专利名称：一种培育附生兰的方法及专用菌株的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种培育附生兰的方法及专用菌株。
背景技术：
兰科植物是一个特殊的植物类群，是被子植物中最为进化的大科之一。其中，白芨、天麻、石斛等可入药；兜兰、杓兰等极具观赏价值。因此，随着市场的需求增大，野生资源日益遭到严重破坏。在野外，兰花幼苗的生长需要依靠合适的真菌的存在。人们对兰科菌根真菌的了解大部分都通过从成年兰株的根中分离真菌进行室内研究获得。兰科种子极其微小，使得人们对兰科植物从种子萌发到植株出土的地下生活阶段无法进行追踪和调查，因此关于兰科种子萌发的时间动态过程的知识知之甚少。Rasmussen&Whigham首次提出了一种应用于兰科植物生境中的种子原地共生萌发技术。兰科种子原地共生萌发技术即种子诱导技术， 是指将兰科种子装在一特制的袋子中，埋于兰科植株的生境中，一段时间后，回收种子袋观察种子是否萌发，并检验是否有真菌侵染。目前该技术被广泛地应用于兰科菌根真菌的研究中，并得到不断得改进。原生境种子萌发技术能够提供贴近自然的真实数据，原地工作能够调查一些异地所不能研究的问题，如土壤中种子库的动态，菌根真菌的分布与及原生境中真菌的专一性。兰科植物与菌根真菌之间的关系不是高度专一的，这种共生平衡的关系是有条件的，环境条件的改变可能会导致这种平衡关系发生变化。在实施兰科植物的易地保护之前， 应用原地萌发技术进行共生真菌的检测非常必要，实验室的结果并不一定适用于自然环境中。在实施重引入工程时，引入兰花的同时也要引入其相应的共生真菌。菌根是土壤真菌与植物的共生体，它能起到营养交换的作用。兰科植物是典型的菌根植物，在自然条件下，兰科种子依靠菌根真菌提供能量和营养物质进行萌发。兰科种子与特定真菌的结合决定了种子是否能萌发。已有的研究结果还表明，共生真菌有助于提高幼苗移栽后的成活率和生长速度，增加植株对逆境的抵抗能力，维持较低的发病率，增加花的数量和提高花的品质等。石斛属植物，目前已成为世界兰花产业的重要类群，其生产规模接近蝴蝶兰。该属植物集观赏和药用价值为一体，在我国和印度传统医学中，石斛属许多种植物的新鲜或干燥茎收作草药。近年来人们对天然药物的需求急剧增加。由于人工栽培技术没有得到有效的解决，对野生资源的依赖性以及由此带来的破坏性与日俱增。组培苗移栽成活率低是许多兰科植物栽培存在的问题，石斛组培苗移栽后能否成活是人工栽培成功的关键。碎叶蒲桃(Syzygium buxifolium)属于桃金娘科(Myrtaceae)(蒲桃属 Syzygium)。
发明内容
本发明的一个目的是提供一株与兰科植物共生的菌株。
本发明所提供的菌株为假尾孢(Pseudocercospora sp. ) S3，其保藏编号为 CGMCCNo. 4148。假尾孢(Pseudocercospora sp. ) S3CGMCC No. 4148在培育兰科植物中的应用也属于本发明的保护范围。上述应用中，所述兰科植物为石斛属植物；所述石斛属植物为华石斛 (Dendrobiumsinense)。本发明的另一个目的是提供一种培育兰科植物的方法。本发明所提供的培育兰科植物的方法，包括如下步骤将兰科植物种子与假尾孢 (Pseudocercospora sp.) S3 CGMCC No. 4148 共生，得到兰科植物苗。上述培育方法中，所述将兰科植物种子与假尾孢(Pseudocercospora sp.) S3CGMCC No. 4148共培养的方法包括如下步骤将灭菌苔藓固定在树的树皮上，再将灭菌纱布固定在苔藓上，将兰科植物种子的悬浊液喷洒在所述纱布上，再将假尾孢 (Pseudocercospora sp.) S3CGMCC No. 4148的菌剂喷洒在所述喷洒有兰科植物种子的纱布上，使所述假尾孢(Pseudocercospora sp.) S3CGMCC No. 4148与所述兰科植物种子共同生长。上述任一培育方法中，所述兰科植物种子的悬浊液中兰科植物种子的浓度为Img/ ml ；每块纱布上喷洒的兰科植物种子的悬浊液的量为5ml/12cm2 ；上述任一培育方法中，所述将假尾孢(Pseudocercosporasp. ) S3CGMCC No. 4148 的菌剂喷洒在所述纱布上的方法为每三天喷洒一次，共喷洒6-10次，每次喷洒的量为 5ml/12cm2 ；所述喷洒的次数具体为6次、8次或10次。上述任一培育方法中，所述假尾孢(Pseudocercosporasp. ) S3CGMCC No. 4148 的菌剂按照包括如下步骤的方法得到将假尾孢(Pseudocercospora sp.) S3CGMCC No. 4148 用DE培养基培养，取带有菌丝的培养基块，将带有菌丝的培养基块捣碎后与水混合，即得到所述菌剂。上述任一培育方法中，所述捣碎的带有菌丝的培养基块与水的体积比为 1 0-4)，具体为 1 2、1 3 或 1 4。上述任一培育方法中，所述水为无菌水。上述任一培育方法中，所述树为碎叶蒲桃(Syzygium buxifolium)或毛绵杜鹃 (Rhododendron moulmainense)；所述纱布的大小为长 4cmX 宽 3cm。上述任一培育方法中，所述兰科植物为石斛属植物；所述石斛属植物为华石斛 (Dendrobium sinense)。本发明的最后一个目的是提供一种分离内生真菌的方法。本发明所提供的分离内生真菌的方法，包括如下步骤将兰科植物种子播种于培养基质中，培养得到原球茎，从所述原球茎中分离得到内生真菌；所述培养基质为碎叶蒲桃的树皮。本发明菌株对种子萌发和幼苗生长均有明显的促进作用，可作为石斛生长的优良共生菌，还可用于指导濒危物种的保育和兰科植物的园艺栽培生产上，从而极大缓解野生资源的匮乏。在其他兰科植物，尤其是附生兰科植物的保育和规模化繁殖领域中具有广阔的应用前景。
图1为菌株的形态。图2为华石斛原球茎。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中使用的附生兰种子为华石斛(Dendrobium sinense Tang&ffang)的种子，在文献“吴智彪，宋希强，李绍鹏.华石斛内生真菌诱导子对其组培苗生长的影响 (J)，热带作物学报，2006，27 (1)，77-79，，中公开过，公众可从海南大学获得。实施例1、真菌的分离与鉴定一、分离方法从采自海南省霸王岭的野生华石斛分离出菌株，其方法如下1. 1、选取野生长势健壮并生长旺盛的野生华石斛的新鲜营养根，流水冲洗掉根表面腐殖质和杂物。1. 2、在超菌工作台上将根段浸入次氯酸钙溶液中10-iaiiin进行表面灭菌，然后用无菌水冲洗3-4次。1. 3、将根段切成2-3mm长的小段，放置在PDA培养基上，25°C下暗培养，经过一段时间培养后，待菌丝自根段中长成菌落后，挑取菌丝转移至PDA培养基上进行培养纯化。1.4、没有污染，转入指型管内PDA斜面培养基，4°C短期保存待用。每升PDA培养基是由200克去皮土豆，20g蔗糖，20g琼脂粉和IL水制成，PH自然。 将分离得到的菌株与目标苗分别进行共生培养，一定时间后检测该菌株对苗的生长的促进作用的大小(检测如下指标单位时间内苗增加的鲜重、株高、节数、叶片数)，各指标均高于对照组，则确定该菌为益菌。结果得到一株菌，命名为S3.二、鉴定菌株S3在PDA培养基上，菌落黑色，表面为灰白色，背面看有同心圆，菌落生长速度中等。菌丝浅褐色，有分支，未见分生孢子。如图1(A为肉眼观察，B为显微镜观察)。检测该菌株中的ITS rDNA基因，得到的序列如SEQ ID N0:1所示。将该基因序列在ncbi数据库中进行blast比对。比对结果表明，该序列与假尾孢属的序列的相似性为 99%。综合以上鉴定结果，表明该菌株属于假尾孢(Pseudocercospora sp.)。该菌株已于2010年9月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC， 地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为 CGMCC No. 4148，分类命名为假尾孢(Pseudocercospora sp.)。实施例2、华石斛的培养—、华石斛种子的采集及预处理取华石斛成熟且未开裂的果荚。
种子的消毒处理将生长发育良好的成熟且未开裂的果荚放入1. 5% (质量百分含量)次氯酸钙水溶液中13-15min进行表面灭菌，无菌水冲洗3-4次。二、菌剂的制备1、活化将假尾孢(Pseudocercospora)S3 CGMCC No. 4148 接种于 PDA 培养基，25°C下暗培
养活化。PDA培养基制备与现有技术中相同，每升PDA培养基由200克去皮土豆，20g蔗糖，20g琼脂粉和IL水制成，PH自然。2、菌块培养将带有单一纯菌丝的培养基块接种于DE培养基中，在25°C下暗培养15天，得到含有菌株S3CGMCC No. 4148的DE培养基。DE培养基组成为现有技术中常用的培养基。每一升DE培养基具体是由终浓度为110. 98mg/L的CaCl2、终浓度为174. 25mg/L的 K2SO4、终浓度为 123. 24mg/L 的 MgSO4. 7H20、终浓度为 54. 44mg/L 的 KH2PO4、终浓度为 1. 55mg/ L的Η3Β04、终浓度为6. 53mg/L的MnCl. 4H20、终浓度为0. 80mg/L的ZnSO4. 7H20、终浓度为 0. 24mg/L 的 NaMO4. 2H20、终浓度为 52. llmg/L 的 CltlH14N2O8Na2. 2H20、终浓度为 27. 80mg/L 的 FeSO4. 7H20、终浓度为9g/L的可溶性淀粉、终浓度为lg/L的酵母膏、终浓度为8g/L的琼脂和水组成，其最终PH值为6.0。可溶性淀粉购自国药集团化学试剂有限公司，产品目录号为10021318。酵母膏购自国药集团化学试剂有限公司，产品目录号为69024838。3、菌剂的制备取步骤2制备得到的带有菌丝的培养基块，将其捣碎，再将其与无菌水混合，捣碎的菌块与水的体积比为1 2或1 3或1 4。三、培养华石斛方法I 实验组(野外进行)1、将华石斛种子放入水中(其种子如粉尘)，配制成lmg/ml的悬浊液。2、分别以碎叶蒲1 (Syzygium buxifolium)和毛绵杜鹃 (Rhododendronmoulmainense)的树皮为附生载体。3、用少量的消毒过的苔藓附着到选好的树种的树皮上，再将一小块(长km，宽 3cm)网格状涂布(如医用纱布等)附着于苔藓上，用大头钉固定。4、再将lmg/ml的种子悬浊液喷施于每块固定好的纱布上(喷洒量为5ml/12cm2)， 再将菌剂喷施于附有目标种子的纱布上，每三天一次(每次喷洒5ml/12cm2)，共喷施6次， 观察其种子萌发状况。5、每10天观察一次。对照组与实验组方法基本相同，且与实验组同时进行，不同的是不喷施任何菌剂。实验设3次重复，结果取平均数。方法II
实验组方法与方法I中实验组所述方法基本相同，不同的是所用的菌剂中菌块与水的体积比为1 2 ；喷洒菌剂的次数为8次。方法III实验组方法与方法I中实验组所述方法基本相同，不同的是所用的菌剂中菌块与水的体积比为1 4;喷洒菌剂的次数为10次。四、结果方法I的结果如下1、表型实验组苗比对照组苗生长旺盛，叶片宽而翠绿，植株高而健壮。从将种子喷洒于纱布上计起，60-90天后，观察到绿色球形小体(图2，A表示碎叶蒲桃的树皮，B表示毛绵杜鹃的树皮)。2、幼苗鲜重、干重鲜重检测方法将苗清洗干净用棉布吸干植株表面的水直接用电子天平称量。结果经20个月(从向纱布喷洒种子开始计起)的培养后，实验组植株平均鲜重0. 803g ；对照组结果0. 577g。干重检测方法将植株清洗干净后阴干植株表面的水分后放入105°杀青20 30 分钟，然后60 80°烘干至恒重，称重。结果经15个月(从向纱布喷洒种子开始计起) 的培养后，实验组平均干重0. 243g ；对照组植株平均干重0. 185g。3、幼苗植株高度幼苗植株高度自根在茎上着生点到植株的茎尖的长度。经20个月(从向纱布喷洒种子开始计起)的培养后，实验组植株平均高度为4. 23cm。对照组3. 12cm。4、根的数量及长度实验组结果植株根的平均数量为4. 13，平均长度为4. 07cm。对照组结果植株根的平均数量为3. 16，平均长度为2. 67cm。方法II中实验组的结果与方法I中实验组的结果无显著差异。方法III中实验组的结果与方法I中实验组的结果无显著差异。综合上述实验结果表明，经内生真菌液体菌剂处理的幼苗鲜重、干重都增长显著， 说明其有利于大幅度增加植株干物质的积累。该真菌S3能产生较多的新生营养根，植株高而健壮，叶片宽而翠绿，增加了幼苗植株高度，且既增加了根的数量，也增加了根的长度。
权利要求
1.假尾孢(Pseudocercosporasp.) S3，其保藏编号为 CGMCC No. 4148。
2.假尾孢(I^seudocercosporasp.) S3CGMCC No. 4148在培育兰科植物中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述兰科植物为石斛属植物；所述石斛属植物为华石斛(Dendrobium sinense)。
4.一种培育兰科植物的方法，包括如下步骤将兰科植物种子与假尾孢 (Pseudocercospora sp.) S3CGMCC No. 4148 共生，得到兰科植物苗。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述将兰科植物种子与假尾孢 (Pseudocercospora sp.) S3CGMCC No. 4148共培养的方法包括如下步骤将灭菌苔藓固定在树的树皮上，再将灭菌纱布固定在苔藓上，将兰科植物种子的悬浊液喷洒在所述纱布上， 再将假尾孢(Pseudocercospora sp.) S3CGMCC No. 4148的菌剂喷洒在所述喷洒有兰科植物种子的纱布上，使所述假尾孢(Pseudocercospora sp. ) S3CGMCC No. 4148与所述兰科植物种子共同生长。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于所述兰科植物种子的悬浊液中兰科植物种子的浓度为lmg/ml ；每块纱布上喷洒的兰科植物种子的悬浊液的量为5ml/12cm2 ；和/或，所述将假尾孢(Pseudocercospora sp.) S3CGMCC No. 4148的菌剂喷洒在所述纱布上的方法为每三天喷洒一次，共喷洒6-10次，每次喷洒的量为5ml/12cm2 ；所述喷洒的次数具体为6次、8次或10次。
7.根据权利要求4或5或6所述的方法，其特征在于所述假尾孢O^seudocercospora sp.) S3CGMCC No. 4148的菌剂按照包括如下步骤的方法得到将假尾孢(I^seudocercospora sp.) S3CGMCC No. 4148用DE培养基培养，取带有菌丝的培养基块，将带有菌丝的培养基块捣碎后与水混合，即得到所述菌剂；所述捣碎的带有菌丝的培养基块与水的体积比为 1 0-4)，具体为 1 2、1 3 或 1 4。
8.根据权利要求4-7中任一所述的方法，其特征在于所述树为碎叶蒲桃(Syzygium buxifolium)或毛绵杜鹃(Rhododendron moulmainense)；所述纱布的大小为长4cmX宽 3cm。
9.根据权利要求4-8中任一所述的方法，其特征在于所述兰科植物为石斛属植物；所述石斛属植物为华石斛(Dendrobium sinense)。
10.一种分离内生真菌的方法，包括如下步骤将兰科植物种子播种于培养基质中，培养得到原球茎，从所述原球茎中分离得到内生真菌；所述培养基质为碎叶蒲桃的树皮。
全文摘要
本发明公开了一种培育附生兰的方法及专用菌株。本发明所提供的菌株为假尾孢(Pseudocercospora sp.)S3CGMCC No.4148。本发明菌株对幼苗生长有明显的促进作用，可作为石斛生长的优良共生菌，可应用于该植物的园艺栽培生产上。在其他兰科植物，尤其是附生兰科植物的保育和规模化繁殖中具有广阔的应用前景。
文档编号C12N1/14GK102174413SQ20101059466
公开日2011年9月7日 申请日期2010年12月9日 优先权日2010年12月9日
发明者余文刚, 宋希强, 朱国鹏, 李霖明, 钟云芳 申请人:海南大学