专利名称：一种可视薄膜感受器芯片及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，特别涉及可视薄膜感受器芯片的制备及在快速检测和 鉴定生物体中特异核苷酸序列和单核苷酸多态性方面的应用。
背景技术：
在生命科学研究领域，能够快速、准确地鉴定特异核苷酸非常必要。目前，通过鉴 定核苷酸来区分不同物种甚至不同个体已经被运用得非常广泛。海关和政府经常需要检测 生物体或生物制品中遗传成分是否符合相应的法规要求。随着转基因育种的研究和市场化 日益增多，生物体或制品中的外源基因序列检测要求日益升高。为了满足以上种种需求，需 要开发适用性广、价格低、特异性好、使用方便的测定方法。目前已有的鉴定特异核酸序列和多态性的方法可以分为两大类第一个类别是单一检测技术，主要是以PCR为基础的检测。PCR是扩增特定核酸 序列的常用方法，检测扩增核酸序列的基本技术是凝胶电泳，通过凝胶电泳可以粗略地观 察片段的大小及含量(Chiueh, L. C.，Chen, Y. L. and Shih, D. Y. C. (2002) Study on the detection method of six varieties of genetically modified maize and processed foods. J. Food Drug Anal. 10,25-33 ；German, Μ. A. , Kandel-Kfir, Μ. , Swarzberg, D., Matsevitz, T. and Granot, D. (2003)A rapid method for the analysis of zygosity in transgenic plants. Plant Sci. 164,183-187 ；Hoist-Jensen,A. ,Ronning,S. B. ,Lovseth, A. and Berdal, K. G. (2003)PCR technology for screening and quantification of genetically modified organisms (GMOs). Anal. Bioanal. Chem. 375,985-993 ；Miraglia, Μ. , Berdal, K. G. , Brera, C. et al. (2004)Detection and traceability of genetically modified organisms in the food production chain. Food Chem. Toxicol. 42, 1157-1180 ；Su, W. , Song, S. , Long, M. and Liu, G. (2003)Multiplex polymerase chain reaction/membrane hybridisation assay for detection of genetically modified organisms. J. Biotechnol. 105，227-233.)。实时PCR(Real-time PCR)现在被广泛地用来对 核酸进行定量检测，在PCR反应的过程中，通过监测代表扩增结果的荧光信号的量，来实时 跟踪PCR扩增的结果。实时PCR的应用需要特定的仪器及荧光探针，检测快速灵敏，但是价 格昂贵，并且需要严格的质量控制，否则容易产生假阳性的信号Baric，S. and Dalla-Via, J. (2004)Anew approach to apple proliferation detection :a highly sensitive real-time PCR assay. J. Microbiol. Methods,57,135-145 ；Hernandez, M.，Esteve，T.， Prat, S. and Pla，M. (2004)Development of real-time PCR systems based on SYBR Green I， Amplifluor and TaqMantechnologies for specific quantitative detection of the transgenic maize event GA21. J. CerealSci. 39，99—107 ；Shibata，D.，Seki, Μ.， Mitsukawa，N. et al. (1998)Establishment of framework Pl clones for map-based cloning and genome sequencing :direct RFLP mapping of large clones. Gene，225， 31-38 ；Stubner, S. (2002)Enumeration of 16S rDNA of Desulfotomaculum lineagel inrice field soil by real-time PCR with SybrGreenk detection. J. Microbiol. Methods, 50，155-164.)。第二个类别是高通量检测技术，主要是最近发展起来的以微列阵为基础的芯片技 术和高通量测序技术。一般的微列阵芯片可以同时检测大量特定核酸或者是分子标记。挑 选出来的探针被结合在固体介质表面，通过与经过PCR扩增的、并且带有荧光标记的核酸 杂交，来检测与探针互补的核酸序列(Miraglia，Μ.，Berdal，K. G.，Brera, C. et al. (2004) Detection and traceability of genetically modified organisms in the food production chain. FoodChem. Toxicol. 42,1157-1180 ；Li, L. , Wang, X. , Xia, Μ. , Stole, V. , Su, N. , Peng, Ζ. , Li, S. , Wang, J. , Wang, X. and Deng, X. W. (2005)Tiling microarray analysis of rice chromosome IOto identify the transcriptome and relate its expression to chromosomal architecture. Genome Biol. 6 (6), R52Epub. ；Li, L. , Wang, X.,Stole,V. et al. (2006)Genome-wide transcription analyses in rice using tiling microarrays. Nat. Genet. 38，124-129.)。高通量测序技术是最近发展起来的技术，可以快 速对全基因组完成不同覆盖率的测序(ymi illumina. com)。这一类方法被很多研究领域所 采用，但是它需要昂贵的仪器设备，并且需要经过特殊训练的研究人员来操作，因此限制了 它在广泛的例行检查及普通的实验研究中的应用。可视薄膜感受器芯片是一种经过特殊处理的硅晶片，其结构可分为三层即硅基 质为基底层；上面有一层可视层，一般是绝缘层；在可视层之上涂上便于进行分子反应的T 型聚氨基碱性聚二甲基硅氧烷构成反应层。基底层和可视层构成薄膜硅质基片，涂上反应 层后它可以将分子反应转化为肉眼可见的信号，这个过程主要包括当检测物与反应层分 子发生相互作用时，酶催化反应产物沉积在薄膜表面，改变膜层厚度，通过可视层上下表面 反射的光波长干涉发生改变，最后导致膜表面可见的颜色变化，从而将分子反应转化为肉 眼可见的信号(Sandstrom，Τ.，Steinberg, Μ· & Nygren，H. (1985) Visual detection of organic monomoIecuIar films by interference colorsAppl. Opt. 24，472—479)。中国发明专利ZL 200710109479. 2公开了利用一种金色背景的可视薄膜感受器 芯片对特异核苷酸序列进行检测的方法，本发明是在其基础上的进一步研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新型的可视薄膜感受器芯片，该芯片具有银色背景， 利用其能够快速、准确地检测特异核酸序列和单核苷酸多态性(SNP)。相比于金色背景的可 视薄膜感受器芯片，该新型芯片通过将背景颜色创制成银色，信号与背景的对比更为强烈， 因而检测结果更为清晰。本发明的可视薄膜感受器芯片，包括硅质基片及依次叠加于硅质基片上的 Si3N4薄膜和T型聚氨基碱性聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane-Aminoalkyl T-structure)薄膜，其特征在于，所述 Si3N4 薄膜的厚度为 50_70nm、110-140nm、250_270nm 或320-340nm，所述T型聚氨基碱性聚二甲基硅氧烷薄膜的厚度为10-15nm。进一步的，上述芯片需要做活化处理以能够与核酸结合，首先用多聚苯丙氨酸-赖 氨酸溶液处理芯片获得T型聚氨基碱性聚二甲基硅氧烷薄膜吸收有多聚苯丙氨酸-赖氨 酸的芯片；然后再通过琥珀酰亚氨基烟酸沙星(succinimidyl 6-hydraziniumnicotinatehydrochloride)溶液处理获得的胼衍生的芯片。本发明的可视薄膜感受器芯片的制备方法，包括以下步骤1)在硅质基片表面制作厚度为 50-70nm、110-140nm、250-270nm 或 320-340nm 的
Si3N4薄膜；2) Si3N4薄膜上旋涂10-15nm厚的T型聚氨基碱性聚二甲基硅氧烷，得到未活化的
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心片；3)用多聚苯丙氨酸-赖氨酸处理步骤2)得到芯片，洗净并干燥；4)用琥珀酰亚氨基烟酸沙星溶液处理步骤3)得到的芯片，洗净。上述芯片的制备方法，步骤1)采用低压化学气相沉积法(LPCVD)制作Si3N4薄膜， 通过控制沉积过程，得到特定厚度的Si3N4薄膜，使得硅片表面呈现银色背景。上述芯片的制备方法，步骤3)优选用50μ g/ml多聚苯丙氨酸-赖氨酸溶液浸泡 芯片；步骤4)优选采用含1-10 μ M琥珀酰亚氨基烟酸沙星的ΡΗ8. 2的0. IM硼酸钠溶液浸 泡芯片。本发明的可视薄膜感受器芯片可用于检测特异核苷酸序列，其检测原理与中国专 利200710109479. 2 (授权公共号CN 101096709B)相同，但由于其具有银色背景，相比于中 国专利200710109479. 2所使用的金色背景芯片，信号与背景的对比更为强烈，检测结果更 为清晰。利用本发明的银色背景可视薄膜感受器芯片检测特异核苷酸序列的方法，简要地 讲，先将特异序列的单链寡核苷酸作为捕捉探针通过醛基共价结合于胼衍生的感受器芯片 表面；然后通过生物素标记的PCR产物与感受器表面的捕捉探针杂交，可以鉴定特异的DNA 序列，或者PCR产物与感受器表面的捕捉探针在生物素标记的检测探针和热稳定的连接酶 的混合物中进行杂交反应，可以鉴定位点突变序列(如SNP位点)，只有目标序列与探针 完全匹配的情况下生物素标记的检测探针才能通过连接酶作用共价结合于芯片的表面；最 后，将杂交后的芯片与辣根过氧化物酶标记的生物素抗体温育，再加入辣根过氧化物酶的 底物，如果PCR产物中存在特异性的目标序列，那么芯片的表面会有颜色的变化，银色变为 蓝色或红色，能够被人的裸眼所分辨。整个检测过程在30分钟左右即可完成。这项检测技 术具有准确性好、灵敏度高和特异性强的特点，并且低通量和高通量可自由选择，非常经济
'"S ο利用银色背景可视薄膜感受器芯片检测特异DNA序列的方法包括如下步骤1)将特异序列的单链寡核苷酸探针通过醛基共价结合于胼衍生的可视薄膜感受 器芯片表面，该探针从5’到3’端依次是10-12个碱基的脱氧腺嘌呤残基和35-50个碱基 的与特异DNA序列完全匹配的正向链序列；2) PCR扩增待测样品的目标DNA序列，其中反向引物5’端带有共价结合的生物 素；3)将变性后的PCR产物与芯片进行杂交，洗涤；4)芯片与辣根过氧化物酶(HRP)标记的生物素抗体杂交，洗涤；5)在芯片上加辣根过氧化物酶的底物进行反应，如与四甲基联苯胺室温反应 5min，然后水洗，干燥，观察结果，芯片表面从银色变为蓝色或红色表明样品中含有该特异 DNA序列。
利用银色背景可视薄膜感受器芯片检测特异DNA位点(SNP位点或点突变)的方 法包括如下步骤1)将一对特异序列的单链寡核苷酸捕捉探针Pl通过醛基共价结合于胼衍生的可 视薄膜感受器芯片表面的不同位置，所述Pl探针从5’到3’端依次是10-12个碱基的脱氧 腺嘌呤残基和35-50个碱基组成的序列，两个Pl探针的3’末端碱基分别与SNP或点突变 的不同等位基因相对应，其余的34-49个碱基组成的序列互补于靶基因中相关SNP或点突 变位点一侧的相邻序列；2)合成一个P2探针，P2探针互补于SNP或点突变位点另一侧的相邻序列，其3’ 端有生物素标记，5’端带有磷酸基；3) PCR扩增待测样品的目标DNA序列；4)在共价结合了 Pl探针的芯片上加P2探针和变性后的PCR产物，在热稳定连接 酶的存在下同时进行DNA杂交反应和P1-P2连接反应；5)用0. OlM的NaOH 60°C严格洗涤芯片，然后用0. 1 X SSC溶液室温洗涤芯片；6)芯片与辣根过氧化物酶标记的生物素抗体杂交，洗涤；7)在芯片上加辣根过氧化物酶的底物进行反应，水洗，干燥后观察结果，芯片表面 从银色变为蓝色或红色表明该点样点的Pl探针与样品的SNP位点或点突变相匹配。利用银色背景可视薄膜感受器芯片技术检测生物体特异核苷酸序列和分子标记， 具有下列优点1)结果肉眼可见；2)检测快速、灵敏度高、特异性强；3)不需要昂贵的仪器设备，此方法可应用于任何可进行基本的PCR操作的实验 室；4)相比于金色背景的芯片，信号与背景的对比更为强烈，特别是在出现蓝色等信 号的情况下，银色背景提供了更强的颜色对比，结果更为清晰。本发明的技术可针对任何核苷酸序列的检测进行定制，可以广泛应用于育种及相 关研究、病源微生物检测、转基因生物体及其产品的鉴定、外来植物物种入侵和植物疫情的 快速检测及生物物种资源的快速检测等任何需要进行特异核苷酸序列鉴定的工作中。具体 说来，其应用领域包括但不限于1)商业化的转基因作物2)食品样品中的植物转基因的存在3)单核苷酸多样性4)快速的植物后代基因分型5)检测植物的交叉授粉6)生物物种资源7)食品和环境中的病原体的存在8)任何有机体的基因突变9)转基因动物中转基因的存在总之，本发明提供了一种利用银色背景可视薄膜感受器芯片检测有机体或环境中 特异核苷酸序列的新方法，该方法的突出优点是采用了银色背景的可视薄膜感受器芯片，使得实验结果肉眼可见，信号与背景对比强烈，并且非常清晰。同时，该方法快速便捷、灵敏 度高、特异性强、应用广泛，具有不同通量适应性，并且与已存在的实验方法相比价格低廉， 无需昂贵的设施和仪器，可以广泛用于可进行普通PCR实验的实验室。这项技术适用于不 同的生物体。
图1是制备完成的银色背景可视薄膜感受器芯片的照片。图2是用银色背景可视薄膜感受器芯片对转基因作物进行检测的结果，其中A、转基因作物多重PCR产物的凝胶电泳检测图；B、不同探针在芯片上的点制示意图；C、多重PCR产物与芯片进行杂交，对转基因作物的转基因元件进行检测的结果照 片。图3是用银色背景可视薄膜感受器芯片对水稻中SNP标记进行检测的结果，其 中A、六组SNP捕捉探针的点样位置示意图，其中M表示正对照，同一个字母的大小写 表示一个SNP位点的两个等位序列(具体位点参见表2)；B、六种不同的水稻品种的SNP基因分型图，该六种水稻分别是#1，9311 ；#2黄莉 占；#3PA64S ；#4黄软占；#5黄秀占；#6五山丝苗。
具体实施例方式下面通过具体实验及其结果进一步说明本发明，但不以任何方式限制本发明的范围。材料与方法1.银色背景可视薄膜感受器芯片的设计和制作可视薄膜感受器芯片直径10厘米，表面覆盖特定厚度的Si3N4膜层，具体为 50-70nm，110-140nm，250-270nm或者320_340nm四个区间。利用旋转涂布方式在晶片表 面涂布10-15nm T型聚氨基碱性聚二甲基硅氧烷，然后将晶片在50 μ g/ml的多聚苯丙氨 酸_赖氨酸溶液中浸泡1-24小时，使晶片吸收多聚苯丙氨酸-赖氨酸，然后清洗晶片并干 燥。将含有聚苯丙氨酸_赖氨酸的晶片在25毫升含1-10 μ M的琥珀酰亚氨基烟酸沙星的 0. IM硼酸钠(ρΗ8.2)中处理(即浸泡)2小时，去离子水洗干净，备用。在寡核苷酸的5’端 添加醛基修饰。用0. IM硼酸钠(ρΗ7.8)将醛基标记的寡核苷酸稀释为不同浓度，取适量点 样至晶片上。室温(20-25°C )反应2小时后，用去离子水浸洗晶片，60°C浸于0. 1% SDS中 2小时，水洗，干燥。制备好的芯片可以在室温保存6个月。在本发明的具体实验中，对于检测转基因作物中的特异核苷酸序列，PCR引物来自 于三个转基因作物转基因木瓜、水稻TT51、水稻03061，序列如表1所示。反向引物的5’ 端标记有生物素用来显示结果。捕捉探针的5’端有醛基修饰，可以与薄膜上的胼基团反应， 从而将捕捉探针固定于芯片上，以10个脱氧腺嘌呤为间隔，连接互补于靶序列的40个核苷 酸。探针由Invitrogen(USA)合成。表1.转基因作物检测中所用PCR引物和捕捉探针的寡核苷酸序列
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权利要求
1.一种可视薄膜感受器芯片，包括硅质基片及依次叠加于硅质基片上的Si3N4薄膜 和T型聚氨基碱性聚二甲基硅氧烷薄膜，其特征在于，所述Si3N4薄膜的厚度为50-70nm、 110-140nm、250-270nm或320-340nm，所述T型聚氨基碱性聚二甲基硅氧烷薄膜的厚度为 10_15nm。
2.如权利要求1所述的可视薄膜感受器芯片，其特征在于，所述T型聚氨基碱性聚二甲 基硅氧烷薄膜吸收有多聚苯丙氨酸-赖氨酸。
3.如权利要求2所述的可视薄膜感受器芯片，其特征在于，该芯片是通过琥珀酰亚氨 基烟酸沙星溶液处理获得的胼衍生的芯片。
4.一种可视薄膜感受器芯片的制备方法，包括以下步骤1)在硅质基片表面制作厚度为50-70nm、110-140nm、250-270nm 或 320-340nm 的 Si3N4 薄膜；2)Si3N4薄膜上旋涂10-15nm厚的T型聚氨基碱性聚二甲基硅氧烷，得到未活化的芯片；3)用多聚苯丙氨酸-赖氨酸处理步骤2)得到的芯片，洗净并干燥；4)用琥珀酰亚氨基烟酸沙星溶液处理步骤幻得到的芯片，洗净。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤1)采用低压化学气相沉积法制作Si3N4薄膜。
6.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤3)用50μ g/ml多聚苯丙氨酸-赖 氨酸溶液浸泡芯片。
7.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤4)采用含1-10μ M琥珀酰亚氨基 烟酸沙星的ΡΗ8. 2的0. IM硼酸钠溶液浸泡芯片。
8.权利要求1所述的可视薄膜感受器芯片在检测特异核苷酸序列中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，通过多聚苯丙氨酸-赖氨酸和琥珀酰亚氨 基烟酸沙星溶液处理所述芯片，获得胼衍生的可视薄膜感受器芯片，然后用其检测特异DNA 序列，包括如下步骤1)将特异序列的单链寡核苷酸探针通过醛基共价结合于胼衍生的可视薄膜感受器芯 片表面，该探针从5’到3’端依次是10-12个碱基的脱氧腺嘌呤残基和35-50个碱基的与 特异DNA序列完全匹配的正向链序列；2)PCR扩增待测样品的目标DNA序列，其中反向引物5’端带有共价结合的生物素；3)将变性后的PCR产物与芯片进行杂交，洗涤；4)芯片与辣根过氧化物酶标记的生物素抗体杂交，洗涤；5)在芯片上加辣根过氧化物酶的底物进行反应，水洗，干燥后观察结果，芯片表面从银 色变为蓝色或红色表明样品中含有该特异DNA序列。
10.如权利要求8所述的应用，其特征在于，通过多聚苯丙氨酸-赖氨酸和琥珀酰亚氨 基烟酸沙星溶液处理所述芯片，获得胼衍生的可视薄膜感受器芯片，然后用其检测SNP位 点或点突变，包括如下步骤1)将一对特异序列的单链寡核苷酸捕捉探针Pl通过醛基共价结合于胼衍生的可视薄 膜感受器芯片表面的不同位置，所述Pl探针从5’到3’端依次是10-12个碱基的脱氧腺嘌 呤残基和35-50个碱基组成的序列，两个Pl探针的3’末端碱基分别与SNP或点突变的不同等位基因相对应，其余的34-49个碱基组成的序列互补于靶基因中相关SNP或点突变位 点一侧的相邻序列；2)合成一个P2探针，P2探针互补于SNP或点突变位点另一侧的相邻序列，其3’端有 生物素标记，5’端带有磷酸基；3)PCR扩增待测样品的目标DNA序列；4)在共价结合了Pl探针的芯片上加P2探针和变性后的PCR产物，在热稳定连接酶的 存在下同时进行DNA杂交反应和P1-P2连接反应；5)用0.OlM的NaOH 60°C严格洗涤芯片，然后用0. IXSSC溶液室温洗涤芯片；6)芯片与辣根过氧化物酶标记的生物素抗体杂交，洗涤；7)在芯片上加辣根过氧化物酶的底物进行反应，水洗，干燥后观察结果，芯片表面从银 色变为蓝色或红色表明该点样点的Pl探针与样品的SNP位点或点突变相匹配。
全文摘要
本发明提供了一种可视薄膜感受器芯片及其制备方法和应用。该芯片是在硅质基片表面制作特定厚度的Si3N4薄膜，使得硅片表面呈现银色背景，进一步旋涂T型聚氨基碱性聚二甲基硅氧烷膜层，并作活化处理而获得的。利用该银色背景的可视薄膜感受器芯片检测特异核苷酸序列和SNP位点(或点突变)，当检测到特异目标序列时，芯片表面会发生肉眼可辨的颜色变化，由银色变为蓝色或红色。这项检测技术快速、准确、低廉、灵敏度高、特异性强，并且低通量和高通量可自由选择，非常经济实惠。相比于金色等背景的可视薄膜感受器芯片，在出现蓝色等信号的情况下，银色背景提供了更强的颜色对比，结果更为清晰。
文档编号C12Q1/68GK102127598SQ20101059480
公开日2011年7月20日 申请日期2010年12月17日 优先权日2010年12月17日
发明者唐达芳, 杨洋, 邓兴旺, 陈浩东 申请人:北京大学