专利名称：一种检测羊无浆体病原的环介导恒温扩增方法
技术领域：
本发明涉及一种根据羊无浆体(Anaplasma ovis)主要表面蛋白4(MSP4)基因序 列，检测羊无浆体病原的环介导的恒温扩增技术(LAMP)。
背景技术：
羊无浆体病是绵羊和山羊红细胞内专性寄生的由节肢动物传播的立克氏体疾 病。该病在我国的西北地区大量的分布，对养羊业的发展存在着一定的潜在威胁。1912年 Schellhase和Bevan报道在东非发现了寄生于绵羊、山羊的羊无浆体病。羊无浆体的临床 症状较为温和，发病动物常表现为轻微发烧，但对山羊的致病性较强。在我国，自从马良玉 (1982)和丁智彬(1985)分别发现并报道了寄生于我国绵羊和山羊红细胞内的羊无浆体以 来，只有吕文顺等在1989-1990年间对该病进行了较为仔细的研究，确认了该病广泛分布 于我国的大西北，而在这些省份养羊业占据着十分重要的地位。宋步刚等(1989)报道，内 蒙的额济纳旗流行的羊无浆体病的发病率高达40% -50%，死亡率达17%，危害相当严重。 对于其它地区的羊无浆体病的发病率和死亡率，由于缺乏数据，所以难以估计其对养羊业 造成的直接经济损失，但可以肯定该病的存在对我国的养羊业潜在着一定的威胁。无浆体 的病原体外培养一直存在着较大困难，尽管近年来边缘无浆体的体外培养取得了一定的进 展，但羊无浆体的体外培养至今尚未见报道。由于缺乏体外培养系统和实验动物模型。传 统用姬姆萨染色，然后显微镜检查，大多数红细胞内的边缘无浆体和羊无浆体位于细胞的 边缘，而中央无浆体则位于中央。尽管不同病原在红细胞内的位置不同能为显微镜检查提 供有力的证据，但这些检测需要专业人员，而且染虫率低时容易发生漏检，这都成为了传统 诊断该病原的障碍。
发明内容
本发明就是要解决现有技术存在的缺陷，将主要表面蛋白4(MSP4)基因引入到羊 无浆体病的诊断技术中，建立一种检测羊无浆体病原的环介导恒温扩增方法。本发明的技术问题通过下述技术方案实现一种检测羊无浆体病原的环介导恒温扩增方法，以羊无浆体主要表面蛋白4基因 为靶基因，设计了 3对特异性引物，并按一定比例配制成特异性引物反应混合物，所使用的 引物序列如下正向外部上游引物F3 :5，-GTGTTGCACACAGATTTGCC-3，反向外部下游引物B3 :5，-AGGCTTTTGCTTCTCCGG-3’正向内部引物FIP:5’ -GCCCCTGTAGGCTAGCTTTGTGgaattcCCCATATGTGTGTGCCGG-3’反向内部引物BIP:5 ’ -TGGTGGTAGGTGGGTTCTACCAgaattcATGTGCGGGTATGTCCTTG-3’环上游引物LF 5，-TGTCGACAAAGCTAGCACC-3，
环下游引物LB :5，-CGGACTCTTTGACGAGTCTT-3，所述特异性引物反应混合物包括终浓度为40pmol的FIP和BIP ；终浓度为 20pmol的LF和LB ；终浓度为5pmol的F3和B3。所述检测羊无浆体病原的环介导恒温扩增方法采用下列步骤完成a、恒温扩增羊无浆体病原的环介导恒温扩增即特异性引物反应混合物1. OuL ； 2XLAMP反应缓冲液12. 5uL ；灭菌纯净水9. 5uL ；基因组DNA-阳性或空白样品1. OuL ；Bst DNA聚合酶1. OuL ；共计25uL，在65°C扩增30分钟，80°C灭活2分钟；b、电泳检测用1 X TAE缓冲液配制2 %的琼脂糖凝胶，每孔加入3uL上述LAMP扩 增产物和1. 5uL的6X上样缓冲液，100伏，75安，电泳80分钟，在紫外凝胶成像仪下观察 结果；C、按判断标准判断检测羊无浆体病原。所述扩增反应体系中各组分体积比如下特异性引物反应混合物2XLAMP反应缓冲液灭菌纯净水基因组DNA-阳性 或空白样品Bst DNA聚合酶=1 12. 5 9. 5 1 1。在本反应体系所述特异性引物反应混合物的终浓度为40pmol的FIP和BIP、 20pmol 的 LF 禾口 LB 禾口 5pmol 的 F3 禾口 B3。本发明采用环介导的恒温扩增技术的检测方法，检测羊无浆体病原时不需要复杂 的仪器设备，只需要常规的水浴锅就可以完成检测，可在普通的实验室进行羊无浆体病原 的检测和大规模的流行病学调查，而且可得到具有高敏感性的检测结果。
图1为不同时间LAMP扩增结果电泳图；图2为羊无浆体LAMP方法的特异性结果电泳图；图3为羊无浆体LAMP方法的敏感性结果电泳图。
具体实施例方式本发明的检测方法在1. 5mL的离心管中进行，所使用的引物及试剂如下1)特异引物正向外部上游引物F3 :5，-GTGTTGCACACAGATTTGCC-3，反向外部下游引物B3 :5，-AGGCTTTTGCTTCTCCGG-3’正向内部引物FIP:5’ -GCCCCTGTAGGCTAGCTTTGTGgaattcCCCATATGTGTGTGCCGG-3’反向内部引物BIP:5’ -TGGTGGTAGGTGGGTTCTACCAgaattcATGTGCGGGTATGTCCTTG-3，环上游引物LF 5，-TGTCGACAAAGCTAGCACC-3，环下游引物LB :5，-CGGACTCTTTGACGAGTCTT-3，2)特异性引物反应混合物40pmol的FIP和BIP ；20pmol的LF和LB ；5pmol的F3 禾口 B3。3) 2 X LAMP 反应缓冲液40mM Tris-HCl, pH 8. 8 ；20mM KCl, 16mMMgS04 ；20mM(NH4)2S04 ；0. 2% Tween 20,1. 6 M betaine 和 2. 5mM dNTP。4) Bst DNA 聚合酶M0275L，BioLabs。5)标准羊无浆体阳性基因组DNA。6)标准羊基因组DNA。7)6X上样缓冲液0. 25%溴酚蓝，0. 25%二甲苯青，40%蔗糖水溶液。8) IXTAE 缓冲液0. 04M Tris-乙酸，0. OOlM EDTA09) 2 %琼脂糖用1 X TAE缓冲液配制。实施例1一、标准试样的检测(一 )标准羊无浆体阳性基因组DNA的制备过程用液氮中保存的羊无浆体悬液，在38°C水浴中快速摇振解冻，以2mL红细胞血球 泥(原血染虫率5%)经颈部皮下接种绵羊除脾绵羊。一周后逐日耳尖采血制作血液涂片， 涂片空气干燥后，用甲醇固定，在PBS(pH7. 2)中用10%姬姆萨溶液染色，光学显微镜下观 察，当羊无浆体的染虫率达到高峰时，由颈静脉采集抗凝含虫血，以2000r/min离心lOmin， 弃上层血浆部分，再用等量或更多lOmmol/L Tris-HCl缓冲液轻轻混勻，2000r/min离心 IOmin0用IOmMTris-HCl缓冲液重复洗涤两，洗涤时，用吸管把离心管内的沉淀物吹打均勻 后，4°C下，以2000转/分离心1分钟，然后用注射器抽掉上清液，尽量除去黄血层(白细胞 层)，然后重新加入洗涤液，吹打，离心，如此反复。直到上清液澄明为止。最后一次离心之后 量取红细胞压积。用红细胞压积10倍量的0. 8%的枸橼酸钠来裂解，直到显微镜下80. 0% 的红细胞裂解为止，在裂解好之后，要调回等渗。把裂解好的血液4°C下，以2000转/分离 心15分钟，取上清，弃沉淀。把差速离心后的上清液，4°C下，以6000转/分离心20分钟， 弃上清，留沉淀。沉淀用PH 7. 4的Tris-EDTA悬浮，用吸管吹打均勻，再同上高速离心，如 此反复两次，最后一次在微型台式高速离心机中，以9000转/分离心2分钟，离心结束后， 弃上清，留沉淀，用PH 7. 4的Tris-EDTA缓冲液洗涤2次，收集沉淀就是菌体，_20°C保存备 用。基因组DNA的提取应用基因组提取试剂盒(Gentra)，根据说明书对上述保存的 菌体进行羊无浆体基因组DNA的提取。测定所制备的基因组DNA的浓度，并应用稀释液稀 释成lOOng/uL，_20°C保存备用。( 二)标准羊基因组DNA的制备筛选羊无浆体阴性羊，应用基因组提取试剂盒(Gentra)根据说明书进行基因组 DNA的提取。测定所制备的基因组DNA的浓度，并应用稀释液稀释成lOOng/uL，_20°C保存(三)2 X LAMP反应缓冲液的准备首先用灭菌的超纯水按下表比例配制无dNTP的2X反应缓冲液储存液，可在4°C 保存3个月，-20°C长期保存。
权利要求
一种检测羊无浆体病原的环介导恒温扩增方法，其特征在于以羊无浆体主要表面蛋白4基因为靶基因，设计了3对特异性引物，并按一定比例配制成特异性引物反应混合物，所使用的引物序列如下正向外部上游引物F35’ GTGTTGCACACAGATTTGCC 3’反向外部下游引物B35’ AGGCTTTTGCTTCTCCGG 3’正向内部引物FIP5’ GCCCCTGTAGGCTAGCTTTGTGgaattcCCCATATGTGTGTGCCGG 3’反向内部引物BIP5’ TGGTGGTAGGTGGGTTCTACCAgaattcATGTGCGGGTATGTCCTTG 3’环上游引物LF5’ TGTCGACAAAGCTAGCACC 3’环下游引物LB5’ CGGACTCTTTGACGAGTCTT 3’
2.根据权利要求1所述的一种检测羊无浆体病原的环介导恒温扩增方法，其特征在于 所述特异性引物反应混合物包括终浓度为40pmol的FIP和BIP ；终浓度为20pmol的LF 禾口 LB ；终浓度为5pmol的F3和B3。
3.根据权利要求1和2所述的一种检测羊无浆体病原的环介导恒温扩增方法，其特征 在于采用下列步骤完成a、恒温扩增羊无浆体病原的环介导恒温扩增即特异性引物反应混合物l.OuL; 2XLAMP反应缓冲液12. 5uL ；灭菌纯净水9. 5uL ；基因组DNA-阳性或空白样品1. OuL ；Bst DNA聚合酶1. OuL ；共计25uL，在65°C扩增30分钟，80°C灭活2分钟；b、电泳检测用IXTAE缓冲液配制2%的琼脂糖凝胶，每孔加入3uL上述LAMP扩增产 物和1. 5uL的6X上样缓冲液，100伏，75安，电泳80分钟，在紫外凝胶成像仪下观察结果；c、按判断标准判断检测羊无浆体病原。
4.根据权利要求1所述的一种检测羊无浆体病原的环介导恒温扩增方法，其特征在于 所述扩增反应体系中各组分体积比如下特异性引物反应混合物2XLAMP反应缓冲液灭菌纯净水基因组DNA-阳性或空 白样品BSt DNA 聚合酶=1 12. 5 9. 5 1 1。
5.根据权利要求3和4所述的一种检测羊无浆体病原的环介导恒温扩增方法，其特征 在于在本反应体系所述特异性引物反应混合物的终浓度为40pmol的FIP和BIP、20pmol的 LF 禾口 LB 禾口 5pmol 的 F3 禾口 B3。
全文摘要
本发明公开一种用于检测羊无浆体病原的环介导恒温扩增(LAMP)方法。以羊无浆体主要表面蛋白4基因为靶基因，设计了3对特异性引物，并按一定比例配制成特异性引物反应混合物，在恒温条件下进行DNA扩增。不需要复杂的仪器如PCR扩增仪，只需要常规的水浴锅就可以完成检测，并具有快速、敏感、高特异性和操作简单的特点，在常规的实验室就可以进行该病原的检测。因此，其适合于羊无浆体病原的检测和大规模的流行病学调查，而且可得到具有高敏感性的检测结果。
文档编号C12Q1/68GK101985658SQ20101054286
公开日2011年3月16日 申请日期2010年11月12日 优先权日2010年11月12日
发明者任乔云, 关贵全, 刘军龙, 刘志杰, 刘爱红, 李有爱, 杨志飞, 殷宏, 牛庆丽, 罗建勋, 马朱玲 申请人:中国农业科学院兰州兽医研究所