr)染色，用凝胶成像系统观察并拍照记录。
本发明选择我国生产上应用的8个不同性别类型(雌雄同株、强雌性和全雌性)品种，依据ACC合酶基因保守序列设计引物，从8个不同性别类型黄瓜品种基因组DNA克隆ACC合酶基因，并进行序列的生物信息学分析，首先获得了SNP(single nucleotidepolymorphism)标记，进一步根据获得的SNPs多态性成功地发展了一个CAPS(cleavedamplified polymorphic sequence)标记C-MT700。该标记能将从国外引进的强雌性优良品种满田705(简称为MT705，下同)与其它性别类型品种相区别，从而实现在分子水平上快速、精确鉴定黄瓜优良品种MT705之目的。
图1是引物P-ACS2对不同性别类型黄瓜品种PCR扩增结果M-100bp ladderplus DNA分子量标记，1-津春4号，2-早丰1号，3-中农8号，4-秋雌1号，5-MT705，6-MT700，7-中农5号，8-中农203号；图2是不同性别类型黄瓜品种PCR扩增产物的阳性克隆质粒DNA经过EcoR I和SalI双酶切鉴定图谱M-1Kb ladder DNA分子量标记，1-津春4号，2-早丰1号，3-中农8号，4-秋雌1号，5-MT705，6-MT700，7-中农5号，8-中农203号；图3是黄瓜强雌性品种中MT705中的CAPS标记C-MT705M-1Kb ladderDNA分子量标记，1-津春4号，2-早丰1号，3-中农8号，4-秋雌1号，5-MT705，6-MT700，7-中农5号，8-中农203号；图4是利用CAPS标记C-MT705对黄瓜强雌性品种MT705进行鉴定结果M-1Kb ladder DNA分子量标记，1-津春4号，2-津春5号，3-MT705，4-津优1号，5-中农5号，6-津研4号，7-早丰1号，8-中农203号，9-中农8号10-秋雌1号，11-豫黄瓜2号，12-MT700，13-津优4号。
具体实施例方式
本发明的具体发明内容如下1、材料和方法1.1实验材料
实验所用的黄瓜品种及性别类型见表1。
表1 黄瓜品种及性别类型
1.2DNA的提取黄瓜基因组DNA的提取具体步骤如下①供试种子在26℃的培养室萌发生长两周，取黄瓜幼苗剪碎后放入研钵内，加液氮研磨成细粉，转移到50mL的离心管中，加入事先预热至60℃的抽提液20mL(100mmol/L Tris-HCl，20mmol/L EDTA，500mmol/L NaCl，1.5％SDS)。②将50mL的离心管来回颠倒数次，60℃水浴1h，期间振荡几次，随后在37℃振荡(60r/min)20min。③加入20mL氯仿∶乙醇∶异戊醇(80∶16∶4，v/v)，轻轻摇匀，4℃、11000r/min离心10min；取上层液相再加入20mL氯仿∶乙醇∶异戊醇(80∶16∶4，v/v)，轻轻摇匀，4℃、11000r/min离心10min。④取上层液相，加入等体积的异丙醇沉淀，4℃、11000r/min离心5min。⑤弃上清液，沉淀用70％的乙醇清洗2次，室温下干燥后溶于双蒸馏水中备用。
1.3PCR扩增根据ACC合酶基因家族序列保守序列，设计1对引物P-ACS25′-CACTCGGAACGGTTTACGAT-3′和5′-AGCCCCTTAAGTTTCCCAAA-3′，引物由上海Sangon公司合成。
PCR扩增反应的反应液体积以100μL为参考，各种物品的用量分别为10mmol/L的dNTP混合物(美国Promega公司产品)0.2μL
0.1μmol/L的PCR引物 2μL高保真PCR聚合酶(美国Stratagene公司产品) 5U基因组DNA 0.2μg10倍的反应缓冲液10μL无离子水加到100μL。
上述物品混合、高速离心若干秒种后，制成反应液，用美国PE9600型DNA扩增仪进行扩增反应。PCR反应程序为94℃ 5min变性后，按94℃ 45sec、55℃ 45sec、72℃ 90sec的设置进行30个循环，反应结束后在72℃下延伸10min，随后于4℃保存备用。
取上述反应液10μL与2μL的6倍的载样缓冲液混合在1.2％的琼脂糖凝胶上电泳1.5h(5V/cm)，溴化乙锭(EtBr)染色，用美国Bio/Rad凝胶成像系统观察并拍照记录。
1.4PCR产物的克隆和测序PCR扩增产物经过琼脂糖凝胶电泳后，用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒(上海Sangon公司产品)提取和纯化。纯化后的DNA连接到测序载体pMD18-T(日本TaKaRa公司产品)。采用冻融法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，将转化后的菌液在含50mg/LAmp和X-gal及IPTG的LB筛选平板上筛选阳性克隆。用无菌牙签挑取白色单菌落接种于含50mg/L Amp的LB液体培养基中繁殖，碱裂解法提取质粒，质粒用EcoR I和Sal I双酶切电泳鉴定。阳性克隆用UNIQ-10柱式质粒抽提试剂盒(上海Sangon公司产品)提取质粒DNA后送交上海华诺生物技术有限公司，用ABI377型DNA测序仪测定序列。首先利用M13正反向通用引物测定克隆的序列；为了确保测定序列的正确，根据测定的序列再设计引物5′-AGTTTCTAATCCTGGTGATG-3′对克隆的序列进行验证测定，最后重叠拼接成完整序列。
1.5SNP分析和CAPS标记的获得与国际核酸数据库联网，对测定的序列进行Blastn和Blastx分析；利用ORFinder软件分析测定序列的开放阅读框(ORF)；利用ClustalW软件对测定的DNA序列和DNA编码的氨基酸序列进行分析，获得SNP标记；利用DNAStar软件分析DNA序列含有的限制性核酸内切酶位点，根据分析结果选用相关的内切酶对PCR产物进行酶切和电泳分析，获得CAPS标记。
2结果与分析2.1ACC合酶基因的克隆和序列测定引物P-ACS2对8个不同性别类型黄瓜品种基因组DNA进行PCR扩增，均能扩增出非常清晰的单一条带，并且8个条带大小相同，经3次重复，结果稳定一致(见图1)。
将PCR产物纯化并连接到测序载体pMD18-T上，经过蓝白斑筛选获得了白色单菌落克隆，提取单克隆质粒DNA，经过EcoR I和Sal I双酶切鉴定为阳性克隆(见图2)。
经过序列测定，8个PCR产物长度均为1188bp；并且，PCR扩增所用的引物全部在两端被正确测出。其中，黄瓜强雌性品种MT705CS-ACS2基因序列见序列表SEQ ID NO1。
2.2ACC合酶基因序列的SNP标记和特性分析对测定的8条序列进行Blastn、Blasntx以及ORFinder分析，结果表明本研究克隆的基因为CS-ACS2。克隆的基因第1186bp-270bp区段编码274个氨基酸，其中第763bp-669bp是95bp的内含子，内含子的两端序列符合典型的“GT-AG”规则。
通过对克隆的DNA序列进行ClustalW分析发现，从3个雌雄同株性别类型品种克隆的序列全部相同；而与雌雄同株性别类型相比，5个强雌性和全雌性品种共存在8个SNPs标记(表2)。8个SNPs标记为4个A←→G和4个T←→C之间的转换。在8个SNPs中，第719bp处的1个SNP位于内含子区域，其余7个SNPs均在外显子区域。在7个位于外显子区域的SNPs中，第104bp、147bp和213bp处为3个非编码区的SNPs，第329bp、335bp、342bp和532bp处为4个编码SNPs(coding SNPs，cSNPs)(表2)。
表2 不同性别类型黄瓜品种CS-ACS2基因的SNP标记
i内含子区域；c外显子编码区；nc外显子非编码区。
2.3ACC合酶基因的CAPS标记利用DNAStar软件对测定的DNA序列进行限制性核酸内切酶位点的分析，结果表明从强雌性系品种MT705克隆的基因序列第335bp处有Xho I酶切位点。将引物P-ACS2对上述8个不同性别类型品种的DNA进行扩增所得的PCR产物，经过Xho I酶切后电泳。
该酶切反应的反应液体积以50μL为参考，各种物品的用量分别为上述扩增的PCR产物20μLXho I酶 10U10倍的反应缓冲液 5μL无离子水 加到50μL。
将上述物品混合、高速离心若干秒种后，制成反应液在37℃水浴反应1.5h。取反应液20μL与4μL的6倍的载样缓冲液混合，在1.2％的琼脂糖凝胶上电泳1.5h(5V/cm)，溴化乙锭(EtBr)染色，用美国Bio/Rad凝胶成像系统观察并拍照记录。其中MT705得到长度为335bp和853bp的2条谱带，其它品种均为长度为1188bp的1条谱带，即强雌性系品种MT705具有1个CAPS标记(该标记命名为C-MT705)(见图3)。此外，在8条DNA序列中，第701bp和833bp处分别都有EcoR I和Sal I酶切位点，这与EcoR I和Sal I双酶切鉴定阳性克隆出现4条谱带相吻合(见图2)。
由于黄瓜的遗传背景十分狭窄，品种间的遗传多态性远远低于其它作物，一般的分子标记在黄瓜的品种间所能揭示的多态性十分有限。SNP标记和由SNP标记发展的CAPS技术能够获得其它分子标记技术不能显示的更加丰富的多态性。本发明根据获得的SNPs多态性成功地发展了一个CAPS标记C-MT700。该标记能将从国外引进的强雌性优良品种MT705与其它性别类型品种相区别，从而实现在分子水平上快速、精确鉴定黄瓜优良品种MT705的目的。
为了证明本发明的分子标记方法能精确鉴定强雌性黄瓜品种满田705，进行了如下实验从8个种子公司购买13份不同性别类型的黄瓜种子，见表3。事先不知道每份品种的名称，从每份种子中随机取出若干粒种子，水培萌发提取基因组DNA，利用引物P-ACS2对13份样品的基因组DNA进行扩增，扩增的PCR产物经过Xho I酶切后电泳(见图4)。根据电泳结果，证明编号3的样品是强雌性品种MT705，与实际结果完全一致。
表3 利用CAPS标记C-MT705对不同性别类型黄瓜品种样品的鉴定
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的一个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
序列表SEQ ID NO11 agccccttaa gtttcccaaa ttattgggaa tcaaaaaagg ccataactct atatagtgaa61 atacacttat ccataaccct aacagtgtca aaacaacaac ctcacgagat gatcactttg121 gaaaaaaccc acgactcaca tttgagggtt tttgcttttt gattagttac gccttaagaa181 cttgttaaaa caaacttttg tcaaacaatg gaaattttca tctgatcagg ttgccagaat241 atgactgatt gacggtcgtc ttgtgtttaa gttgttgcac gaagcatagg ggattgaggc301 aacggtgagt gtggtgacat gatgtcttcg agtcctcgag atgacaatcg aagttcgagg361 ctgctttgac gccagcagaa tttttgtttc ttgaccttag ttgttacctc cttgttttga421 agcacgaagt ttctaatcct ggtgatggaa atgtccattg tattgtcatc catatttgca481 aaacaaaccc taaaccatcc tggttctgag caatggaatg aagaacctgg tgaaacattt541 agtttaactt cattgataat cactttccat aatgccattt ctgcttccaa tgtcttctct601 ttcaaaagat gacgcaaatc catccataaa aataatcctc cacttccttt caaatatcca661 attccaacct gcacatcatg aacaaaaaac ttagcatttt gaattcggta tagtgtaaca721 cctttgcatc taaatataaa tttatcacaa cccattaact aacctgagca agcccttttg781 tgaagtttcg atgacgcgca gcgagttttt cagcactccc agcaagaaag ttgtcgacaa841 acacatcatc caacaacatc gatgcaatca aatattgagt ttgcgaggag acgaggccaa901 agcttgacat cttacgagcg catgcaacaa cagcgtcgtt ataagagtag ataataccga961 cacgaaatcc agggaatccc atgtctttgg ataggctata aacgacatgg acaagatttc1021 tatcgcattc aatgtcactg ttgtcgatca cttcagagat actaatgaaa ccgggctctg1081 caaagacagt ggcagcgtag atttcgtcgc acactaagtg gatattcttt tcgttgataa1141 acgatacagc agtttcaagt gtttgtctat cgtaaaccgt tccgagtg
权利要求
1.一种人工设计合成的核苷酸分子，其特征是具有下列碱基组成的特定序列正向5′-CACTCGGAACGGTTTACGAT-3′反向5′-AGCCCCTTAAGTTTCCCAAA-3′。
2.一种鉴定强雌性黄瓜品种满田705的分子标记方法，其特征是包括以下步骤1)、基因组DNA的提取；2)、以权利要求1所述的核苷酸分子为引物，对上述基因组DNA进行PCR扩增；3)、对PCR扩增产物经过Xho I酶切后电泳，得到CAPS标记；在所述CAPS标记中，引物对强雌性黄瓜品种满田705有335bp和853bp 2条谱带。
3.根据权利要求2所述的一种鉴定强雌性黄瓜品种满田705的分子标记方法，其特征是所述步骤3)中Xho I酶的酶切位点为强雌性黄瓜品种满田705克隆的基因序列第335bp处。
4.根据权利要求2或3所述的一种鉴定强雌性黄瓜品种满田705的分子标记方法，其特征是所述步骤2)的PCR扩增反应中a、反应液的反应体积以100μL为参考，所用物品的组成及含量为10mmol/L的dNTP混合物0.2μL0.1μmol/L的PCR引物 2μL高保真PCR聚合酶 5U基因组DNA 0.2μg10倍的反应缓冲液10μL无离子水加到100μL；b、PCR扩增反应在DNA扩增仪上进行，反应条件为94℃预变性5min后，然后按照94℃45sec、55℃45sec、72℃90sec的设置进行30个循环；循环结束后，在72℃下延伸10min，随后于4℃保存备用。
5.根据权利要求4所述的一种鉴定强雌性黄瓜品种满田705的分子标记方法，其特征是所述步骤3)对PCR扩增产物经过Xho I酶切，酶切后的PCR扩增产物在1.2％的琼脂糖凝胶上电泳1.5h(5V/cm)，溴化乙锭染色，用凝胶成像系统观察并拍照记录。
全文摘要
本发明公开了一种人工设计合成的核苷酸分子，是具有下列碱基组成的特定序列正向5′－CACTCGGAACGGTTTACGAT－3′,反向5′－AGCCCCTTAAGTTTCCCAAA－3′。本发明还公开了一种鉴定强雌性黄瓜品种满田705的分子标记方法，包括以下步骤1)基因组DNA的提取；2)以上述核苷酸分子为引物，对基因组DNA进行PCR扩增；3)对PCR扩增产物经过Xho I酶切后电泳，得到CAPS标记；在CAPS标记中，引物对强雌性黄瓜品种满田705有335bp和853bp 2条谱带。使用本发明的分子标记方法，能快速、准确鉴定是否为强雌性黄瓜品种满田705。
文档编号C12N15/11GK1763226SQ200510060830
公开日2006年4月26日 申请日期2005年9月20日 优先权日2005年9月20日
发明者向太和, 王利琳, 庞基良, 胡江琴 申请人:杭州师范学院