专利名称：一种新的犬新孢子虫速殖子的体外培养和染色方法
技术领域：
本发明涉及了一种新的犬新孢子虫速殖子的体外培养和染色方法，属于生命科学领域。
背景技术：
犬新孢子虫是一种胞内寄生性原虫，形态与龚地弓形虫相似，在其全部生活史中可出现数种不同的形态，即速殖子、包囊、卵囊等。它可引起妊娠母畜的流产和死胎，使新生儿患有严重的精神性疾病，给畜牧业造成了巨大的经济损失，危害严重，但迄今尚无理想的防治办法，究其原因就是新孢子虫速殖子在体外较难培养，并且由于速殖子体积较小，在细胞内生长时如果不利用染色方法不容易被观察到或被误诊，而且目前尚没有简单实用的新孢子虫胞内速殖子的染色方法，这不利于该病的快速检测，同时也限制了该病疫苗的研
发明内容
本发明的目的在于提供了一种新的犬新孢子虫速殖子(N. C-I株)的体外培养和染色方法，其培养方法以MCF-7乳腺癌细胞为宿主细胞，当培养成单层细胞细胞后，接种犬新孢子虫速殖子，利用RPIM-1640培养基进行培养，该培养方法简单实用，且培养效果较好。本发明另一目的在于同时提供了一种新的犬新孢子虫速殖子的染色方法，该方法利用吖啶橙进行染色，染色结束后利用普通荧光显微镜即可对染色结果进行观察，整个染色方法操作简便，并且操作时间较短，这对于该病的快速诊断有很高的价值。本发明的技术方案是这样实现的犬新孢子虫速殖子的培养方法，其特征在于培养的具体步骤为首先常规培养MCF-7乳腺癌细胞，当其长成细胞单层后，按104/ml接种 Iml犬新孢子虫；之后用含洲胎牛血清的RPIM-1640培养基进行培养，每天利用倒置显微镜观察胞外新孢子虫速殖子的数目，可看到胞外新孢子虫速殖子的数目从第2天开始缓慢增长，自第3天开始迅速增长，在第4天即可达到顶峰，在第五天显著下降。所述的犬新孢子虫速殖子的染色采用胞内速殖子吖啶橙染色，其具体步骤为新孢子虫速殖子经多聚甲醛固定，吖啶橙染色后经普通荧光显微镜照相观察；MCF-7细胞感染新孢子虫速殖子后，在第三天和第五天分别进行吖啶橙染色；经荧光显微镜观察，在第三天细胞内可直观、清晰地看到大量的速殖子，在第五天可看到细胞和速殖子均显著减少。本发明的积极效果在于该培养方法简单实用，可快速培养新孢子虫速殖子，并且经吖啶橙染色后利用普通荧光显微镜即可快速、直观、清晰的观察到胞内寄生虫。本培养方法与目前常用的培养新孢子虫速殖子的vero细胞相比，可快速大量的培养新孢子虫速殖子。在同等培养条件下，新孢子虫速殖子的数目比在vero细胞中可早一天达到顶峰，并且达到顶峰后速殖子的数目与在vero细胞中顶峰时的数目相当，表明 MCF-7细胞更适于新孢子虫速殖子的生长。每天利用倒置显微镜观察胞外新孢子虫速殖子的数目，可看到胞外新孢子虫速殖子的数目从第2天开始增长，直到第五天胞外速殖子的数目才达到顶峰。并且在第六天时新孢子虫速殖子的数目迅速下降。因此，MCF-7细胞更适于培养新孢子虫速殖子，从而为新孢子虫的相关研究打下坚实的基础。目前，尚没有新孢子虫速殖子染色方法的报道，本发明填补了这一研究空白，从而为新孢子虫病的诊断提供了一种快速有效的方法。如图1所示每天利用倒置显微镜观察胞外新孢子虫速殖子的数目，连续观察6天， 可看到胞外新孢子虫速殖子的数目从第2天开始缓慢增长，自第3天开始迅速增长，在第4 天达到顶峰，在第五天显著下降。如图2所示新孢子虫速殖子在MCF-7细胞和vero细胞中生长曲线的比较(在相同条件下)，可看出在MCF-7细胞中，新孢子虫速殖子的数目在第4天即可达到顶峰，并且高峰期可持续一天，而在vero细胞中第5天才达到顶峰，达到顶峰后速殖子的数目迅速减少，表明MCF-7细胞更适于培养新孢子虫速殖子，可作为培养新孢子虫速殖子的新的宿主细胞。如图3所示，利用普通荧光显微镜观察MCF-7细胞的胞内新孢子虫速殖子 (900X), MCF-7细胞感染新孢子虫速殖子后，在第三天和第五天吖啶橙染色。在488nm下 DNA呈绿色，在568nm下RNA呈红色。第三天在细胞内可看到大量的速殖子，在第五天可看到细胞和速殖子均显著减少(A为第三天的胞内速殖子，B为第五天的胞内速殖子，右边为相应的对照组)。
图1为MCF-7细胞胞外新孢子虫速殖子的生长曲线。图2为本发明新孢子虫速殖子在MCF-7细胞和vero细胞中生长曲线的比较图。图3为本发明实验效果图。
具体实施例方式实施例1
1.犬新孢子虫(N.C-1)的培养方法
1.1 复苏MCF-7细胞，利用RPMI-1640(10%胎牛血清，1%双抗，4mM谷氨酰胺，2. 30mg /ml NaHCO3, 2. 38 mg /ml HEPES (pH 7.2) , 50 U /ml 青霉素，50 mg/ml 链霉素)，于培养箱中37°C、5% CO2环境中继续培养。1. 2在培养好的MCF-7细胞中，接种新孢子虫速殖子，利用培养基RPMI-1640 (2% 胎牛血清，1%双抗，4mM谷氨酰胺，2. 30mg /ml NaHCO3, 2. 38 mg /ml HEPES (pH 7.2) , 50 U /ml青霉素，50 mg/ml链霉素)，于培养箱中37°C、5% CO2环境中继续培养，每天更换新鲜的培养基，并通过倒置相差显微镜(40X10)对每个视野的速殖子进行计数，绘制速殖子在不同细胞中的生长曲线(如图1所示)，可看到约四天速殖子数量即可达到最大值。实施例2
2.吖啶橙染色观察胞内速殖子
新孢子虫速殖子经16%多聚甲醛(12ml多聚甲醛，88ml 二馏水)固定20分钟，PBS (Na2HPO412H20 0.89g，NaCL 2g，KCLO. 06g，KH2PO4 0. 05g，250ml 二溜水)冲洗 2 遍，10% 吖啶橙(IOmg 吖啶橙，100ml PBS)染色 2 分钟，1% triton (triton 1ml，二溜水 99ml)作用；Γ5
分钟，封片后经普通荧光显微镜照相。实验效果如图3所示。
权利要求
1.犬新孢子虫速殖子的培养方法，其特征在于培养的具体步骤为首先常规培养 MCF-7乳腺癌细胞，当其长成细胞单层后，按104/ml接种Iml犬新孢子虫；之后用含洲胎牛血清的RPIM-1640培养基进行培养，每天利用倒置显微镜观察胞外新孢子虫速殖子的数目，可看到胞外新孢子虫速殖子的数目从第2天开始缓慢增长，自第3天开始迅速增长，在第4天即可达到顶峰，在第五天显著下降。
2.犬新孢子虫速殖子的染色采用胞内速殖子吖啶橙染色，其特征在于染色的具体步骤为新孢子虫速殖子经多聚甲醛固定，吖啶橙染色后经普通荧光显微镜照相观察；MCF-7细胞感染新孢子虫速殖子后，在第三天和第五天分别进行吖啶橙染色；经荧光显微镜观察，在第三天细胞内可直观、清晰地看到大量的速殖子，在第五天可看到细胞和速殖子均显著减少。
全文摘要
本发明涉及了一种新的犬新孢子虫速殖子的体外培养和染色方法，其特征在于培养的具体步骤为首先常规培养MCF-7乳腺癌细胞，当其长成细胞单层后，按104/ml接种1ml犬新孢子虫；之后用含2%胎牛血清的RPIM-1640培养基进行培养，每天利用倒置显微镜观察胞外新孢子虫速殖子的数目；染色的具体步骤为新孢子虫速殖子经多聚甲醛固定，吖啶橙染色后经普通荧光显微镜照相观察；该培养方法简单实用，可快速培养新孢子虫速殖子，并且经吖啶橙染色后利用普通荧光显微镜即可快速、直观、清晰的观察到胞内寄生虫。
文档编号C12Q1/02GK102533556SQ201010593980
公开日2012年7月4日 申请日期2010年12月17日 优先权日2010年12月17日
发明者吕强, 宫鹏涛, 张国才, 张楠, 张西臣, 李建华, 李 赫, 杨举 申请人:吉林大学