专利名称：一株苜蓿根瘤菌及其发酵培养方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株苜蓿根瘤菌及其发酵培养方法与应用。
背景技术：
国际上对豆科根瘤菌的研究和应用已有一百多年历史，几乎在全世界范围内的苜蓿生产领域都提倡对苜蓿进行根瘤菌接种。因为接种根瘤菌可提高苜蓿的成苗率、幼苗结瘤率，增强共生固氮作用，从而提高苜蓿的产草量及其蛋白质含量。近十年来，我国苜蓿产业快速发展，各地都十分重视苜蓿接种根瘤菌技术的应用。
当前，苜蓿根瘤菌接种技术领域存在的问题，主要是由于苜蓿品种的不断推陈出新，一些苜蓿新品种与当前推广应用的根瘤菌的亲和性不强，导致接种后生固氮效果不明显。
国外十分重视苜蓿共生固氮优良组合筛选。1986年Tan用15个苜蓿品种与10株苜蓿根瘤菌进行共生固氮优良组合筛选试验，结果表明组合间的共生固氮差异有30％是苜蓿品种所致，26％的差异为苜蓿根瘤菌菌株间的差异所致，36％以上的差异来自苜蓿品种与苜蓿根瘤菌之间的相互作用(《中国苜蓿》，中国农业出版社，152页，1995)。在共生固氮过程中，根瘤菌不同菌株与苜蓿不同品种相互间有很强的选择性，因而筛选苜蓿品种与根瘤菌株的共生固氮优良组合，是提高苜蓿共生固氮效率的有效途径。
发明内容
本发明的目的是提供一株用于苜蓿接种的根瘤菌及其发酵培养方法。
本发明所提供的用于苜蓿接种的根瘤菌菌株是(Rhizobium meliloti)17674，该菌株已于2005年07月25日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.1422。
苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)17674 CGMCC No.1422属革兰氏阴性杆菌，无芽孢，具端生鞭毛或周生鞭毛，能运动。菌体大小为(0.5-0.9)×(1.0-3.0)微米，在不同环境中生长的菌体形态各异。在培养条件下，该菌呈小的短杆状，菌体染色不均匀，形成着色与不着色部分的环状体，不着色的部分脂类含量高。在酵母汁甘露醇琼脂培养基平面上生长的菌落呈圆形，边缘整齐，稍突起，无色半透明或浅乳白色，菌苔较浓。
本发明的第二个目的是提供一种苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)17674 CGMCCNo.1422的发酵培养方法。
本发明所提供的苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)17674 CGMCC No.1422的发酵培养方法，是将苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)17674 CGMCC No.1422接种到其专用液体培养基中，在28-30℃下通气培养；所述专用液体培养基的配方为每1000mL水中含糖5-10g，酵母粉1-2g，磷酸氢二钾0.25-0.75g，硫酸钙0.16-0.24g，硫酸镁0.1-0.3g，氯化钠0.1-0.3g，1％钼酸铵0.5-1.5mL和0.5％硼酸2-6mL，pH值为6.8-7.0；所述百分比浓度均为质量百分比浓度。
在上述培养方法中，接种比例为10-20％，优选为10％；培养过程的通气量为0.4-0.8mM O2L-1h-1；培养24-72小时即可达到培养终点。
优选的专用液体培养基的配方为每1000mL水中含糖10g，酵母粉2g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸钙0.2g，硫酸镁0.2g，氯化钠0.2g，1％钼酸铵1mL和0.5％硼酸4mL(固体培养基再添加20g琼脂)，pH值为6.8-7.0。
培养条件优选为温度为28℃，通气量为0.5mM O2L-1h-1，培养时间为48小时。
本发明的另一个目的是提供一种苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)17674 CGMCCNo.1422菌剂。
本发明所提供的苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)17674 CGMCC No.1422菌剂，其活性成分为苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)17674 CGMCC No.1422。
为得到更好的使用效果，所述菌剂中还可加入草炭，草炭的细度一般为80-150目，所述苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)17674 CGMCC No.1422的菌液与草炭的重量份数比为2-4∶1。
所述含有草炭成分的苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)17674 CGMCC No.1422菌剂的生产方法，是将经上述方法发酵的苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)17674CGMCC No.1422的菌液与干燥、无菌、pH值为6.5-7.0的草炭按重量份数比2-4∶1混匀，再在相同的条件下增殖培养12-36小时，得到含有草炭成分，且活菌含量大于2亿个/克的苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)17674 CGMCC No.1422菌剂；其中用来配制菌剂的菌液的含菌数一般为30亿个/mL。
所述草炭与菌液混合前过80-150目筛，优选为100目筛；对草炭进行灭菌的条件可为0.1兆帕压强下，1小时。
本发明的第四个目的是提供一种提高苜蓿共生固氮作用的方法。
本发明所提供的提高苜蓿共生固氮作用的方法，是将苜蓿种子接种上述苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)17674 CGMCC No.1422或以苜蓿根瘤菌(Rhizobiummeliloti)17674 CGMCC No.1422为活性成分的菌剂，再经播种、培养，得到共生固氮作用提高的苜蓿。
适用于本发明提高共生固氮作用的方法的苜蓿品种可为阿尔冈金(兰、白)、美国牧歌、淮阴苜蓿、中苜一号、保定苜蓿、金苜蓿或美国苜蓿王等。
本发明提供了一株苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)17674 CGMCC No.1422，该菌及以该菌为活性成分的菌剂可用于苜蓿接种。苜蓿接种组合效果的水培试验证明将该菌接种苜蓿种子后，苜蓿植株高度和植株鲜重比不接菌的对照植株分别增长56.48％和104.93％；在土壤盆栽试验中，接种该菌的苜蓿的植株高度和植株鲜重比不接菌的对照植株分别增长43.98％和57.16％。上述试验证明苜蓿根瘤菌(Rhizobiummeliloti)17674 CGMCC No.1422与苜蓿接种组合对苜蓿具有显著的增产效果，产草量提高可达49％-62％，且具有较高的实用性和可推广性，有望发展成为苜蓿根瘤菌应用领域中一项新的优良组合技术。本发明在苜蓿种植业中具有广阔的应用前景。
具体实施例方式
下属实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所有百分比浓度均为质量百分比浓度，所有培养基中的溶剂均为水。
苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)17674 CGMCC No.1422专用液体培养基的配方为每1000mL水中含糖10g，酵母粉2g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸钙0.2g，硫酸镁0.2g，氯化钠0.2g，1％钼酸铵1mL和0.5％硼酸4mL(固体培养基再添加20g琼脂)，pH值为6.8-7.0。
实施例1、苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)17674 CGMCC No.1422的保藏及发酵培养1、菌种的分离、保藏从山东潍坊采集野生苜蓿根瘤，用平板划线分离得到苜蓿根瘤菌菌株(Rhizobiummeliloti)17674，该菌株已于2005年07月25日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.1422。
2、苜蓿根瘤菌菌株(Rhizobium meliloti)17674 CGMCC No.1422的斜面培养挑取该菌种，对其用上述专用固体培养基进行斜面培养，在28℃下培养48小时。
3、菌种的摇床液体培养挑取步骤2斜面培养的根瘤菌菌株(Rhizobium meliloti)17674 CGMCC No.1422，接种于摇瓶专用培养液中，每500mL接种2支斜面菌种，在28℃下培养36小时。
4、种子罐培养取3L步骤3的菌液，接入100L种子罐中(含有60L培养液)进行种子培养，在30℃、120rpm下搅拌培养56小时培养。
5、发酵罐培养按10％比例将步骤4的种子液接入1000L发酵罐中(含有600L培养液)进行发酵培养，在28℃、150rpm下搅拌培养48小时。所得发酵液可用于草炭吸附为苜蓿根瘤菌菌剂，菌液的含菌数约为30亿个/mL。
实施例2、含草炭的苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)17674 CGMCC No.1422菌剂的制备1、草炭的处理将草炭自然干燥后进行粉碎，过100目筛，然后用生石灰粉调pH值为6.8，在0.1兆帕下灭菌1小时。
2、含草炭的苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)17674 CGMCC No.1422菌剂的获得将实施例1中经发酵的苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)17674 CGMCC No.1422的菌液与步骤1获得的干燥、无菌、pH值为6.8的草炭按重量份数比3∶1混匀，再在28℃下增殖培养24小时，得到苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)17674 CGMCCNo.1422菌剂，可分装入库。经检测成品合格，活菌含量大于2亿个/克。可用于苜蓿接种。
实施例3、苜蓿接种组合效果的试验1、苜蓿接种组合效果的水培试验本试验用的苜蓿品种为阿尔冈金(白、兰)、金皇后、美国牧歌、淮荫苜蓿和保定苜蓿。将苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)17674 CGMCC No.1422与上述苜蓿品种形成的不同的组合，用滤纸桥试管水培法进行苜蓿接种组合效果的水培试验，同时以不接菌的植株为对照，具体方法如下1)将滤纸裁成条状，其宽度分别为1.3cm，1.6cm，制成M型，中间凹处根据幼苗的大小制成V型小孔，M型滤纸的高度为试管的长度减去4cm。所用试管尺寸为1.5cm×18cm。
2)将配制好的无氮营养液分别装入带有滤纸支撑物的试管中，其高度位于H型滤纸的凹处，每个处理重复5个试管，并设对照管10个，灌装后用耐高压的塑料薄膜封好后，15磅121℃灭菌1小时备用。
3)选择大小均一的苜蓿种子。由于其种皮较厚，先用浓硫酸浸泡2-3分钟后用无菌水洗涤数次，以洗去表面残留的酸为止。
4)将经消毒的种子置于28-30℃温箱中保温催芽。催芽后进行培养，光照条件从顶部照射，根部避光，可放置温室或光照箱中，关照强度约7000-8000/ux；温度条件20-30℃。
表1 苜蓿接种组合效果的水培试验结果
试验结果如表1所示，将苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)17674 CGMCC No.1422接种苜蓿种子后，苜蓿植株高度和植株鲜重比不接菌的对照植株分别增长56.48％和104.93％，表明本发明的苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)17674 CGMCC No.1422对苜蓿具有显著的增产效果。
2、苜蓿接种组合效果的土壤盆栽试验本试验用的苜蓿品种为阿尔冈金(白、兰)、金皇后、美国牧歌、淮荫苜蓿和保定苜蓿。将苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)17674 CGMCC No.1422与上述苜蓿品种形成的不同的组合，进行苜蓿接种组合效果的土壤盆栽试验，所用土壤pH值为8.02，不灭菌，在网室或温室内栽培，重复4次，同时以不接菌的植株为对照。
表2 苜蓿接种组合效果的土壤盆栽试验结果
试验结果如表2所示，将苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)17674 CGMCC No.1422接种苜蓿种子后，接种该菌的苜蓿的植株高度和植株鲜重比不接菌的对照植株分别增长43.98％和57.16％，表明本发明的苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)17674 CGMCCNo.1422对苜蓿具有显著的增产效果。
实施例4、苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)17674 CGMCC No.1422与普通应用苜蓿根瘤菌接种苜蓿品种的效果比较试验选用苜蓿品种阿尔冈金(兰)、阿尔冈金(白)、美国牧歌、淮阴苜蓿、中苜一号和保定苜蓿，普通应用苜蓿根瘤菌ACCC17512。
试验分三组，一组对上述苜蓿品种的种子本别接种苜蓿根瘤菌ACCC17512，一组对上述苜蓿品种的种子本别接种苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)17674 CGMCCNo.1422，另外一组为对照，不进行接种。按常规方法对上述三组苜蓿的种子进行播种、培养，约60天后，长成植株，记录各个植株的高度和重量，并计算出各个组合的平均值，普通苜蓿根瘤菌ACCC17512与苜蓿品种接种结果如表3所示，苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)17674 CGMCC No.1422与苜蓿品种接种结果如表4所示，苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)17674 CGMCC No.1422与普通应用苜蓿根瘤菌ACCC1751接种苜蓿品种效果比较结果如表5所示，结果表明将苜蓿根瘤菌(Rhizobiummeliloti)17674 CGMCC No.1422接种苜蓿种子后，苜蓿植株高度和植株鲜重比接种普通苜蓿根瘤菌ACCC17512的植株相比显著增长，表明本发明的苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)17674 CGMCC No.1422对苜蓿具有显著的增产效果。
表3 普通苜蓿根瘤菌ACCC17512与苜蓿品种接种结果
表4 苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)17674 CGMCC No.1422与苜蓿品种接种结果
表5 苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)17674 CGMCC No.1422与普通应用苜蓿根瘤菌ACCC17512接种苜蓿品种效果比较结果
权利要求
1.苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)17674 CGMCC No.1422。
2.一种发酵培养苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)17674 CGMCC No.1422的方法，是将苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)17674 CGMCC No.1422接种到其专用液体培养基中，在28-30℃下通气培养；所述专用液体培养基的配方为每1000mL水中含糖5-10g，酵母粉1-2g，磷酸氢二钾0.25-0.75g，硫酸钙0.16-0.24g，硫酸镁0.1-0.3g，氯化钠0.1-0.3g，1％钼酸铵0.5-1.5mL和0.5％硼酸2-6mL，pH值为6.8-7.0。
3.根据权利要求2所述的发酵培养方法，其特征在于所述专用液体培养基的配方为每1000mL水中含糖10g，酵母粉2g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸钙0.2g，硫酸镁0.2g，氯化钠0.2g，1％钼酸铵1mL和0.5％硼酸4mL，pH值为6.8-7.0。
4.根据权利要求2或3所述的发酵培养方法，其特征在于所述接种比例为10-20％；培养过程的通气量为0.4-0.8mM O2L-1h-1，培养时间为24-72小时。
5.根据权利要求4所述的发酵培养方法，其特征在于所述培养条件为温度为28℃，通气量为0.5mM O2L-1h-1，培养时间为48小时。
6.以苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)17674 CGMCC No.1422为活性成分的菌剂。
7.根据权利要求6所述的菌剂，其特征在于所述菌剂中添加有草炭，草炭的细度为80-150目，所述苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)17674 CGMCC No.1422的菌液与草炭的重量份数比为2-4∶1。
8.一种权利要求7所述菌剂的生产方法，是将经权利要求2所述的发酵培养方法得到的苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)17674 CGMCC No.1422的菌液与干燥、无菌、pH值为6.5-7.0的草炭按重量份数比为2-4∶1混匀，再在相同的条件下增殖培养12-36小时，得到含草炭成分，且活菌含量大于2亿个/克的苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)17674 CGMCC No.1422菌剂；其中用来配制菌剂的菌液的含菌数为30亿个/mL。
9.根据权利要求8所述的生产方法，其特征在于所述草炭与菌液混合前过80-150目筛；对草炭进行灭菌的条件为0.1兆帕压强下，1小时。
10.一种提高苜蓿共生固氮作用的方法，是将苜蓿种子接种权利要求1所述的苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)17674 CGMCC No.1422或权利要求6所述的以苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)17674 CGMCC No.1422为活性成分的菌剂，再经播种、培养，得到共生固氮作用提高的苜蓿；所述苜蓿品种为阿尔冈金、美国牧歌、淮阴苜蓿、中苜一号、保定苜蓿、金苜蓿或美国苜蓿王。
全文摘要
本发明公开了一株苜蓿根瘤菌及其发酵培养方法与应用。该苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)17674 CGMCC No.1422的发酵培养方法，是将苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)17674 CGMCC No.1422接种到其专用液体培养基中，在28－30℃下通气培养；所述专用液体培养基的配方为每1000mL水中含糖5－10g，酵母粉1－2g，磷酸氢二钾0.25－0.75g，硫酸钙0.16－0.24g，硫酸镁0.1－0.3g，氯化钠0.1－0.3g，1％钼酸铵0.5－1.5mL和0.5％硼酸2－6mL，pH值为6.8－7.0。本发明所提供的苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)17674 CGMCC No.1422与苜蓿的接种组合有望发展成为苜蓿根瘤菌应用领域中一项新的优良组合技术。
文档编号C12R1/41GK1766090SQ20051010291
公开日2006年5月3日 申请日期2005年9月13日 优先权日2005年9月13日
发明者马晓彤, 宁国赞, 侯向阳, 姜瑞波 申请人:中国农业科学院农业资源与农业区划研究所