专利名称：工程化组织的示踪方法及工程化组织的构建方法
技术领域：
本发明涉及工程化组织技术领域。
背景技术：
目前临床治疗组织器官严重的缺损或功能障碍的有效措施是组织器官移植，但是这种治疗方法具有诸多缺陷，如供体组织器官来源有限、对移植组织器官产生免疫排斥反应和增加病毒感染几率等。
20世纪80年代随着细胞生物学与工程材料学等基础学科的深入发展，科学家开始大胆探索合理解决这一世界医学难题的新方法。“组织工程”的概念由此产生，它是应用工程学与生命科学的原理和方法，制备具有生物活性的替代物，以恢复、维持或提高受损组织的功能。采用组织工程学技术修复缺损的组织器官，具有移植材料来源广泛、移植物可以在体外成形、避免或降低了免疫排斥反应和感染性疾病的播散等优点。
目前采用组织工程技术已成功构建皮肤、骨、软骨、肌腱、肝、心肌、膀胱等多种工程化组织。组织工程的基本原理和方法是将体外培养扩增的正常组织细胞作为种子细胞，吸附于一种生物相容性良好并可被机体吸收的生物支架材料上形成复合物，将细胞-支架材料复合物植入机体组织、器官的病损部位，种子细胞在生物材料逐渐被机体降解吸收的过程中形成新的在形态和功能方面与相应器官、组织相一致的组织，而达到修复创伤和重建功能的目的。
在工程化组织构建以及植入后，需要观测细胞在支架上生长、融合情况以及在体内的生长、融合情况。目前，在这些组织进行体外构建和植入分析时，目前常用的观测技术均存在一定的局限性，如体外构建观察细胞在支架材料内的黏附生长时，往往使用倒置相差显微镜直接观察，但由于支架材料有一定的厚度，细胞与材料反差不大，因此难于清楚的观察细胞在材料内的情况；扫描电镜观察是另一种常用的方法，但是不能实现活细胞观察，且样本处理费时。在细胞植入体内的研究中，目前常用的细胞同位素标记、荧光染料标记和遗传物质标记等也存在明显缺陷，如细胞同位素标记时存在放射性辐射、荧光染料标记存在标记时间短于2周、而遗传物质标记往往存在检测繁琐等。
另外，在工程化组织构建时，根据构建的组织需要，有时在同一个组织中要接种不同的细胞或细胞要分次接种，例如复杂工程化组织中要用能够生产不同组织的细胞，而在构建较大的组织时，需要反复接种。如何区分不同的细胞或分次接种的细胞以便了解其生长及融合情况，是更加棘手的一个问题，目前的观察手段还不易做到。
发明内容
针对现在工程化组织构建及植入后观测方法存在的上述缺陷，本发明的目的在于提供一种工程化组织的示踪方法。
本发明的另一个目的还在于提供工程化组织的体外构建方法。
为实现本发明的第一个目的，本发明采用如下技术方案利用基因载体将荧光蛋白基因导入体外工程化组织构建所需的种子细胞中，获得表达荧光蛋白的种子细胞，将该种子细胞接种于工程化组织支架上，并利用荧光显微镜对细胞进行观察。
为解决接种不同种类的细胞和对不同批次接种的细胞的识别问题，作为本发明进一步的改进，对于体外工程化组织构建中不同种类和批次的细胞，分别导入不同颜色的荧光蛋白基因进行示踪。
所述的基因载体可以采用逆转录病毒载体或普通真核表达载体。
所述的荧光蛋白可以为绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白和黄色荧光蛋白。
为了实现本发明的第二个目的，本发明采用如下技术方案一种工程化组织的体外构建方法，该方法包括如下过程(1)将待接种的种子细胞进行扩增培养；(2)根据细胞种类和接种批次，准备相应的荧光蛋白和基因载体；(3)对基因载体进行扩增；(4)利用基因载体将荧光蛋白介导入扩增后的种子细胞中；(5)将标记有荧光蛋白的种子细胞接种到工程化组织骨架上，形成细胞-材料工程化组织复合体组织；(6)将工程化组织复合体组织在体外连续培养，在倒置荧光显微镜下直接观察不同区域的种子细胞形态与数量变化，以及不同区域的细胞迁移或脱落等情况。
本发明将分子生物学研究中的荧光蛋白标记技术应用于工程化组织构建中，通过利用荧光蛋白对工程化组织中的种子细胞进行标记和示踪，相对于现有的观察方法来说，具有如下优点(1)利用基因表达载体，对细胞标记荧光蛋白，利用倒置荧光显微镜，可以实现活细胞观察；(2)利用倒置荧光显微镜直接观察，不需要添加反应底物和其他材料等，具有实时观察的特点；(3)利用不同颜色的荧光蛋白对不同种类和/或批次细胞进行标记，可以区分不同处理措施后，能够清楚地观察到不同表型细胞在组织中的分布等；(4)在利用逆转录病毒载体进行基因转染时，细胞在体外表达荧光蛋白可以超过6月，具有长期表达的特点；(5)细胞在经不同荧光蛋白标记后，仍然具有较好的增殖与功能作用。
具体实施例方式
下面结合具体实施例对本发明的工程化组织的示踪方法及工程化组织的构建方法作进一步说明。
实施例1体外构建组织工程软骨，需要在支架材料内有较大的软骨细胞或干细胞浓度[(1～5)×107/ml]，才能产生接近正常的软骨基质。目前在体外构建组织工程软骨时，接种到支架材料内的细胞往往很容易脱落，使得种子细胞在局部浓度并不高，因此，有时出现了在一个支架材料内反复进行多次的细胞接种，试图较大幅度的增加种子细胞浓度。应用本技术即可对不同种植批次的种子细胞标记不同的荧光蛋白，从而显示在同一个支架材料内的细胞数量与分布变化等。步骤
1.根据待构建的工程化组织软骨的需要，准备所需的种子细胞，用软骨细胞或干细胞，并大量扩增。
2.自己构建或从生物公司购买所需要的逆转录病毒作为基因载体，然后进行大量扩增。
3.细胞的荧光蛋白标记处理(1)对准备第1次接种的种子细胞采用基因转染方式，标记增强型绿色荧光蛋白，其过程为①pLEGFP-N1质粒DNA经酚-氯仿抽提、乙醇沉淀。培养PT67包装细胞至75％融合面积，配制A液(基因DNA2μg+HEPES缓冲液25μl)、B液(DOTAP20μl+HEPES缓冲液30μl)混合后室温下静置15min，加入925μl不含血清DMEM培养液静置30min。PT67细胞用无血清培养液漂洗后，加入转染混合液，置孵箱内培养10h，然后换完全培养液培养24h，再换含G418(800μg/ml)培养液，4d后维持G418(400μg/ml)，待抗性克隆形成后传代培养。细胞长满瓶底后，收集24h培养液，孔径0.45μm滤膜过滤，2周内使用该病毒液时可置于4℃冰箱，否则应浓缩后加入10％甘油于-70℃保存。
②感染逆转录病毒待干细胞长至35cm2培养瓶瓶底50％面积时，换感染液6ml(含pLEGFP-N1病毒液2ml、polybrene终浓度8μg/ml)，37℃培养48h。
③筛选标记细胞采用G418递减方法筛选3周。首先消化待筛选细胞，调整接种密度为3×104/cm2，24h后换含G418(800μg/ml)培养液培养4d，然后G418(500μg/ml)培养4d，最后以G418(300μg/ml)维持形成抗性克隆及常规方法传代。
(2)对准备第2次接种的种子细胞采用基因转染方式，标记红色荧光蛋白，其过程为pDsRed2-C1质粒DNA经酚-氯仿抽提、乙醇沉淀。培养干细胞至50％融合面积，配制A液(基因DNA2μg+HEPES缓冲液25μl)、B液(DOTAP20μl+HEPES缓冲液30μl)混合后室温下静置15min，加入925μl不含血清DMEM培养液静置30min。细胞用无血清培养液漂洗后，加入转染混合液，置孵箱内培养10h，然后换完全培养液培养48h，再换含G418(800μg/ml)培养液，4d后维持G418(300μg/ml)，待抗性克隆形成后传代培养。
4.按工程化组织的构建技术，将标记增强型绿色荧光蛋白的种子细胞以2×107个/ml浓度接种到支架材料内，形成细胞-材料复合体，经过4～48小时的培育后，再进行相应浓度的第2次接种。第2次接种使用的是标记了红色荧光蛋白的种子细胞。
5.体外分析反复接种后形成的细胞-材料复合体，可以在倒置荧光显微镜下直接观察第2次接种细胞在支架材料内的分布，进而可以通过酶消化法将全部细胞消化后进行计数，从而得出第2次接种细胞的实际粘附数量。
实施例2 对工程化骨与软骨复合组织的构建与再生进行示踪工程化骨与软骨复合组织是采用工程化组织学技术在体外构建工程化软骨组织与工程化骨组织的复合组织，用于修复关节端的骨与软骨复合组织缺损。应用本技术可对不同区域的种子细胞标记不同的荧光蛋白，从而研究不同细胞的迁移行为和复合组织在体内的功能作用等特性。
步骤1.根据待构建的工程化组织的需要，准备所需的种子细胞，用软骨细胞、成骨细胞或干细胞，并大量扩增。
2.自己构建或从生物公司购买所需要的逆转录病毒作为基因载体，然后进行大量扩增。
3.细胞的荧光蛋白标记处理(1)对准备接种到软骨区域的种子细胞采用基因转染方式，标记增强型绿色荧光蛋白。其过程为①pLEGFP-N1质粒DNA经酚-氯仿抽提、乙醇沉淀。培养PT67包装细胞至75％融合面积，配制A液(基因DNA2μg+HEPES缓冲液25μl)、B液(DOTAP20μl+HEPES缓冲液30μl)混合后室温下静置15min，加入925μl不含血清DMEM培养液静置30min。PT67细胞用无血清培养液漂洗后，加入转染混合液，置孵箱内培养10h，然后换完全培养液培养24h，再换含G418(800μg/ml)培养液，4d后维持G418(400μg/ml)，待抗性克隆形成后传代培养。细胞长满瓶底后，收集24h培养液，孔径0.45μm滤膜过滤，2周内使用该病毒液时可置于4℃冰箱，否则应浓缩后加入10％甘油于-70℃保存。
②感染逆转录病毒待干细胞长至35cm2培养瓶瓶底50％面积时，换感染液6ml(含pLEGFP-N1病毒液2ml、polybrene终浓度8μg/ml)，37℃培养48h。
③筛选标记细胞采用G418递减方法筛选3周。首先消化待筛选细胞，调整接种密度为3×104/cm2，24h后换含G418(800μg/ml)培养液培养4d，然后G418(500μg/ml)培养4d，最后以G418(300μg/ml)维持形成抗性克隆及常规方法传代。
(2)对准备接种到骨区域的种子细胞采用基因转染方式，标记红色荧光蛋白。其过程为pDsRed2-N1质粒DNA经酚-氯仿抽提、乙醇沉淀。培养成骨细胞至50％融合面积，配制A液(基因DNA2μg+HEPES缓冲液25μl)、B液(DOTAP20μl+HEPES缓冲液30μl)混合后室温下静置15min，加入925μl不含血清DMEM培养液静置30min。细胞用无血清培养液漂洗后，加入转染混合液，置孵箱内培养10h，然后换完全培养液培养48h，再换含G418(800μg/ml)培养液，4d后维持G418(300μg/ml)，待抗性克隆形成后传代培养。
4.按工程化组织的构建技术，在软骨支架材料内进行标记增强型绿色荧光蛋白的种子细胞接种，细胞浓度2×107个/ml，形成细胞-材料复合体，在骨支架材料内进行标记红色荧光蛋白的种子细胞接种，细胞浓度5×106个/ml，形成细胞-材料复合体，在将两种组织进行装配形成完整的工程化骨与软骨复合组织。
5.体外分析将工程化骨与软骨复合组织在体外连续培养，可以在倒置荧光显微镜下直接观察不同区域的种子细胞形态与数量变化，以及不同区域的细胞迁移或脱落等情况。
6.组织移植后的分析工程化骨与软骨复合组织植入体内后，经过一段时间后可以取材进行样本分析。样本经冰冻切片后直接置于荧光显微镜下可以观察到不同标记处理的细胞呈不同的荧光表现，而该区域未进行标记的细胞无荧光表现；结合其它相应检测，即可对植入组织进行详细的细胞功能分析。
实施例3 对工程化组织皮肤的构建与再生进行示踪为了良好的覆盖皮肤组织缺损创面，体外构建工程化皮肤时，可以仿生性的进行2层组织构建，其中一层接种角质形成细胞，模拟表皮组织功能，另一层接种成纤维细胞，模拟部分真皮组织功能。应用本技术可对不同区域的种子细胞标记不同的荧光蛋白，从而研究不同细胞的迁移行为和组织中不同种子细胞在体内的功能作用等特性。
步骤1.待标记的种子细胞的大量扩增培养，如角质形成细胞、成纤维细胞或干细胞。
2.自己构建或从生物公司购买所需要的逆转录病毒作为基因载体，然后进行大量扩增。
3.细胞的荧光蛋白标记处理(1)对准备接种到表皮区域的种子细胞采用基因转染方式，标记增强型绿色荧光蛋白。其过程为pEGFP-N1质粒DNA经酚-氯仿抽提、乙醇沉淀。培养角质形成细胞至50％融合面积，配制A液(基因DNA2μg+HEPES缓冲液25μl)、B液(DOTAP20μl+HEPES缓冲液30μl)混合后室温下静置15min，加入925μl不含血清DMEM培养液静置30min。细胞用无血清培养液漂洗后，加入转染混合液，置孵箱内培养10h，然后换完全培养液培养48h，再换含G418(800μg/ml)培养液，4d后维持G418(300μg/ml)，待抗性克隆形成后传代培养。
(2)对准备接种到真皮区域的种子细胞采用基因转染方式，标记红色荧光蛋白。其过程为①pLRFP-N1质粒DNA经酚-氯仿抽提、乙醇沉淀。培养PT67包装细胞至75％融合面积，配制A液(基因DNA2μg+HEPES缓冲液25μl)、B液(DOTAP20μl+HEPES缓冲液30μl)混合后室温下静置15min，加入925μl不含血清DMEM培养液静置30min。PT67细胞用无血清培养液漂洗后，加入转染混合液，置孵箱内培养10h，然后换完全培养液培养24h，再换含G418(800μg/ml)培养液，4d后维持G418(400μg/ml)，待抗性克隆形成后传代培养。细胞长满瓶底后，收集24h培养液，孔径0.45μm滤膜过滤，2周内使用该病毒液时可置于4℃冰箱，否则应浓缩后加入10％甘油于-70℃保存。
②感染逆转录病毒待干细胞长至35cm2培养瓶瓶底50％面积时，换感染液6ml(含pLRFP-N1病毒液2ml、polybrene终浓度8μg/ml)，37℃培养48h。
③筛选标记细胞采用G418递减方法筛选3周。首先消化待筛选细胞，调整接种密度为3×104/cm2，24h后换含G418(800μg/ml)培养液培养4d，然后G418(500μg/ml)培养4d，最后以G418(300μg/ml)维持形成抗性克隆及常规方法传代。
4.按工程化组织的构建技术，在皮肤支架材料内进行标记红色荧光蛋白的干细胞接种，细胞浓度1×107个/ml，形成细胞-材料复合体，培养2天后，在细胞-材料复合体的表面一侧进行标记增强型绿色荧光蛋白的角质形成细胞接种，细胞浓度5×106个/ml，形成具有两层细胞的复合体组织。
5.体外分析将具有2层结构的工程化皮肤组织在体外连续培养，可以在倒置荧光显微镜下直接观察不同区域的种子细胞形态与数量变化。
6.组织移植后的分析工程化皮肤组织植入皮肤缺损处后，经过一段时间后可以取材进行样本分析。样本经冰冻切片后直接置于荧光显微镜下可以观察到不同标记处理的细胞呈不同的荧光表现，而该区域未进行标记的细胞无荧光表现；结合其它相应检测，即可对植入组织进行详细的细胞功能分析。
权利要求
1.一种工程化组织的细胞示踪方法，其特征在于利用基因载体将荧光蛋白基因在体外分别导入将构建工程化组织所需的种子细胞中，获得表达荧光蛋白的细胞，将该细胞接种于工程化组织支架上，并利用荧光显微镜对细胞进行观察。
2.如权利要求1所述的工程化组织的细胞示踪方法，其特征在于对于体外工程化组织构建中不同种类和批次的细胞，分别导入不同颜色的荧光蛋白基因进行示踪。
3.如权利要求1或2所述的工程化组织的示踪方法，其特征在于所述的基因载体采用逆转录病毒载体或普通真核表达载体。
4.如权利要求1或2所述的工程化组织的示踪方法，其特征在于所述的荧光蛋白可以为绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白和黄色荧光蛋白。
5.一种工程化组织的体外构建方法，该方法包括如下过程(1)将待接种的种子细胞进行扩增培养；(2)根据细胞种类和接种批次，准备相应的荧光蛋白和基因载体；(3)对基因载体进行扩增；(4)利用基因载体将荧光蛋白导入扩增后的种子细胞中；(5)将标记有荧光蛋白的种子细胞接种到工程化组织支架上，形成细胞-材料工程化组织复合体组织；(6)将工程化组织复合体在体外连续培养，在倒置荧光显微镜下直接观察不同区域的种子细胞形态与数量变化，以及不同区域的细胞迁移或脱落等情况。
6.如权利要求5所述的工程化组织的体外构建方法，其特征在于所述的基因载体采用逆转录病毒载体或普通真核表达载体。
7.如权利要求5或6所述的工程化组织的体外构建方法，其特征在于所述的荧光蛋白可以为绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白和黄色荧光蛋白。
全文摘要
本发明公开了一种工程化组织的细胞示踪方法，利用基因载体将荧光蛋白基因在体外分别导入将构建工程化组织所需的种子细胞中，获得表达荧光蛋白的细胞，将该细胞接种于工程化组织支架上，并利用荧光显微镜对细胞进行观察。这种工程化组织的示踪方法，可以清楚地显示细胞特别是不同种类及各批次细胞的分布与增殖情况、在体内植入后细胞的分布与功能情况。
文档编号C12Q1/04GK1766117SQ20051010332
公开日2006年5月3日 申请日期2005年9月16日 优先权日2005年9月16日
发明者杨柳, 段小军 申请人:中国人民解放军第三军医大学第一附属医院