专利名称：感受态细胞快速转化方法
技术领域：
本发明涉及一种基因转化之方法，特别涉及一种感受态细胞快速转化(transformation)之方法。
背景技术：
大肠杆菌为现代分子生物技术中应用最广之微生物，尤其在分子生物学研究及遗传工程领域皆为不可或缺之宿主细胞，几乎所有生物技术相关之实验室均会利用各种大肠杆菌之遗传突变株作为宿主细胞进行DNA或蛋白质分子之大量复制。将外来之DNA分子导入大肠杆菌宿主细胞之技术就是所谓之“转化”；而经初步处理使其易于吸收外来DNA分子之宿主细胞称之为“感受态细胞(competent cell)”。
由此可知制备感受态细胞及将感受态细胞转化之技术在近代遗传工程上之重要性，此技术之发明可溯自1970年Mandel，M.和Higa A.(J.Mol.Biol.53159-162)发表之CaCl2化学转化方法，经过了近30年之改进，其转化方法之操作时间仍需1.5～3.0小时，主要原因为化学处理之过程对细胞造成一些伤害，需要一个加入培养基之恢复步骤，让转化过程受到伤害之细胞有足够之时间及养分恢复生理机能以产生抗药能力，才可进行涂菌筛选之步骤，否则转化效率将下降数倍。近年有一种快速转化技术称为电穿孔转化法(electroporation)，虽然可利用瞬间电流将DNA分子导入大肠杆菌宿主细胞，但电穿孔处理之细胞仍须加入培养基进行约1小时之恢复步骤才可获得较高之转化效率(Dower et.al.，1988 Nucleic Acids Res.166127-6145)。1988年Golub E.I.(Nucleic Acids Res.161641)发表1分钟之转化方法，虽然舍去加入培养基之恢复步骤，但其效率只能达到104～105转化菌落数/μg质粒DNA。
最近几年益生生技开发股份有限公司研发出一种快速转化技术(中国台湾专利公告号I229696)，可舍去传统上让转化后之大肠杆菌细胞恢复之冗长步骤，且不会降低原来之转化效率。该实施方式为将质粒DNA及大肠杆菌细胞在管中混合、热休克处理，然后将转化后之细胞以较低温度之涂菌工具直接涂布在较低温度之选择培养基上，不须加入非选择性培养基(SOC、LB...)进行恢复之步骤，因而将传统上耗1.5～3.0小时、多步骤之转化程序缩短为几分钟、单管可完成，而又不降低原来之转化效率。然而此种方法虽已改良前有的各种转化方法，但使用时仍须辅以热休克处理用的控温装置，且细胞置于管内加热，可能会受热不匀。因此若能发展出一种舍去让转化后之细胞恢复之冗长步骤、不须使用热休克处理之控温装置、细胞不会受热不匀，而且不会降低原来转化效率的转化方法，将可大大节省进行转化方法时所需之人力、时间及金钱。
发明内容
本发明之目的为提供一种感受态细胞快速转化之方法，其主要特点在于简化热休克处理之步骤、改善细胞受热不均之情形并舍去让转化后之大肠杆菌细胞恢复之冗长步骤，而且不会降低原来转化效率。
转化细胞可从多种微生物制得，而大部分由大肠杆菌之不同菌种制得，例如HB101、DH5α、GM2929、XL1-Blue、TG1、BL21及JM109等。大肠杆菌为现代分子生物技术中应用最广之微生物，尤其在分子生物学研究及遗传工程领域皆为不可或缺之宿主细胞，几乎所有生物技术相关之实验室均会利用各种大肠杆菌之遗传突变株作为宿主细胞进行DNA或蛋白质分子之大量复制。将外来之DNA分子导入大肠杆菌宿主细胞之技术就是所谓之“转化”；而经初步处理使其易于吸收外来DNA分子之宿主细胞称之为“感受态细胞(competent cell)”。
依中国台湾专利公告号I229696之大肠杆菌快速转化方法，是将质粒DNA与大肠杆菌感受态细胞混合，将此混合物以热休克处理，再以低温涂菌工具，将上述混合物涂布于低温选择培养基上，进而进行转化子之选择培养。
本发明除了承续上述方法的优点，尤其是可省略让转化后之细胞恢复之冗长步骤外，更进一步简化了热休克处理的步骤，也就是将质粒DNA与感受态细胞之混合物直接涂布于温度较高的选择培养基上，通过选择培养基的温度直接对细胞进行热休克处理。
本发明提供一种感受态细胞快速转化之方法，其包含下列步骤a.将质粒DNA与感受态细胞混合，形成混合物；b.将该混合物涂布于温热之选择培养基上；及c.在培养基上培养该混合物。
本发明一般可获得大于106转化效率，较佳为大于107以上转化效率，最佳为大于108以上转化效率。
本发明可省略添加培养液之恢复步骤。即不须在涂布于温热之选择培养基前另添加非选择性培养基培养几十分钟。本发明可省略热休克处理步骤。即不须在涂布于温热之选择培养基前进行热休克处理。温热之选择培养基的温度为20℃～50℃，较佳为30℃～44℃，最佳为34℃～40℃。
以涂布于温热之选择培养基之步骤，代替传统以预热好的控温装置进行热休克处理，优点有三(一)省去传统热休克处理的时间，速度更快；(二)不须另外花时间准备预热好的控温装置，实验准备工作更省时省力；(三)细胞被涂布在温度较高的选择培养基上均匀受热，而不是被装在管中从管壁外间接受热，因此接触面积较广且受热较均匀。
根据本发明，在质粒DNA与感受态细胞混合完毕、涂布于温热之选择培养基之前，可还包含一个或多个选自下列步骤将质粒DNA与感受态细胞之混合物置于冰浴处理；及/或将质粒DNA与感受态细胞之混合物以热休克处理。根据本发明，热休克处理之温度为20℃～50℃，较佳为34℃～45℃。
根据本发明，在涂布于温热之选择培养基之后、在培养基上培养该混合物之前，亦可选择性的加入一冷却处理步骤，即将涂布转化细胞后的温热之选择培养基置于冷却环境中降温。该冷却环境为室温、冰浴、冷藏装置、冷冻装置或任何温度低于该温热选择培养基之环境。冷却环境之温度为-35℃～30℃，较佳为-20℃～20℃，更佳为-10℃～10℃。
本发明方法中与转化细胞混合之质粒DNA可为一般质粒DNA或重组质粒DNA，较佳为重组质粒DNA。
本发明中所使用之选择培养基为含抗生素之培养基。
大肠杆菌在分类上属革兰氏阴性菌(gram negative)。目前大部分之革兰氏阴性菌或阳性(gram positive)菌之感受态细胞制备及转化技术乃改良自大肠杆菌之相关技术(Method In Enzymology 20463-113)，故本发明之转化方法可应用于大部分之细菌类(革兰氏阴性菌或阳性菌)之转化技术。在最佳情况下，本发明之感受态细胞由大肠杆菌制备。
由于本发明方法简化以往转化冗长程序，故本发明非常适合进行自动化过程。所以，本发明还提供一种感受态细胞快速转化之装置，其包含a.混合质粒DNA与感受态细胞之元件；b.涂布来自步骤a混合物于温热选择培养基上之元件；及c.在培养基上培养该混合物之元件。
本发明之装置可还包含热休克处理之元件。本发明之装置亦可还包含冷却处理之组件。
本发明感受态细胞快速转化之装置中各元件并未涉及复杂机械装置，可以一般市售商品制造本发明之装置。
以下实施例属非局限性并仅作为在本发明中各种可能及具有特色之代表。
具体实施例方式
实施例1以温选择培养基代替传统热休克处理步骤本实施例中，以益生生技开发公司之ECOS-101感受态细胞(相当于DH5α之菌种，以类似Hanahan D.，1983，J.Mol.Bio.166557-580所述方法制备)及一般传统以CaCl2方法(Mandel，M.，and Higa A.1970，J.Mol.Biol.53159-162)所制备之感受态细胞进行实验。
将菌种DH5α的上述两种细胞对质粒pBR322进行转化。首先将分装成每管100μL之感受态细胞自-30℃冷冻库取出，直接以室温之水浴或自来水冲洗解冻(10～20秒，约解冻1/3)，立刻加入质粒pBR322，强烈振荡0.5～1秒以混合均匀。加入ECOS细胞之质粒浓度为10-5μg/μL，加入以CaCl2方法制备的传统感受态细胞之质粒pBR322浓度为10-5μg/μL。立刻以42℃水浴进行热休克处理2分钟，接着以手指弹打以帮助混合均匀。部分细胞加入900μL非选择性培养基(LB)在37℃培养40分钟之后才涂布于添加抗生素之选择培养基上，另一部分细胞则是直接涂布于添加抗生素之选择培养基上。所使用之选择培养基之温度为4℃或事先预热成37℃，所使用涂菌工具之温度与该组选择培养基之温度相同。结果之转化效率如表一所示表一、经热休克处理后涂布于不同温度的选择培养基之转化效率
结果显示，省略加LB之恢复步骤，所得到的转化效率并无明显差异，ECOS感受态细胞之转化效率仍维持在107～108。此外，即使换成37℃的选择培养基而非一般4℃培养基，对其转化效率影响仍然并不大。
若省略上述实验中之热休克处理步骤，所得结果如表二所示表二、省略热休克处理，涂布于不同温度的选择培养基之转化效率
结果显示，省略42℃水浴之热休克处理步骤，所得到的转化效率并无明显差异，ECOS感受态细胞之转化效率仍维持在107～108。更甚者，若涂布在37℃之选择培养基上，转化效率甚至有更佳的趋势。
实施例2本发明之快速转化法对不同菌株之广泛适用性以实施例1之方法，将ECOS 9-5(相当于JM109之菌种，以类似Hanahan D.，1983，J.Mol.Bio.166557-580所述方法制备)感受态细胞及以CaCl2方法制备的传统感受态细胞对质粒pBR322进行转化，但将菌种改为JM109。结果如表三所示表三、菌种JM109涂布于不同温度的选择培养基之转化效率
此结果显示，本发明之大肠杆菌快速转化方法对大肠杆菌菌种有广泛之适用性。
由以上实施例可看出，发明所披露之方法之应用范围已涵盖目前分子生物学实验所常用之多种感受态细胞。此外，由于本发明之快速转化方法可运用于目前大部分之商业化感受态细胞，将其转化程序由1.5～3.0小时之转化程序缩短为几分钟，甚至几秒钟，而又不降低原来之转化效率，且可省去传统热休克处理的时间，亦不须另外花时间准备预热好的控温装置，而且细胞在温培养基上受热较均匀，因此本发明之广泛应用性(上述实施例)可应用于现有商业化感受态细胞转化程序之改良，进而缩短大部分之商业化感受态细胞之转化程序。
权利要求
1.一种感受态细胞快速转化之方法，其特征是包含下列步骤a.将质粒DNA与感受态细胞混合，形成混合物；b.将该混合物涂布于温热之选择培养基上；及c.在培养基上培养该混合物。
2.根据权利要求1所述之方法，其特征是转化具有大于106效率。
3.根据权利要求1所述之方法，其特征是步骤b之前无热休克处理。
4.根据权利要求1所述之方法，其特征是步骤b之前无添加培养液之恢复步骤。
5.根据权利要求1所述之方法，其特征是温热之选择培养基的温度为20℃～50℃。
6.根据权利要求1所述之方法，其特征是在步骤a与步骤b之间还包含一个或多个选自下列步骤将质粒DNA与感受态细胞之混合物置于冰浴处理；及将质粒DNA与感受态细胞之混合物以热休克处理。
7.根据权利要求1所述之方法，其特征是在步骤b与步骤c之间，将温热之选择培养基置于冷却环境中降温。
8.一种感受态细胞快速转化之装置，其特征是包含a.混合质粒DNA与感受态细胞之元件；b.涂布来自步骤a混合物于温热选择培养基上之元件；及c.在培养基上培养该混合物之元件。
9.根据权利要求8所述之装置，其特征是还包含热休克处理之元件。
10.根据权利要求8所述之装置，其特征是还包含冷却处理之元件。
全文摘要
本发明涉及一种感受态细胞快速转化(transformation)之方法，其包含下列步骤a.将质粒DNA与感受态细胞混合，形成混合物；b.将该混合物涂于温热之选择培养基上；及c.在培养基上培养该混合物。
文档编号C12N15/87GK1772895SQ200510112590
公开日2006年5月17日 申请日期2005年10月12日 优先权日2005年10月12日
发明者陈子智 申请人:益生生技开发股份有限公司