衍生自烟熏调味剂的低味抗微生物剂的制作方法

专利名称：衍生自烟熏调味剂的低味抗微生物剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于食品的抗微生物处理的方法和组合物。更具体而言，本发明涉及熏液衍生物以及使用所述衍生物处理食品以抑制微生物生长但不赋予食品烟熏味的方法。
缩略语表CFU集落形成单位DLS熏液衍生物KSU堪萨斯州立大学LS 熏液MEB麦芽汁培养液MIC最低抑制浓度MOX改良牛津琼脂PDA马铃薯葡萄糖琼脂PW 蛋白胨水RTE即食RTC即烹TSA胰胨豆胨琼脂TSB胰胨豆胨培养液
背景技术：
食品上存在的微生物是重大的公共健康问题。例如食物源性疾病的爆发以及与大肠杆菌(Escherichia coli)的各种菌株有关的死亡常常有报道。实际上，大肠杆菌O157:H7是已知的由食物载有的病原体，已发现其污染未煮熟的牛肉产品，特别是绞细牛肉。
单核细胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)是另一种这样的由食物载有的病原体，其能引起肺炎、脑膜炎和败血症。单核细胞增生利斯特氏菌在肉品加工业中的发生率已引起了罐装业的极大关注，并且认为这是目前的一大健康威胁。因为加工的肉产品上存在的单核细胞增生利斯特氏菌能够在食品上生长并在冷藏条件下增加至致感染剂量，所以该细菌对公众而言具有危险。
鉴于保持食品供应安全的重要性，已采取了各种方法试图杀灭可能在食品上或食品中存在的病原体。在烟熏室中将食品烟熏是一种传统方法。但是这一方法是需要大空间且耗时的方法，因此期望有更高效的方法。
目前用木材烟熏处理食品的方法已基本上被“熏液”的使用所替代，熏液是一种包含液体浓缩物的溶液，所述液体浓缩物能够赋予接触该溶液的液相或气相的肉以烟熏色调或颜色以及烟熏味。除了熏液的这些特性之外，现还已知在肉产品生产中使用的熏液制剂对细菌如单核细胞增生利斯特氏菌具有抗微生物活性。
遗憾的是，虽然在肉加工中熏液的应用可能十分有效地杀灭单核细胞增生利斯特氏菌，但是近期已清楚在肉加工程序中的烹饪与最终包装之间的某一点可能会有发生单核细胞增生利斯特氏菌再接种或再污染的危险。遗憾的是，由再接种引起的即使是非常低水平的细菌污染也可能导致肉产品在商店货架上一段时间后危险的高水平的细菌。
在努力解决这一问题中，肉类加工业对在包装前将熏液直接施用于肉产品以防止单核细胞增生利斯特氏菌在包装的肉产品上再接种以及随后的生长的应用进行了研究。参见Lindner的美国专利5,043,174。因此，在肉加工周期中通过熏液和加热处理在起始阶段杀死细菌或使细菌水平最小化，而在包装之前，再次用熏液处理，直接将熏液施用于已加工食品的表面以控制肉产品被细菌或其它微生物再接种。
这种方法虽然简单且有效，但却不总是可接受的。因为在常规的肉类包装处理之前向肉产品上施用熏液对肉产品的味道产生负面影响。额外的熏液导致肉产品的烟熏味不期望的过度增强。更重要的是，对于那些本来就不应该有烟熏味的食品而言，用熏液处理该食品将是特别不期望的。因此，解决食品上危险性病原体生长的问题，但却不使得食品基本上不可食用并因而销路不好的方案被继续研究。
那么所需要的就是保留抗微生物活性但却不赋予食品烟熏味的熏液衍生物。为满足这一需要，本发明提供熏液衍生物以及使用熏液衍生物处理食品以抑制微生物生长且不改变食品味道的方法。

发明内容
本发明提供抑制食品中微生物生长的方法。在一些实施方案中，所述方法包括用其中抑制微生物生长且不赋予食品烟熏味的熏液衍生物处理食品。在一些实施方案中，所述微生物选自细菌、酵母和真菌。在一些实施方案中，所述细菌选自链球菌属(Streptococcus)、志贺氏菌属(Shigella)、哈夫尼菌属(Hafnia)、肠杆菌属(Enterobacter)、沙雷氏菌属(Serratia)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、大肠杆菌、利斯特氏菌属(Listeria)和沙门氏菌属(Salmonella)的菌株。在一些实施方案中，所述酵母是酵母属(Saccharomyces)的菌株。在一些实施方案中，所述真菌是曲霉菌属(Aspergillus)的菌株。
在本发明的一些实施方案中，所述食品是即食(RTE)食品。在一些实施方案中，所述即食食品包括家禽、猪肉或牛肉。在一些实施方案中，RTE食品包括熟食店肉类(例如火鸡、烤牛肉、火腿、鸡肉、萨拉米香肠、波洛尼亚香肠等)以及热狗。
在本发明的一些实施方案中，所述食品是即烹(RTC)食品。在一些实施方案中，所述即烹食品包括家禽、猪肉、牛肉或煎烤的(par-baked)面团产品。在一些实施方案中，即烹食品包括绞细牛肉或部分焙烤的面团产品如面包和面包卷。
在本发明的一些实施方案中，所述熏液衍生物包含(a)浓度为0至约6％重量/单位体积(w/v)的可滴定酸度；(b)至少约3％重量/单位体积(w/v)的羰基；(c)浓度低于约0.5％重量/单位体积(w/v)的酚；和(d)浓度低于约97％重量/单位体积(w/v)的水。在一些实施方案中，所述熏液衍生物包含浓度为约8.0至约12.0％重量/单位体积(w/v)的羰基，且pH为约5.0至约6.0。在一些实施方案中，所述熏液衍生物包含浓度为约3.0至约8.0％重量/单位体积(w/v)的羰基，浓度为约0.01至0.5％重量/单位体积(w/v)的酚，且pH为约5.0至约6.0。在一些实施方案中，所述熏液衍生物的pH为至少约3.0。在一些实施方案中，所述pH为约4.5至6.5之间。在一些实施方案中，所述熏液衍生物包含至少10％重量/单位体积(w/v)的羰基。
在一些实施方案中，一种熏液衍生物的制备是通过经蒸发器处理熏液以分离并浓缩其中的低沸点成分来制备熏液衍生物。在一些实施方案中，将锯末脱木质素后进行热解来制备低味产物。可以将各种这些产物和衍生物混合在一起得到一系列的羰基水平。可以对它们进行碳处理以大大地降低酚。它们还可以用中和剂处理以调节pH值/酸度。在一些实施方案中，所述熏液衍生物被喷雾在食品上。在一些实施方案中，将食品浸入熏液衍生物浴中。在一些实施方案中，所述熏液衍生物包含另外的润湿剂。在一些实施方案中，所述另外的润湿剂包括聚山梨糖醇酯。
在一些实施方案中，本发明还包括将食品加热至至少约165，保持至少约1分钟。在一些实施方案中，所述加热步骤在处理步骤之后进行。
本发明还提供抗微生物熏液衍生物。在一些实施方案中，所述熏液衍生物(i)包含至少3％重量/单位体积(w/v)的羰基；(ii)当用所述熏液衍生物处理食品时不赋予食品熏液味；和(iii)当用所述熏液衍生物处理食品时抑制该食品上选自以下组中的微生物的生长链球菌属、志贺氏菌属、哈夫尼菌属、肠杆菌属、沙雷氏菌属、葡萄球菌属、假单胞菌属、柠檬酸杆菌属、克雷伯氏菌属、大肠杆菌、利斯特氏菌属、沙门氏菌属、酵母属和曲霉菌属。在一些实施方案中，所述熏液衍生物的pH为约3.0或更高。在一些实施方案中，所述pH为约4.5-6.5之间。在一些实施方案中，所述熏液衍生物包含至少10％重量/单位体积(w/v)的羰基。
在一些实施方案中，所述熏液衍生物包含(a)浓度为0至约6％重量/单位体积(w/v)的可滴定酸度；(b)至少约3％重量/单位体积(w/v)的羰基；(c)浓度低于约0.5％重量/单位体积(w/v)的酚；和(d)浓度低于约97％重量/单位体积(w/v)的水。在一些实施方案中，所述熏液衍生物包含浓度为约8.0至约12.0％重量/单位体积(w/v)的羰基，且pH为约5.0至约6.0。在一些实施方案中，所述熏液衍生物包含浓度为约5.0至约8.0％重量/单位体积(w/v)的羰基，浓度为约0.01至0.5％重量/单位体积(w/v)的酚，且pH为约5.0至约6.0。
在本发明的一些实施方案中，所述食品是即食食品。
在一些实施方案中，即食食品包括家禽、猪肉、牛肉或焙烤的面团产品。在一些实施方案中，即食食品包括熟食店肉类(如火鸡、烤牛肉、火腿、鸡肉、萨拉米香肠、波洛尼亚香肠等)或热狗。
在一些实施方案中，所述食品是即烹食品。在一些实施方案中，所述即烹食品包括家禽、猪肉或牛肉。在一些实施方案中，即烹食品包括绞细牛肉。在一些实施方案中，即烹食品包括部分焙烤的面团产品如面包和面包卷。
在一些实施方案中，所述熏液衍生物还包含另外的润湿剂。在一些实施方案中，所述另外的润湿剂包括聚山梨糖醇酯。
本发明的目的以上已描述，本发明的其它目的和优势对于本领域技术人员而言在研究以下的具体实施方式
和非限制性实施例后将是清楚的。
附图简述

图1描述大肠杆菌8677在补充有熏液1(0.75％)、2(1.00％)、3(1.00％)或8(2.00％)稀释液的胰胨豆胨培养液(TSB)中的生长曲线。所选择的稀释度均低于每种单个熏液衍生物(DLS)的最低抑制浓度(MIC)。
图2描述大肠杆菌8677在补充有浓度在0.00％至0.75％之间的熏液1的胰胨豆胨培养液(TSB)中的生长曲线。
图3描述森夫顿堡沙门氏菌(Salmonella seftenberg)在补充有熏液1(0.50％)、2(1.00％)、3(1.00％)或8(2.00％)稀释液的胰胨豆胨培养液(TSB)中的生长曲线。
图4描述森夫顿堡沙门氏菌在补充有浓度在0.00％至0.50％之间的熏液1的胰胨豆胨培养液(TSB)中的生长曲线。
图5描述无害利斯特氏菌(Listeria innocua)M1在补充有熏液1(0.50％)、2(0.40％)、3(0.50％)或8(2.00％)稀释液的胰胨豆胨培养液(TSB)中的生长曲线。
图6描述无害利斯特氏菌M1在补充有浓度在0.00％至0.75％之间的熏液1的胰胨豆胨培养液(TSB)中的生长曲线。
图7描述酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)在补充有熏液1、2、3和8的0.50％稀释液的麦芽汁培养液(MEB)中的生长曲线。
图8描述酿酒酵母在补充有浓度在0.00％至0.75％之间的熏液1的麦芽汁培养液(MEB)中的生长曲线。
图9描述在熏液1(0.75％)、2(1.25％)、3(1.25％)或8(5.00％)稀释液存在下，第1、3、4和7天时黑曲霉菌(Aspergillus niger)孢子在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)上生长的平均圆周。
图10描述用熏液衍生物(熏液2或熏液3)和基于饱和蒸气的表面巴氏消毒(0、1、2和3分钟)联合处理重新构建的火鸡胸脯对在胰胨豆胨琼脂上计数的单核细胞增生利斯特氏菌生长的影响。集落的数目表示为log10CFU/cm2。
图11描述用熏液衍生物(熏液2或熏液3)和基于饱和蒸气的表面巴氏消毒(0、1、2和3分钟)联合处理重新构建的火鸡胸脯对在改良牛津琼脂(MOX)上计数的单核细胞增生利斯特氏菌生长的影响。集落的数目表示为log10CFU/cm2。
图12描述用熏液衍生物(熏液2或熏液3)和基于饱和蒸气的表面巴氏消毒(0、1、2和3分钟)联合处理重新构建的火鸡胸脯导致的在胰胨豆胨琼脂上计数的单核细胞增生利斯特氏菌生长的集落数目的下降(表示为log10CFU/cm2)。
图13描述用熏液衍生物(熏液2或熏液3)和基于饱和蒸气的表面巴氏消毒(0、1、2和3分钟)联合处理重新构建的火鸡胸脯导致的在改良牛津琼脂(MOX)上计数的单核细胞增生利斯特氏菌生长的集落数目的下降(表示为log10CFU/cm2)。
图14A-14E描述用熏液1处理部分焙烤的午餐面包卷的结果。商购的部分焙烤午餐面包卷在包装上保质期过期的前2天购买。在过期前一天，用30％DLS溶液喷雾，包装并置于室温下。吸收水平为1.5-2％以保证覆盖率。过期日后24小时开始拍照。
图14A描述用DLS处理后1天的部分焙烤午餐面包卷的照片(上面两组)。下面一组描述未处理的阴性对照。图14B描述用DLS处理后2天的部分焙烤午餐面包卷的照片(上面两组)。下面一组描述未处理的阴性对照。图14C描述用DLS处理后3天的部分焙烤午餐面包卷的照片(上面两组)。下面一组描述未处理的阴性对照。图14D描述用DLS处理后4天的部分焙烤午餐面包卷的照片(上面两组)。下面一组描述未处理的阴性对照。图14E描述用DLS处理后1周的部分焙烤午餐面包卷的照片(上面两组)。全部12个面包卷都来自所购买的同一包装。8个处理的面包卷(每图中上面两组)都是用同一DLS同等地处理，并单独包装。4个对照面包卷(图14A-14D中下面一组)未进行处理，置于密闭的塑料袋中。
图15-18描述用低水平(103-104CFU)单核细胞增生利斯特氏菌接种的结果。图15描述用熏液8和熏液3处理已接种约3500CFU单核细胞增生利斯特氏菌的热狗的结果。图16描述用熏液8和熏液3处理已接种约1700CFU单核细胞增生利斯特氏菌的烤牛肉的结果。图17描述用熏液8和熏液3处理已接种约1700CFU单核细胞增生利斯特氏菌的火腿的结果。图18描述用熏液8和熏液3处理已接种约7500CFU单核细胞增生利斯特氏菌的火鸡的结果。
图19-23描述用高水平(105-107CFU)单核细胞增生利斯特氏菌接种的结果。图19描述用熏液8和熏液3处理已接种约1.6×105CFU单核细胞增生利斯特氏菌的热狗的结果。图20描述用熏液8和熏液3处理已接种约2.4×106CFU单核细胞增生利斯特氏菌的烤牛肉的结果。图21描述用熏液8和熏液3处理已接种约3.8×106CFU单核细胞增生利斯特氏菌的火腿的结果。图22描述用熏液8和熏液3处理已接种约1.2×106CFU单核细胞增生利斯特氏菌的火鸡的结果。图23描述熏液2和/或加热处理(在165下1分钟)对在货架保存期内接种的热狗的单核细胞增生利斯特氏菌生长的影响。
具体实施例方式
本申请中引用的所有参考文献，包括专利、专利申请公开和非专利文献均引入本文作为参考，它们补充、解释或教导本文使用的方法、技术和/或组合物或为本文使用的方法、技术和/或组合物提供背景。另外，作为参考文献的还包括下面Moeller和/或Moeller等的美国专利5,637,339、6,214,395、6,261,623、6,541,053。
I.定义除非以下另外定义，本文使用的所有科技术语均与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的意义具有相同的含义。提及本文使用的技术时意指本领域通常理解的技术，包括对于本领域技术人员而言清楚的那些技术或等同技术的替代的变体。尽管认为本领域技术人员很好地理解以下术语，仍给出以下定义以有助于解释本发明。
根据长期以来的专利法规则，术语“一”和“这、那”在本申请包括权利要求书中使用时是指“一个或多个...”。
除非特别说明，本文使用的词“或”是“和/或”的“包含”的意义而不是“或/或”的“排除”的意思。
本文使用的术语“熏液(LS)”是指包含液体试剂的溶液，所述液体试剂能够赋予接触该溶液的液相或气相的食品烟熏色调或颜色和烟熏味。使用熏液在肉类加工中具有很多优势，包括当熏肉时能够实现连续的加工以及如此处理的肉产品更加均一的烟熏味及烟熏色。用熏液代替木材烟熏现在在肉类加工中是常规做法，参考代表性的美国专利3,873,741、4,250,199、4,298,435和5,043,174能更好地理解。
还已发现LS具有抗微生物活性。例如美国专利5,043,174公开了用LS(ZESTI-SMOKE(Code 10)，可从Mastertaste of Crossville，Tennessee，United States of America获得)处理热狗能够防止加工后单核细胞增生利斯特氏菌再接种。但是所使用的LS赋予了所处理的食品很重的烟熏味，而该烟熏味在某些情况下是不期望的。因此，产生保留有抗微生物活性但在处理阶段不赋予食品烟熏味的熏液衍生物将是有利的。这是本文发现、描述并要求保护的方法和组合物的意想不到且令人惊奇的结果。
本文使用的术语“抗微生物活性”通常是指导致杀死微生物(包括但不限于杀微生物活性和微生物溶解活性)或抑制微生物生长(包括但不限于抑微生物活性)的熏液或熏液衍生物的活性。关于抑制微生物的生长，术语“抗微生物活性”意在包括完全抑制(即在DLS存在下微生物完全不生长或以检测不到的速率生长)和部分抑制，后者的特征为微生物生长起始的延迟或微生物生长的速率下降或者两者兼有。
本文使用的术语“熏液衍生物(DLS)”是指具有适用于给定用途的特征的熏液衍生物。DLS通常是熏液的部分，例如通过经蒸发器加工常规的熏液来制备，蒸发器将熏液中低沸点的成分分离并浓缩以制备熏液衍生物溶液。因此，术语“熏液衍生物”、“衍生物”、“熏液部分”和“部分”在本文中可以互换使用，均指从熏液本身进行或不进行后续的另外制备和/或修饰步骤而分离出来的熏液组分。在一些实施方案中，DLS具有抗微生物活性为特征且在被用于处理食品时不赋予食品烟熏味。
本文使用的术语“即食(RTE)”是指准备的以使得立即就可以食用或经加热后即可以食用的食品。RTE食品的实例包括熟食店肉类(如火鸡、烤牛肉、火腿、鸡肉、萨拉米香肠、波洛尼亚香肠等)以及热狗。
RTE食品与即烹食品形成对比。即烹食品通常包括生的、未烹饪食物如家禽、猪肉和牛肉以及部分烹饪/焙烤的食物如部分焙烤的面团产品。即烹食品的实例有家禽、猪肉和牛肉(如绞细牛肉)和部分焙烤的面团产品如面包和面包卷。RTC食品还可以包括水产品、蔬菜和其它经最低加工的食品。
II.从熏液制备熏液衍生物如本领域技术人员所熟知的，从硬木材锯末热解获得的熏液组合物含有主要来自纤维素、半纤维素和木质素的热降解的组分。更具体而言，所述熏液组合物含有宽范围的400多种化合物，因此熏液组合物以某些类化合物，即酸(％可滴定酸度，用美国专利6,214,395中公开的方法测定)、酚和羰基它们的含量为特征。
所述酸是防腐剂和pH控制剂。可商购的熏液组合物通常pH在约2.5以下，更通常在约2.3％以下，％可滴定酸度按体积计算为约3％至约18％。酚赋予熏液组合物烟熏味以及芳香味，其酚含量通常为约10至约45mg/ml，更通常为约14至约30mg/ml。羰基赋予熏液组合物形成棕色的能力。酚和羰基可以通过美国专利4,431,032中所述的方法测定，该专利描述了从熏液组合物中除去不期望的焦油成分的技术。要注意酸和羰基在对熏液组合物的烟熏味的贡献中处于次要的地位。
Mastertaste of Crossville，Tennessee是各种熏液的制造商。熏液的实例包括ZESTI-SMOKE Code 10和ZESTI-SMOKE Code V。这些熏液的详细说明如下Code 10 Code V酸度(％w/v) 10.5-11.0 6.8-7.8染色指数 69-80 无羰基水平(g/100mL) 15-25 2.0-7.0酚水平(mg/mL) 12-22 1.0-4.0比重(25℃)1.068-1.079 1.005-1.015密度(Ibs/gal) 8.90-8.99 8.37-8.46pH2-3 2.0-2.4
颜色琥珀色琥珀色在本发明中用作原料的ZESTI-SMOKE Code V部分可以作为ZESTI-SMOKE Code 10的衍生物或次级产物制备。Code 10可以用分离器(例如AVP蒸发器)经以下步骤处理将Code 10作为原液给料，先将其加热以除去蒸发器上部的低沸点酸，然后浓缩为次级产物Code V。这一处理还产生与常规熏液相比具有更高的酸百分比、染色指数、羰基和酚水平、比重、密度以及更深颜色的浓缩熏液，其由Mastertaste of Crossville，Tennessee以商标SUPERSMOKETM出售，用于各种最终用途。
Code V衍生物是一种低pH、低味、低染色或无染色的产物。在一些实施方案中，然后用合适的pH调节剂如碳酸氢钠、碳酸钠、氢氧化钠或氢氧化钾处理Code V以将pH调节至至少约5.0。可以将pH调节至高达约7.0。在一些实施方案中，pH在约5.0至约6.0之间。可以将调节pH后的材料进一步修饰以制备本文公开的熏液衍生物。
在一些实施方案中，根据Moeller的美国专利5,637,339中公开的方法首先用碳处理Code V衍生物。这除去酚。然后用合适的pH调节剂处理所得产物。任选在用碳处理之前进行pH调节。该已用碳处理、调节过pH的材料还可以用作制备本文使用的熏液衍生物的原料。
在一些实施方案中，锯末热解之前进行脱木质素化以制备低味产物。可以将各种这些产物和衍生物混合在一起得到一系列的羰基水平。可以将它们进行碳处理以大大降低酚水平。它们还可以用中和剂处理以调剂pH/酸度。
在以下所示的实施例中使用各种熏液衍生物测试DLS对细菌、酵母和霉菌的抗微生物活性。
实施例引入以下实施例以例示本发明的方式。以下实施例的某些方面就本发明的发明人发现或考虑的技术或方法方面进行描述以为在实践本发明中起作用。这些实施例例示本发明的发明人的标准实践。根据本文公开内容和本领域的一般技术水平，本领域技术人员将理解以下实施例仅仅是为举例说明，在不偏离本发明范围的前提下可以使用多种变化、修改和改变。
实施例1熏液衍生物的制备熏液1、2和5衍生自通过本文描述的脱木质素和脱酚的各种组合已基本上除去它们的酚含量的薰液的初级浓缩物。熏液3是完全含有酸、羰基和酚的初级熏液浓素物的标准版本。经稀释调节它的浓度使可滴定酸度与其它LS/DLS部分的可滴定酸度相似以便于比较。熏液4是从典型的初级熏液浓缩物析出的不溶性焦油部分的萃取物。它的突出特点是酚浓度高而可滴定酸度和羰基的量较低。加入聚山梨糖醇酯80可以使之为水溶性的。熏液6、7、8和9的制备包括对从初级LS蒸发而来的浓缩物进行各种操作。这些操作调节产物使之具有不同的可滴定酸度、pH和酚水平，而对羰基含量几乎没有或没有影响。
共制备了9种具有概括于表1中的特征的熏液衍生物
表1

*以乙酸定量**以2，6-二甲氧基苯酚定量***以2-丁酮定量实施例2针对革兰氏阴性菌的MIC值将实施例1中的熏液衍生物1-9用于肉汤或琼脂稀释方法中对抗革兰氏阴性菌的混合物。所述混合物包含明斯特沙门氏菌(Salmonellamuenster)、森夫顿堡沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)和大肠杆菌8677。使用每个细菌种的1000个细胞接种所述熏液部分的不同稀释液(稀释液表示为v/v％)。
为测定每个所述部分的最低抑制浓度，然后在试管中对含有不同百分比的熏液衍生物的TSB进行适当的接种。将试管在37℃下温育24小时和48小时，按生长/无生长记分。MIC值以重复三份进行，对于每个重复三次。MIC值显示在表2中。
表2针对革兰氏阴性菌混合物的MIC值

对于针对几种细菌菌株分别选择的熏液衍生物(DLS)在预先测定的MIC水平以下建立生长曲线。图1-4中所示的生长曲线都代表三份重复试验的平均值。
实施例3针对革兰氏阴性菌的MIC值使用实施例2中所述的技术，对于熏液衍生物1-9针对革兰氏阳性菌(无害利斯特氏菌M1)进行测试。MIC值显示在表3中。
表3熏液针对无害利斯特氏菌M1的MIC值

对于针对无害利斯特氏菌的熏液衍生物(DLS)在预先测定的MIC水平以下建立生长曲线。图5-6中所示的生长曲线都代表三份重复试验的平均值。
实施例4针对酵母的MIC值还使用实施例2中描述的技术，对于熏液衍生物(DLS)1、2、3、8对抗酿酒酵母进行测试，只是用麦芽汁培养液(MEB)代替TSB。每个DLS的MIC值都是1.5％。
对于针对酿酒酵母的DLS 1、2、3、8以0.50％建立生长曲线，对于DLS 1以0.25％、0.5％、0.75％建立生长曲线。图7-8中所示的生长曲线都代表三份重复试验的平均值。
实施例5针对代表性真菌的MIC值还使用实施例2中描述的技术，对于熏液衍生物1、2、3、8针对黑曲霉菌进行测试，只是代替向每个DLS稀释液中接种1000个细胞，向马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)中加入等体积的黑曲霉菌孢子。MIC值显示在表4中。
表4熏液针对黑曲霉菌的MIC值

作为生长曲线的替代，测量对于0.75％ DLS 1、1.25％ DLS 2、1.25％ DLS 3以及5.0％ DLS 8，在37℃下处理后1、3、4、7天时黑曲霉菌孢子的圆周。数据显示在图9中。
实施例1-5讨论如本文以上所讨论以及这些图中所示，熏液的组分具有抗微生物特性。尽管不同的熏液浓缩物针对不同的微生物表现有些不同，虽然有些例外，但显示的这些数据表明酸度和pH对MIC值具有一般的相关性。有趣的是，这些数据还表明羰基对于针对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、酵母和真菌的抗微生物活性有贡献。MIC值还可能受一个变量对另一个变量补偿的影响(如羰基与酚，反之亦然)。
实施例6焙烤的面团产品上霉菌的抑制在包装上的过期日前2天购买部分焙烤的午餐面包卷。在过期日前1天，将它们轻微地用30％熏液1溶液喷雾，包装并置于室温下。吸收水平为1.5-2％以保证覆盖率。处理后24小时(即过期日)开始对面包卷进行观察。
结果描述于图14A-14E中。暗色的斑点表明霉菌集落的生长。处理使得保存期延长1周。
实施例7熏液处理的即食(RTE)肉产品对无害利斯特氏菌M1控制的验证使用从制造商处购买的RTE高端(high end)火鸡卷(整个胸部，成形前加入不多于40％的粘合剂和肉汤)和低端(low end)火鸡卷(切碎的火鸡胸部，成形和烹饪前加入至多达60％的粘合剂和肉汤)以及烤牛肉切片测试4周时间内熏液部分控制无害利斯特氏菌M1感染的能力。火鸡产品重量为3.5-4.5kg，在可收缩的烹饪袋(cook-in bag)内在热水中烹煮至内部温度达71℃，然后在水中冷却至内部温度为7℃。每片烤牛肉重约1kg，置于预备好包装的收缩膜包装物中，并作为一个单元使用。将每个火鸡卷切为4截，每截作为一个单元。
从Mastertaste of Crossville，Tennessee，United States of America获得四种不同的熏液衍生物(DLS)。将每种肉产品浸入100％ DLS中，并保持浸入液面下至少60秒。移出后将肉产品在一滤网上室温下风干不少于5分钟，然后用无害利斯特氏菌M1(从North Carolina StateUniversity，Raleigh，North Carolina，United States of America的P.M.Foegeding博士处获得)接种。
对于每片肉，用来自活性生长(18小时)的培养物的50μL 100CFU无害利斯特氏菌M1在每片肉表面上的两块25cm2的面积(使用无菌板用食品级墨水标记)上接种，使总接种物为100CFU/25cm2。然后将每片肉置于CRYOVAC屏障袋(可从CRYOVAC FoodPackaging of Duncan，South Carolina，United States of America处获得)中，真空密封，并置于4℃下。
在4℃下于0、2、4周时对活的无害利斯特氏菌M1进行评价。将标记区无菌地切出并转移至stomacher袋中。加入100mL 0.1％无菌蛋白胨水(PW)，消化(stomach)2分钟。移出等分试样，直接铺板或进行稀释并计数。对活的无害利斯特氏菌M1细胞的计数通过直接螺旋铺板法在AUTOPlATE 4000(可从Spiral Biotech，Inc.ofNorwood，Massachusetts，United States of America处获得)上使用补充有250mg/L链霉素和50mg/mL利福平的DIFCOTMTSA(从DifcoLaboratories，Inc.of Detroit，Michigan，United States of America处获得)进行。每种RTE产品(高端火鸡、低端火鸡和烤牛肉切片)都有三批，每批进行15次测试。每批中有三个样品作为阳性对照(不进行DLS处理)，对于每个取样时间有一个阳性对照。数据表示为每种产品和两洁净(purge)样品上两个指定区的CFU的平均值，显示在表5-7中。
表5低端火鸡卷上的活细胞数


*表示根据the United States Department of Agriculture’s Section36.512的分离单核细胞增生利斯特氏菌的富集方法进行富集后无害利斯特氏菌M1鉴定为阳性。所有测试的其它样品富集后均呈阴性(在时间＝0周时未进行测试)。ND检测不到(低于10CFU/mL)。
表6高端火鸡卷上的活细胞数

*表示根据the United States Department of Agriculture’s Section36.512的分离单核细胞增生利斯特氏菌的富集方法进行富集后无害利斯特氏菌M1鉴定为阳性。所有的其它测试在富集后均呈阴性。-未测定(在第0天时无洁净)。ND检测不到(低于10CFU/mL)。
表7牛腱精肉烤牛肉上的活细胞数

*表示根据the United States Department of Agriculture’s Section36.512的分离单核细胞增生利斯特氏菌的富集方法进行富集后无害利斯特氏菌M1鉴定为阳性。所有其它测试在富集后均呈阴性。ND检测不到(低于10CFU/mL)。
实施例8用低水平单核细胞增生利斯特氏菌接种熟食店肉类后DLS的抗微生物作用使用含有等量的三株单核细胞增生利斯特氏菌(SLR10，1/2a；SLR31，1/2b；和SLR1234，4b Scott A；可从Silliker，Inc.of SouthHolland，Illinois，United States of America处获得)的细菌混合物测试DLS熏液8和熏液2对食品的抗微生物活性。在火腿、烤牛肉、热狗和火鸡样品上接种约1000-10000CFU。用无菌环将接种物涂布在食品的表面，使之干燥15分钟。将每种熟食店肉产品浸入熏液8或熏液2中15秒钟，并用1分钟使多余液体滴下。然后将食品包装在热封包装物中，在4℃下储存。在第0、1、2、5、10、30、60、90和/或120天对各个样品进行分析。对肉本身和任何渗出物都进行检测。图15-18中所示的数据表示每个时间点三份重复样品的平均值。
如图15所示，熏液8和薰液2都抑制了热狗上的利斯特氏菌的生长，显示用熏液2处理的样品在第2天后直至并包括第90天均未检测到利斯特氏菌。用熏液8处理的热狗上的利斯特氏菌滴度直到第30天均下降。
如图16所示，熏液8和薰液2直至并包括第10天均抑制烤牛肉上的利斯特氏菌的生长。
熏液8和薰液2还抑制火腿上利斯特氏菌的生长。如图17所示，对于用熏液8处理的火腿，细菌滴度通常直至第10天均减少。用熏液2处理直至并包括第10天利斯特氏菌的水平均检测不到。
图18显示用熏液8和薰液2处理火鸡的结果。同样，用每种产品导致直至第10天细菌水平均降低或检测不到。
综上所述，用DLS部分熏液8和薰液2处理RTE食品使保存期增加至少10天。
实施例9用高水平单核细胞增生利斯特氏菌接种熟食店肉类后DLS的抗微生物作用重复实施例8中所述的实验，但这次起始接种量为每种食品105至107CFU之间。用单核细胞增生利斯特氏菌接种测试产品。将等份的五种USDA认可的菌龄为12-18小时的利斯特氏菌菌株混合制备利斯特氏菌混合物。为接种测试产品，将0.1mL利斯特氏菌混合物用微量移液器加至食品上。图19-22中所示的数据是每个时间点的三份重复样品。
图19显示接种约105CFU利斯特氏菌的热狗的结果。用熏液8处理到约第10天使细菌滴度降低约一个对数级，其另外又保持约6周。另一方面，熏液2导致到第二天细菌水平为检测不到，其一直保持至第60天。
图20显示用熏液8和薰液2处理接种约106CFU利斯特氏菌的烤牛肉的结果。熏液8处理导致直至第60天细菌生长均受到抑制。熏液2处理导致到第1天细菌滴度就降低一个对数级以上，到第22天时降低两个对数级以上，其持续直至第60天。
图21显示用熏液8和薰液2处理接种约5×106CFU利斯特氏菌的火腿的结果。熏液8处理直至第5天细菌的生长均受到抑制。熏液2处理到第1天细菌滴度降低一个对数级以上，其维持直至第45天。
图22显示用熏液8和薰液2处理接种约106CFU利斯特氏菌的火鸡的结果。熏液8处理到第2天细菌滴度降低大约一个对数级。熏液2处理到第1天细菌滴度降低两个对数级以上，其维持直至第10大。
实施例10100％熏液和热解浓缩物的抗微生物细节将从商业途源购买的热狗用100％熏液(熏液2；Mastertaste)处理和/或进行蒸气巴氏消毒(在165下1分钟)。将热狗在熏液2中浸渍2分钟，用60秒钟使多余的液体滴下。将第二组对照热狗不进行处理。然后用四株单核细胞增生利斯特氏菌的混合物进行接种。将样品真空包装于合适的塑料膜中。将每组(处理和未处理的)热狗的一部分进行加热巴氏消毒步骤(在165下1分钟)。试验为重复三份，并将样品保持在50(纵容温度(abuse temperature))下。图23中所示的结果表明单独加热导致单核细胞增生利斯特氏菌降低2.8个对数级，但其迅速恢复至高水平。这是有趣的，但却并非意料不到，因为保持50的温度是过分纵容的。但是最值得注意的是，尽管高的保持温度，单独用熏液2能够使单核细胞增生利斯特氏菌降低约2个对数级，并保持6周的测试期间。
用熏液和加热联合处理具有与单独加热相似的起始效果。但是熏液处理防止了单独加热时观察到的细菌快速恢复。此外，细菌滴度持续降低直至约第3周，最终降低约7个对数级，并在整个测试期间都保持这一水平。
实施例11的材料与方法接种物的制备将四株单核细胞增生利斯特氏菌(109、108M、血清型4c、血清型3)的混合物用于重新构建的无皮火鸡胸脯的表面接种。通过用5mL试管将斜面培养物连续两次转移至TSB瓶(可从Difco Laboratories，Inc.获得)，然后转移至100mL TSB离心瓶中制备接种物。将固相培养物(20小时)在使用JA-14转子的Beckman J2-21M/E离心仪(可从Beckman Coulter Inc.of Fullerton，Califomia，UnitedStates of America获得)中在4℃下10000g离心10分钟，用无菌0.1％蛋白胨水(PW)洗涤，将四种菌株(约109CFU/mL)等体积(每种50mL)混合，用于喷雾接种。通过使用Whitley螺旋铺板仪(可从Don WhitleyScientific Ltd.，of Shipley，West Yorkshire，England获得)直接在改良牛津琼脂(MOX，可从Oxoid Ltd.，of Basingstoke，Hampshire，England获得)上铺板并在37℃下培养24小时来确定接种物水平。接种后，计数典型黑色集落的数目，接种物水平记录为log10CFU/mL。
产品的接种和处理无菌地除去产品包装，将产品置于托盘中，在生物抑制(bio-containment)的小室内用四种菌株的混合物喷雾接种。将产品放置15分钟，使单核细胞增生利斯特氏菌粘附。需要施用DLS处理的用园艺喷雾器用DLS(50mL/火鸡胸脯)进行喷雾。然后将接种、处理的产品真空包装，在堪萨斯州立大学无菌处理实验室(Manhattan，Kansas，United States of America)的Townsend后处理巴氏消毒器(可从Townsend of Des Moines，Iowa，United States of America获得)中在96℃下巴氏消毒1、2或3分钟。然后将巴氏消毒的产品在冰水浴中冷却15分钟，用表面取心装置取样。
残余单核细胞增生利斯特氏菌的取样巴氏消毒并冷却后，通过无菌地将产品从包装物中取出并在上表面和下表面(每面2次)取心来对接种产品进行取样。然后将表面核心样品与50mL 0.1％ PW在stomacher袋中混合并匀浆(Tckmar Co.of Cincinnati，Ohio，UnitedStates of America)2分钟。然后将匀浆的样品用0.1％ PW系列稀释并铺板于MOX和TSA上。将板在37℃下培养245小时。通过计数MOX和TSA(用于热损伤细胞的恢复)上的典型黑色集落进行计数。计数结果报告为log10CFU/cm2。
实施例11
RTE肉类的DLS/加热联合处理为评价表面接种的单核细胞增生利斯特氏菌被DLS单独或DLS联合饱和蒸气的破坏，使用3×4的实验设计。使用上节题为“实施例11中的材料与方法”部分中所述的三种DLS处理(对照、熏液1和薰液2)和四种加热处理(0、1、2、3分钟)。
对重新构建的火鸡胸脯产品进行喷雾接种使得表面单核细胞增生利斯特氏菌数量为4.17log10CFU/cm2(图10和11)。在Townsend后处理巴氏消毒器中接触饱和蒸气1、2或3分钟分别导致降低1.08、2.01和2.92log10CFU/cm2。接种的火鸡胸脯用DLS进行喷雾处理，与对照组相比，熏液1和2分别导致降低0.94和0.41log10CFU/cm2。熏液1喷雾处理接种的火鸡胸脯产品和之后的接触饱和蒸气导致表面单核细胞增生利斯特氏菌数量降低2.17、2.37、3.57log10CFU/cm2(分别为1、2和3分钟的蒸汽接触)。用熏液2加上蒸气处理观察到类似的降低(2.30、3.11和3.54log10CFU/cm2)。
实施例11讨论尽管加工的火鸡胸脯产品的表面喷雾处理导致单核细胞增生利斯特氏菌数量减少，但是表面熏液施用和表面加热处理的联合比单独使用提供更大的降低(图12和13)。虽然联合处理提供更大的降低，不过用DLS与巴氏消毒1分钟联合处理的产品的平均降低较大。
应理解在不偏离本发明的范围的前提下，可以对本发明的各种细节进行改变。此外，前述内容仅仅是为了例示的目的，而无意限制本发明。
权利要求
1.一种用于抑制食品中微生物生长的方法，所述方法包括用其中抑制微生物生长但不赋予食品烟熏味的熏液衍生物处理所述食品。
2.权利要求1的方法，其中所述微生物选自细菌、酵母和真菌。
3.权利要求2的方法，其中所述细菌是链球菌属(Streptococcus)、志贺氏菌属(Shigella)、哈夫尼菌属(Hafnia)、肠杆菌属(Enterobacter)、沙雷氏菌属(Serratia)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、大肠杆菌(Escherichia coli)、利斯特氏菌属(Listeria)或沙门氏菌属(Salmonella)的菌株。
4.权利要求2的方法，其中所述酵母是酵母属(Saccharomyces)的菌株。
5.权利要求2的方法，其中所述真菌是曲霉菌属(Aspergillus)的菌株。
6.权利要求1的方法，其中所述食品是即食食品。
7.权利要求6的方法，其中所述即食食品包括家禽、猪肉、牛肉、水产品或焙烤的面团产品。
8.权利要求1的方法，其中所述食品是即烹食品。
9.权利要求8的方法，其中所述即烹食品包括家禽、猪肉、牛肉、水产品、新鲜蔬菜或部分焙烤的面团产品。
10.权利要求1的方法，其中所述熏液衍生物包含(a)浓度为0至约6％重量/单位体积(w/v)的可滴定酸度；(b)至少约3％重量/单位体积(w/v)的羰基；(c)浓度低于约0.5％重量/单位体积(w/v)的酚；和(d)浓度低于约97％重量/单位体积(w/v)的水。
11.权利要求10的方法，其中所述熏液衍生物包含浓度为约8.0至约12.0％重量/单位体积(w/v)的羰基，且pH为约5.0至约6.0。
12.权利要求10的方法，其中所述熏液衍生物包含浓度为约3.0至约8.0％重量/单位体积(w/v)的羰基，浓度为约0.01至0.5％重量/单位体积(w/v)的酚，且pH为约5.0至约6.0。
13.权利要求10的方法，其中所述熏液衍生物的pH为至少约3.0。
14.权利要求13的方法，其中所述pH为约4.5-6.5之间。
15.权利要求10的方法，其中所述熏液衍生物包含至少10％重量/单位体积(w/v)的羰基。
16.权利要求10的方法，其中所述熏液衍生物是通过经蒸发器处理熏液以分离并浓缩其中的低沸点成分来制备的。
17.权利要求1的方法，其中将所述熏液衍生物喷雾在所述食品上。
18.权利要求1的方法，其中将所述食品浸入所述熏液衍生物浴中。
19.权利要求1的方法，其还包括将所述食品加热至至少约165，保持至少约1分钟。
20.权利要求19的方法，其中所述加热步骤在所述处理步骤之后进行。
21.权利要求1的方法，其中所述熏液衍生物还包含另外的润湿剂。
22.权利要求21的方法，其中所述另外的润湿剂包括聚山梨糖醇酯。
23.一种抗微生物熏液衍生物，其中所述熏液衍生物(i)包含至少3％重量/单位体积(w/v)的羰基；(ii)当用所述熏液衍生物处理食品时不赋予该食品烟熏味；且(iii)当用所述熏液衍生物处理食品时抑制该食品上选自以下组中的微生物的生长链球菌属、志贺氏菌属、哈夫尼菌属、肠杆菌属、沙雷氏菌属、葡萄球菌属、假单胞菌属、柠檬酸杆菌属、克雷伯氏菌属、大肠杆菌、利斯特氏菌属、沙门氏菌属、酵母属和曲霉菌属。
24.权利要求23的抗微生物熏液衍生物，其中所述熏液衍生物的pH为约3.0或更高。
25.权利要求24的抗微生物熏液衍生物，其中所述pH为约4.5-6.5之间。
26.权利要求23的抗微生物熏液衍生物，其中所述熏液衍生物包含至少10％重量/单位体积(w/v)的羰基。
27.权利要求23的抗微生物熏液衍生物，其中所述熏液衍生物包含(a)浓度为0至约6％重量/单位体积(w/v)的可滴定酸度；(b)至少约3％重量/单位体积(w/v)的羰基；(c)浓度低于约0.5％重量/单位体积(w/v)的酚；和(d)浓度低于约97％重量/单位体积(w/v)的水。
28.权利要求27的抗微生物熏液衍生物，其中所述熏液衍生物包含浓度为约8.0至约12.0％重量/单位体积(w/v)的羰基，且pH为约5.0至约6.0。
29.权利要求27的抗微生物熏液衍生物，其中所述熏液衍生物包含浓度为约5.0至约8.0％重量/单位体积(w/v)的羰基，浓度为约0.1至0.5％重量/单位体积(w/v)的酚，且pH为约5.0至约6.0。
30.权利要求27的抗微生物熏液衍生物，其中所述食品是即食食品。
31.权利要求30的抗微生物熏液衍生物，其中所述即食食品包括家禽、猪肉、牛肉、水产品或焙烤的面团产品。
32.权利要求23的抗微生物熏液衍生物，其中所述食品是即烹食品。
33.权利要求32的抗微生物熏液衍生物，其中所述即烹食品包括家禽、猪肉、牛肉、水产品或部分焙烤的面团产品。
34.权利要求23的抗微生物熏液衍生物，其中所述熏液衍生物包含另外的润湿剂。
35.权利要求34的抗微生物熏液衍生物，其中所述另外的润湿剂包括聚山梨糖醇酯。
全文摘要
本发明提供用于抗微生物处理食品的方法和组合物。更具体而言，本发明提供熏液衍生物以及使用所述衍生物处理食品以抑制微生物生长但不赋予食品烟熏味的方法。
文档编号A23L1/31GK1929753SQ200580007220
公开日2007年3月14日 申请日期2005年1月12日 优先权日2004年1月13日
发明者帕特里克·W.·莫勒, 斯瑞库马尔·拉玛克里希南 申请人:麦斯特味公司