专利名称：一种同时检测靶基因序列及已知点突变的新技术的制作方法
技术领域：
本发明利用独特设计的一对单荧光素标记的引物，在荧光PCR仪器或普通PCR仪加荧光读板机中进行PCR或RT-PCR反应，根据荧光值的变化实现对特定靶序列的定性或定量检测，并同时在扩增产物中引入特定的限制性内切酶位点，通过随后的一个酶切过程，检测酶切过程中荧光值的变化，实现对靶序列上点突变的检测。
背景技术：
靶基因序列的检测目前在生物医药领域有众多的方法，最普遍的方法有核酸杂交、支链DNA技术、PCR技术、连接酶链技术及基因芯片技术等。其中一种改良的PCR技术——实时荧光PCR方法在临床上应用最为普遍。实时荧光PCR方法又分为几种，如SYBR Green I荧光燃料法、荧光探针法等。荧光探针法根据荧光探针设计原理的不同，又分为TaqMan荧光探针，Beacon荧光探针以及杂交探针，上述三种探针均为专利技术。在国内临床基因检测中应用最为普遍的是根据TaqMan荧光探针技术开发的临床基因检测试剂盒，几乎覆盖了几十种常见病原体的检测并延伸到人类遗传病的检测、癌基因的检测以及个体识别上。
TaqMan荧光探针的实时荧光PCR反应是在常规PCR的一对引物之外，加入一个两端带有荧光标记的寡核苷酸探针。在探针完好的状态下，5′端报告荧光基团的激发光被3′端的淬灭荧光基团所抑制。PCR反应过程中，随着链的延伸，Taq酶沿着DNA模板移动到荧光标记探针的结合位置，由于它的5→3′外切核酸酶活性，将荧光探针切断，释放出报告荧光基团的荧光信号，每合成一条新生链，就有一个报告基团的信号释放，被释放的激离报告荧光基团的数目和PCR产物是一对一的关系。通过荧光PCR仪定时动态监测每一循环，可以得到样品实际扩增曲线，找到PCR扩增的对数期，可以对样本作定性定量检测。
基因突变属分子水平上的变异，是指生物的遗传物质(DNA或RNA)上个别基因所发生的分子结构的变化。基因突变在自然界普遍存在，从病毒到动植物以及人类都会发生基因突变。基因突变种类繁多，其中在个别碱基上发生的改变如缺失、增添、代换等称为点突变。在众多导致人类疾病的基因有义突变、病原体亚型以及耐药基因的有义突变中，单碱基突变占了相当大的比例，其检测方法的探索一直是基因诊断研究中的重要课题，特别是对已知有义突变的检测，将是临床进行基因诊断的重要手段之一。单碱基突变中如果单个碱基发生替换，也称单核苷酸多态性(single nucleotide polymophism，SNP)。
PCR扩增技术问世以来，建立于扩增基础上的突变检测技术使检测靶序列含量和/或突变靶序列比例过低、检测灵敏度不足等难题得以克服，使得分子诊断技术进入了新阶段。在过去十多年中，曾出现了诸如经典的PCR-RFLP、SSCP、ASO以及OLA、PEX等点突变的检测方法，近年来又发展了多种针对已知点突变的分析方法，如反向限制性位点突变分析(inverse restriction site mutation，iRSM)，荧光PCR检测点突变(SYBR Green I结合熔解曲线分析点突变，荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer，FRET)结合探针熔解曲线分析点突变，TaqMan-MGB探针检测SNP)，基因芯片(gene chip)，等位基因特异性扩增技术(allele-specific PCR或amplification，ASPCR或ASA)以及结合毛细管电泳技术检测DNA点突变等。
反向限制性位点突变分析(inverse restriction site mutation，iRSM)1978年Kan和Dozy创立的限制性片断长度多态性(restriction fragmentlength polymorphism，RFLP)连琐分析技术是最早用于分析已知点突变的方法。其检测特点是具有较高的特异性，可以确定突变的部位及性质，重复性好。但不足之处是仅适合于多态性的检测即突变频率大于1％才能被检测到；因此，RFLP分析对于检测突变的早期，尤其是在野生型远多于突变型时其敏感性就显得不足了。为了能够提高RFLP分析技术的敏感性，1999年Jekins等人对其进行了改良，创立了一种名为反向限制性位点突变分析(iRSM)，进行低突变频率等位基因的检测。其方法主要用于突变早期的检测，当某一野生型序列发生突变导致原有酶切位点(E1位点)的消失，产生一新的酶切位点(E2位点)，称之为E1→E2突变，但突变频率较低常规RFLP无法检测。此时，用一内切酶(E1)对其进行酶切，这样可选择性地移去大部分的野生型序列(＞99％)。无酶切位点的部分通过PCR扩增(引物被设计在E2位点的一侧)，产物用另一内切酶(E2)进行RFLP分析，根据产物中是否存在E2位点即可判断有无突变发生。
荧光PCR检测点突变自RFLP第一次进行点突变检测以来，此后的20余年中诞生了不下20余种检测法，近年来随着自动化荧光检测技术的建立，其取代凝胶及放射性标记分析产物的趋势已经形成。这就意味着以荧光为标记物的检测技术在不远的将来可能在突变检测中占有重要的一席之地。
SYBR Green I结合熔解曲线分析点突变SYBY Green I是一种双链特异性的DNA染料，只与双链DNA结合，并且单个存在时并不发射荧光，只有当多个SYBY Green I嵌入双链时才能被检测到。当此双链通过变性温度时产生的荧光会快速衰减而形成特异的熔解曲线，如果在PCR扩增循环过程中对SYBY Green I发出的荧光进行持续监测，那么利用这一特征可对不同产物的变性进行观测。产物的熔解曲线取决于GC含量、序列长度以及碱基序列。如果扩增产物中存在突变型序列，那么在变性过程中它与野生型序列之间解链温度即Tm就会产生差异。Tm相差2℃以上，就可通过它们各自的熔解曲线将其分离。这种点突变分析技术的特点是简单、快速、自动化程度较高，易于推广；但是所用的染料SYBY Green I与溴乙啶、YO-PRO-1一样，缺乏序列特异性，因此不可避免的将会降低其敏感性。在扩增过程中产生的非特异性荧光，通常是由引物二聚体和其它污染物的扩增产物引起的，单以荧光很难将其与靶序列发出的荧光相区分。另外扩增产物碱基序列数较大时，单个碱基置换引起的点突变其Tm变化较小，运用SYBR Green I和熔解曲线分析就很难检出。
荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer，FRET)结合探针熔解曲线分析点突变经典的ASO突变检测技术是利用探针与不同扩增产物之间杂交稳定性的差异来检测点突变。而FRET结合探针熔解曲线分析法(以下简称FRET法)正是通过对杂交产物稳定性进行实时监测，并结合熔解曲线分析，提高了对点突变检测的分辨率。Bernard等人针对点突变序列区域设计探针，并在其5′端标记荧光，同时在PCR引物的3′端附近标记Cy5，那么经PCR扩增后就会得到若干条标记有Cy5的扩增产物。当标有荧光的探针与这些产物相互补后就会产生FRET。在PCR扩增过程中伴随温度升高，对其产生的荧光进行实时监测即可得到特征性的探针熔解曲线，通过曲线分析即可检出产物中是否存在突变。FRET适用于任何形式的点突变的检测。
基因芯片(gene chip)基因芯片技术系指将大量(通常每平方厘米点阵密度高于400)探针分子固定在支持物上后与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息。它是基于特异性探针与目的DNA杂交的原理发展起来的一种分析方法，可用于大规模检测基因突变、基因多态、基因表达水平以及测定DNA序列。
基因芯片检测突变的原理是将许多已知序列的核苷酸DNA被排列在一块集成电路板上，彼此之间重叠一个碱基，并覆盖整个所需检测的基因，通过RT-PCR扩增得到的正常cDNA和突变cDNA分别用荧光标记，并与两块DNA芯片杂交，由于至少一个碱基的差异，正常cDNA和突变cDNA将会得到不同的杂交图谱，通过共聚焦显微镜分别检测两种cDNA分子产生的荧光信号即可确定是否存在突变。探针与样品完全匹配所产生的荧光信号强度是具有单个或两个错配碱基探针的5-35倍，所以对荧光信号强度精确测定是实现检测特异性的基础。将生物传感器与芯片技术相结合，通过改变探针阵列区域的电场强度也证明可以检测基因(ras等)的单碱基突变。
该方法具有检测信息高通量和自动化程度高，一次性检测可检出多个位点突变，具有很大的发展潜力。1996年7月，第一块有关HIV酶的DNA芯片问世，相信随着技术的进一步改进，该方法在突变检测中将会发挥越来越重要的作用。
等位基因特异性扩增技术(allele-specific PCR或amplification，ASPCR或ASA)ASPCR是一项在PCR基础上发展起来的新方法，通过PCR和凝胶电泳即可检测出DNA中各种点突变。ASPCR的基本构思是设计2个ASO引物，使之与另一引物构成PCR反应体系。这2个引物与探针的ASO不同，等位基因特异性碱基不是位于ASO中间，而是置于引物的3′端。这种设计是基于耐热Taq DNA聚合酶缺乏3′→5′外切校正活性的特点。引物3′端的特异碱基分别互补于野生型和突变型等位基因的相对碱基，若此碱基对形成错配，链延伸反应就会因3′，5′-磷酸二酯键形成障碍而受阻，故此法又称扩增受阻突变体系(amplification refractory mutation system，ARMS)。其扩增结果为“野生”模板阻碍，“突变”引物放大；或“突变”模板阻碍，“野生”引物放大。
ASPCR点突变的检出率依赖于反应条件的优化和防止引物与靶DNA错配时可能发生的错配延伸，这可通过调整实验条件如引物、靶DNA、Taq酶的浓度和反应温度等来提高特异性，在反应体系中加入甲酰胺亦可减少非特异性扩增。还可通过人为地使引物3′末端的第二个碱基发生错配来阻止错误延伸。
毛细管电泳技术毛细管电泳(CE)是90年代初发展起来的新技术，具有分辨率高、重现性好、灵敏度高、快速和易于实现自动化的特点。后来又发展了激光诱导荧光检测器(LIF)，大大提高了分析灵敏度，对微量样品如单细胞分析等，具有很大的优势。CE可以应用于DNA点突变的检测，目前在PCR基础上利用CE技术对DNA已知点突变的检测发展十分迅速。
扩增抗拒突变系统PCR(ARMS-PCR)和短串联重复PCR(STR-PCR)ARMS-PCR和STR-PCR在检测已知点突变中愈来愈受到重视，尤其是用来诊断特殊遗传疾病和癌症。两种分析方法都包括利用可以辨别单碱基突变(ARMS-PCR)或者具有简单序列的不同数量的重复片段(STR-PCR)的引物进行专一性基因片段PCR扩增。CGE和ESCE都可以分析在ARMS-PCR基因PCR扩增中的单碱基取代产物。选择合适的多组PCR引物对可以同时对多个突变位点进行分析。Donohoe等利用多重ARMS-PCR扩增反应鉴定了阿朴脂蛋白E基因。
连接酶链式反应(LCR)LCR是一种点突变检测反应接着进行信号扩增的技术。在基因突变诱发人体疾病的程序性分析中十分有用。LCR反应中采用了两对互补寡核苷酸引物，如果引物的序列与目标序列能完全配对时，那么两对引物将与各自目标片段杂交，并连接；如果点突变出现在目标片段上时，将不能进行连接反应，就不会出现连接产物。Grossman等利用ESCE快速分析了用于诊断膀胱纤维变性疾病的LCR产物，该方法也诊断了leber′s遗传性光纤神经疾病。
等位基因特异性扩增分析(ASA)ASA是一种点突变的检测方法，两种寡核苷酸引物被用在PCR反应中。如果引物的序列与目标等位基因序列完全配对，那么引物在目标片段上杂交并变成PCR扩增；如果点突变发生在目标片段上时，则无扩增产物出现。单道及多道的CGE已经用于快速提供ASA基因图谱的分析工作。Barta等利用CGE及LIF检测器分析了多重ASA反应，对先天性肾上腺增生患者21-hydroxylase基因的多个突变位点进行检测。将多重PCR定量扩增同CE连接将提高分辨率和速度，优越于任何现在使用的手段。
限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)PCR-RFLP是一种广泛用于检测已知DNA点突变的方法，它可以检测大到几千个碱基对DNA片段。该方法通过分析核酸限制性内切酶切割经目标模板PCR扩增的DNA片段上突变基因位点的有效性来分析DNA点突变。PCR-RFLP的分析可以利用CGE或ESCE，可以利用UV检测或LIF检测。ESCE被用在PCR-RFLP中检测病毒种系及分析通常在大量癌症病人和许多白血病衍生型病人中的K-ras locus DNA片段的基因突变位点，CE在分析过程中远优于传统的葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶电泳。
DNA序列分析(DNA sequencing)应用各种突变检测技术检测到的基因突变，最后都需用序列分析才能确定突变类型及突变位置，其效率可以达到100％。但是DNA序列分析需要昂贵的仪器，训练有素的操作人员，操作繁琐，费时长，成本高，不适用于临床检测。
发明内容
本发明目的在于提供一种更有效又简便的靶序列的定性、定量检测同时测定靶序列基因点突变的方法。
本发明主要是根据靶序列上某一个或几个碱基的多态性，在该碱基的上下游设计一对引物，在引物的适当位置分别标记不同的荧光素，两种荧光素之间可以发生荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer，FRET)。并且根据突变碱基的多态性，人为改造或不改造其中一条引物的3’末端的碱基序列，使之与突变碱基形成一个特定的限制性内切酶位点，与野生型碱基则不能形成该限制性内切酶位点，或者相反，即与野生型碱基形成一个特定的限制性内切酶位点，与突变碱基则不能形成该限制性内切酶位点。
该对引物和PCR反应缓冲液，Mg2+溶液，dNTPs，Taq DNA聚合酶和或逆转录酶等成分配制成PCR反应液或RT-PCR反应液，加入从特定的样本中提取的DNA或RNA，在荧光PCR仪器上进行PCR或RT-PCR扩增反应，同时测定荧光值的变化，对样本中是否存在靶序列作出定性或定量判断。如果待测样本中含有靶序列，则荧光值升高，为阳性，如果待测样本中不含有靶序列，则荧光值不升高，为阴性。如果在PCR扩增的同时加入已知量的标准品，则通过比较标准品与待测样本荧光值的变化，可以对待测样本进行定量检测。
PCR结束后，在PCR产物中加入特定的限制性内切酶，保温反应，同时测定荧光值的变化，根据荧光值的变化情况，对靶序列中是否存在点突变作出判断。如果引物设计为与野生型碱基形成特定的限制性内切酶位点，则野生型样本的PCR产物可以被酶切，荧光值发生改变，突变型样本的PCR产物则不能被酶切，荧光值没有改变，反之亦然。
具体实施例方式将本发明应用于乙型肝炎病毒DNA的定性、定量检测及拉米呋啶耐药突变(YMDD基序的突变)的检测。
631 aaa att cct atg gga gtg ggc ctc agt ccg ttt ctc ttg gct cag ttt act agc gcc attK I P M G V G L S P F L L A Q F T S A Itgt tca gtg gtt cgc agg gct ttc ccc cac tgt ttg gct ttt agc gtg gtaC S V V R R A F P H C L A F T V Vttg ggg gcc aag tct gta caa cat ctt gag tcc ctt tat acc gct gtt acc aat ttt ctt ttgtctL G A K S V Q H L E S L Y T A V T N F L L Sttg ggt ata cat tta aac cctL V I H L N P各引物和探针的设计YMDD的靶序列为tttagctatatggatgatgtg如将tatatg设计为catatg，则catatg即为 Nde I酶切位点。可设计引物上游引物MUP5’-1CCATGTTT2GGCTTTT3AGCCAT可在1、2、3等位置的碱基上标记FAM、HEX等发射荧光基团；下游引物MDN5’-4GCCCCCAA5TACCACA6TCATC可在4、5、6等位置的碱基上标记TAMRA、ROX、等可以吸收发射荧光基团FAM、HEX等发出的能量的荧光基团(可称为“受激荧光基团”)。
当用引物MUP、MDN扩增YMDD靶DNA序列时，选用发射荧光基团的激发波长(如FAM，即为495nm)作为激发光、选用受激荧光基团的发射波长(如ROX，即为585nm)进行检测(因FAM和ROX之间会发生FRET)，则可以对YMDD靶序列进行实时定量检测，当样品是阳性时，则会出现一个上升的扩增曲线，同TAQMAN方法一样可以根据Ct值计算出阳性样品的拷贝数。
而上述反应结束后，加Nde I酶及酶切增补液(以使缓冲体系更适合于Nde I反应)，重置于荧光PCR仪或荧光检测仪上后，可以选用FAM的激发波长和FAM的发射波长(520nm)进行检测，如果是YMDD的目标序列，则会出现一个荧光值上升的曲线或显著变化，如果样本是突变株，在YMDD基序处发生了变异，成为YIDD或YVDD基序，则不能被Nde I酶切，荧光值不改变。从而达到PCR-RFLP检测基因序列点突变同样的结果，但十分方便、快速。
同理可以根据YVDD的靶序列tttagctatgtggatgatgtg中的gtggat设计为gtgcac即可在YVDD靶序中引入了Alw44 I酶切位点；根据YIDD靶序列tttagctatattgatgatgtg将tgatga设计为tgatca引入Bcl I酶切位点，从而实现对目标序列的定量检测和突变碱基检测的目的。
权利要求
1.本发明涉及一种同时检测靶基因序列及已知点突变的方法，其特征在于，在按本发明所述的方法设计得到的一对经过人为改造的单荧光标记的引物存在下，在荧光PCR仪中或普通PCR仪加荧光读板机，对从特定样本中提取的DNA或RNA进行PCR或RT-PCR扩增，实现对特定靶序列的定性或定量检测，并同时在扩增产物中引入特定的限制性内切酶位点，通过随后的一个酶切过程，检测酶切过程中荧光值的变化，实现对靶序列上已知点突变的检测；所述的一对单荧光标记引物的设计原则及实验过程如下(1).这对单荧光素标记的引物，即上下游引物，引物长度在15～30碱基之间，分别与靶序列的负义链和正义链互补，一对引物上在不影响DNA链延伸或PCR后酶切的前提下可分别在任意位置标记不同的荧光素，两种荧光素之间能发生荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer，FRET)。(2).这对引物与靶序列互补后，其3’端之间间隔1个碱基以上，相距长度以在扩增过程中引入点突变碱基和保证荧光基团间有荧光共振能量转移(FRET)为原则。(3).其中任意一条引物的3’末端根据发生点突变碱基的多态性引入或不引入人为改造的碱基，使之和突变碱基或野生型碱基形成一个特定的限制性内切酶位点，反之，该位置野生型碱基或突变碱基则不能形成该特定限制性内切酶位点。根据点突变碱基的多态性，针对不同的靶序列，对不同的引物3’末端进行不同的改造，使之形成不同的限制性内切酶位点。(4).根据上述原则设计的单荧光素标记的引物，和PCR反应缓冲液，Mg2+溶液，dNTPs，Taq DNA聚合酶或Taq DNA聚合酶/逆转录酶等成分配制成PCR反应液或RT-PCR反应液，加入从特定的样本中提取的DNA或RNA，在荧光PCR仪器上进行PCR或RT-PCR扩增反应，同时测定荧光值的变化，对样本中是否存在靶序列作出定性或定量判断。(5).PCR结束后，在PCR产物中加入特定的限制性内切酶，保温反应，同时测定荧光值的变化，根据荧光值的变化情况，对靶序列中是否存在点突变作出判断。
2.根据权利要求1中所述的方法，其特征在于根据此原则设计引物，形成试剂盒，应用于特定靶序列的检测及点突变的检测。
全文摘要
本发明利用独特设计的一对单荧光素标记的引物，在荧光PCR仪器或普通PCR仪加荧光读板机中进行PCR或RT－PCR反应，根据荧光值的变化实现对特定靶序列的定性或定量检测，并同时在扩增产物中引入特定的限制性内切酶位点，通过随后的一个酶切过程，检测酶切过程中荧光值的变化，实现对靶序列上点突变的检测。
文档编号C12Q1/68GK1982470SQ20051010207
公开日2007年6月20日 申请日期2005年12月13日 优先权日2005年12月13日
发明者周荣, 彭涛, 黄茜华, 王海, 张其威 申请人:广州华银医药科技有限公司