专利名称：具有改良农业性状的转基因植物的制作方法
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本申请要求2004年12月21日美国临时专利申请60/638,099，35USC§119(e)的优先权，此处纳入本文作为参考。
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发明领域 此处公开的发明属于植物遗传学和发育生物学。更为具体地说，发明能提供带有重组DNA的植物细胞以在转基因植物中产生改良性状，这里植物包括了由这些植物而来的细胞、种子和花粉，以及得到这些细胞、植物、种子和花粉的方法。特别是发明中的重组DNA表达的是具有同源异型结构域的转录因子。
背景技术：
具有改良性状，如高产、耐受环境压力、抗虫、抗除草剂、改良种子成分等等，的转基因植物是农业工作者和消费者都渴望获得的。虽然在植物育种上付出的相当努力促使在获得期望性状的工作上取得重要的成就，但是如果能导入特异基因进植物基因组就能有更多的机会产生改良和/或稀有性状的植物。仅仅在植物基因组中导入重组DNA不一定总能获得改良农业性状的转基因植物。从众多转基因事件中筛选各个单独事件的方法是鉴定产生改良农业性状的转基因事件所必需的。
发明概述 本发明使用重组DNA来表达可使转基因植物表现改良农业性状的蛋白。本发明在构建体中提供重组DNA，该重组DNA包括一个在植物细胞中有功能的启动子，该启动子可操纵地连接于编码蛋白的DNA上，被编码的蛋白在序列上具有的氨基酸结构域在与Pfam同源异型框蛋白结构域家族和Pfam HALZ蛋白结构域家族的氨基酸序列比对上超过了Pfam富集中止区。对于同源异型框蛋白结构域家族，Pfam的富集中止区在-4，对于HALZ蛋白结构域家族，Pfam的富集中止区在17。本发明的另一方面特指含有本发明所述DNA的转基因植物细胞、具有多数这类细胞的转基因植物、能产生后代的转基因种子和从这些植物上得到的转基因花粉。这些植物细胞从由重组DNA转化的植物细胞培养出来的一定种群的转基因植物中筛选得到，并表达从这种改良性状种群的转基因植物与不含所述重组DNA的对照组的比较中筛选出来的蛋白。这里的改良性状是从改良性状组包括改良水份的利用效率、改良对寒冷的耐受性、提高产量、提高的氮利用率、改良种子蛋白质和改良种子油脂。
在本发明的另一个方面，植物细胞、植物、种子和花粉还含有能表达蛋白质的DNA，该蛋白质提供暴露于对所述植物细胞野生型致死水平的除草剂的耐受性。这种耐受性不仅仅是作为一种优良的性状同时对本发明中的选择步骤也相当有用。在本发明的各个方面中，这样的除草剂是草甘膦、麦草畏或草铵膦化合物。
而本发明的另一些方面则提供了重组DNA的纯合子转基因植物和本发明从玉米、大豆、棉花、芸苔、苜蓿、小麦或水稻类植物中得到的转基因种子。在阿根廷，在对本发明各方面实践的其它重要实施方案中，重组DNA转导入来源于玉米株系的植物细胞中，使得这种细胞可以抵抗MaI de Rio Cuarto病毒和/或玉米锈病(Puccina sorghi)真菌，或者能维持这种抗性。
本发明也提供生产非天然的转基因种子的方法，因为稳定整合的重组DNA能表达由SEQ ID NO5-8组中筛选出来的一种蛋白质，使该种子能生长出一批具有改良性状的转基因植物。更为具体地说，该方法包括了(a)筛选一个种群的具有一种改良性状和重组DNA的植物，这个种群中的单个植物个体能表现出该性状的程度不低于，基本相当于或大于，未表达重组DNA的对照组所表现这种性状的程度，(b)从这个种群中选出一个或多个能表达该性状程度高于对照组的植物个体，(c)确认重组DNA稳定地整合于所述被选植物中，(d)分析一株被选植物的组织来确定某种蛋白的产量，这种蛋白具有由核酸序列SEQ ID NO1-4编码的蛋白的功能，以及(e)收集被选植物的种子。对本发明的一个方面，种群中的植物还含有表达抗除草剂蛋白的DNA，这种蛋白可以使植物耐受对野生型植物细胞致死剂量的除草剂，当用除草剂，如草甘膦、麦草畏或草铵膦类化合物处理种群时，可以有效地进行选择。另一个方面，还要鉴定植物的改良性状来对植物进行选择。这此方法对获得玉米、大豆、棉花、苜蓿、小麦或水稻种子都特别有用。再有，植物还含有表达第二种可以使植物细胞产生一种或多种改良农业性状的蛋白的DNA。
本发明的另一个方面提供了一种生产杂合玉米种子的方法，包括从抗除草剂玉米植物中获得杂合玉米种子，该玉米植物含有稳定整合的重组DNA，这种重组DNA包含有一个启动子(a)该启动子在植物中能发挥功能，(b)可操纵地连接到编码从SEQ ID NO5-8组中筛选出的蛋白的DNA上；在这里，子代转基因植物是由所述细胞的一个拷贝再生出来的，相对于没有所述DNA结构的对照植物能表现出改良性状；这里所述细胞是从使用所述DNA结构转化的细胞种群中筛选出来，筛选条件是相对于所述对照植物该细胞种群中产生的子代植物具有改良性状，这里所述改良性状是从因为表达了所述蛋白而产生良好水利用率、良好耐冻性、高产、良好氮利用率、良好种子蛋白和脂类含量的性状的种群中筛选出来。这些方法还包括从所述杂合种子来生产玉米植物，在这里一部分由所述杂合玉米种子来源的植物是对所述重组DNA是纯合子，而一部分所述杂合玉米种子来源的植物则对所述重组DNA是半合子，以及还有一部分所述杂合玉米种子来源的植物是不含所述重组DNA；使用除草剂来选择对所述重组DNA是纯合子和半合子的玉米植物；从除草剂处理后存活的玉米植物上收集种子，并将其栽培得到次子代玉米植物；重复筛选和收集步骤至少一次以得到近交系玉米；将近交系玉米与第二种玉米系进行杂交而得到杂合种子。
本发明的另一个方面提供了一种选择本发明中的植物包括植物细胞的方法，即应用免疫反应性抗体来检测在种子和植物组织中是否有重组DNA表达的蛋白生成。另外，本发明还提供用于反假的碎种子，含有本发明的植物细胞作为原始标记。
本发明还有一些方面涉及具有优良水利用率或者氮利用率的转基因植物。比如，本发明提供了无需灌溉种植玉米、棉花或大豆作物的方法，包括种植含有本发明为改良水利用率选择出来的植物细胞的种子。可选择的方法包括减少灌溉水，例如在生物玉米作物时提供多至300毫米地面水。本发明也提供了不加氮肥种植玉米、棉花或大豆作物的方法，包括种植含有本发明为提高的氮利用率选择出来的植物细胞的种子。
发明详述 此处所用的“植物细胞”指一种由稳定整合的、非天然的、重组DNA转化的细胞，例如，由农杆菌介导或用重组DNA包裹的微粒轰击或其它方法造成的转化。本发明中的一个植物细胞能成为一个原始转化植物细胞，该细胞以微生物型式存在或作为能再生成为分化组织的子代植物细胞，如长成具有稳定整合、非天然的重组DNA的转基因植物，或由子代转基因植物产生的种子或花粉。
此处所用的“转基因植物”指基因组被稳定整合的重组DNA所改变的植物。一个转基因植物包括由原始转化植物细胞再生成的植物和从转化植物的后续繁殖或杂交获得的子代转基因植物。
此处所用的“重组DNA”指在细胞外用遗传学计设构建的DNA，包括含有自然存在的DNA或cDNA或合成DNA。
此处所用的“共有序列”指一段在同源蛋白氨基酸序列线性保守区上的人工氨基酸序列，比如，像同源蛋白氨基酸序列的CLUSTALW线性区所确定的序列。
此处所用的“同源体”指在具有相同生物功能的蛋白组群中的一个蛋白，比如属于同一个Pfam蛋白家族并在本发明的转基因植物中造成相同的改良性状的蛋白。同源体是由同源基因表达产生。同源基因包括自然存在的等位基因和人造的变体。遗传密码的简并性使得替换基因的蛋白编码序列中的至少一个碱基时可能不会造成由该基因所产生的多肽的氨基酸序列改变。因此，一个本发明中有用的多聚核苷酸可能具有由SEQ ID NO1到SEQ ID NO4替换简并遗传密码产生的任何碱基序列。同源体指在与某个鉴定为在植物细胞中表达时与表现改良性状有关的蛋白进行全长优化比对时，具有至少60％的一致性，较优选的为70％或者更高，更优选的为至少80％甚至至少90％的一致性的蛋白。同源体包括具有与其中公开的蛋白质和同源体的共有氨基酸序列有至少90％以上一致性的氨基酸序列的蛋白。
同源体通过比对氨基酸序列进行鉴定，比如手工或利用基于计算机的工具通过著名的基于同源性的搜索算法进行比对，如著名和常用的BLAST、FASTA和Smith-Waterman。一个本地的序列比对程序，如BLAST，能用于搜索序列数据库来找到相似的序列，并用简略期望值(E值)来测量碱基序列的相似性。对于特定生物来说，作为具有最佳E值的蛋白命中可能不必要是一个ortholog或只是ortholog，在本发明中应用反查(reciprocal query)来过滤对ortholog鉴定有显著E值命中序列。反查法要求对与被查询的蛋白序列相似的基本生物氨基酸序列数据库搜索显著的命中。当反查的最佳命中就是被查询蛋白本身或是由物种形成后的复制基因编码的蛋白时，一个命中就是一个可能的ortholog。本发明的另一个方面包含了有功能的同源蛋白，作为对保守氨基酸的替换，这些同源蛋白与公开的蛋白相比可能有一个或多个氨基酸的不同，比如以下类型之间的替换酸性(带负电)氨基酸如天门冬氨酸和谷氨酸；碱性(带正电)氨基酸如精氨酸、组氨酸和赖氨酸；中性极性氨基酸如甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天门冬酰胺和谷氨酰胺；中性非极性(疏水性)氨基酸如丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；具有脂肪族侧链的氨基酸如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂肪族羟基侧链的氨基酸如丝氨酸和苏氨酸；带有酰胺侧链的氨基酸如天门冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香族侧链的氨基酸如苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；带有碱性侧连的氨基酸如赖氨酸、精氨酸和组氨酸；带有硫原子的侧链的氨基酸如半胱氨酸和甲硫氨酸；天然保守氨基酸如缬氨酸-亮氨酸，缬氨酸-异亮氨酸，苯丙氨酸-酪氨酸，赖氨酸-精氨酸，丙氨酸-缬氨酸，天门冬氨酸-谷氨酸以及天门冬酰胺-谷氨酰胺。对于本发明中对转基因植物起作用的DNA所编码的同源体，其不同于公开蛋白的另一个方面是由于这些蛋白在天然序列中删去或插入了一个或多个氨基酸。
这里使用的＂一致性百分比＂指两个优化对比的DNA或蛋白质片段在整个组件对比的窗口中的非差异性的程度，如核酸或氨基酸序列。对于一对测试序列和参考序列的对比片段，一个一致性片断是指一致性组件的数量，该组件为两对比片段的序列所共有，按在比对窗上的参考片段中序列组件的总数所划分，该对比窗比全部测试序列或全部参考序列要小一些。一致性百分比(＂一致性％＂)是一致性片断乘以100。
其中使用的＂Pfam＂指多序列对比和覆盖许多普通蛋白家族的隐藏Markov模式的大规模采集，比如Pfam 18.0版本(2005.8)含有7973种蛋白家族的对比和模型，并基于Swissprot 47.0和SP-TrEMBL 30.0的蛋白序列数据库构建。见S.R.Eddy，＂Profile Hidden MarkovModels＂，Bioinformatics 14755-763，1998。现在Pfam协会在负责对Pfam的维持和升级。序列比对体现了保守结构的进化，而这种保守结构则暗示了蛋白质的功能。从Pfam的比对建立起来的状况隐藏Markov模型(profile HMMs)对于自动识别新蛋白在已存在蛋白家族中的归属性非常有用，甚至能用于从比对上显示出同源性非常低的情况。一旦鉴定出一个DNA编码的蛋白在转基因植物中表达，就能让植物表现出改良的性状时，其它编码同一个家族蛋白的DNA就可以通过对隐藏Markov模型查询由候选DNA所编码蛋白的氨基酸序列被鉴定，该模型使用HMMER软件来描述Pfam结构域，在附加计算机列表中提供了HMMER软件的当前版本。在对特殊Pfam比对遇到富集中止时，候选蛋白属于这个蛋白家族并具有同族的DNA，该DNA在构建重组DNA并用于本发明的植物细胞时很有作用。本发明植物细胞中，使用HMMER软件在重组DNA常规Pfam下鉴定表达蛋白的DNA，用到的隐藏Markov模型数据库也包括在附件的计算机列表中。HMMER软件与Pfam数据库的版本是18.0，用该软件和数据库确定了SEQ ID NO5的氨基酸序列有两个Pfam结构域，即同源异型框结构域和HALZ结构域。经鉴定，同源异型框结构域包括了130到193之间的氨基酸残基，得分为70.1，超出富集中止-4。HALZ结构域被鉴定为包括了194到238之间的氨基酸残基，得分为71.9，超过富集中止17。
对于鉴定同源异型框和HALZ结构域的HMMER软件和数据库在任何Pfam网站上都可以得到，也能由申请者提供，如在附加的计算机列表中就有。
此处所用的“启动子”指启动转录的调节DNA。“植物启动子”是指在植物细胞中能够启动转录的启动子，而不管它的来源是不是植物细胞，比如众所周知的农杆菌启动子就是在植物细胞中有功能的。因此，植物启动子就包括了那些从植物、植物病毒、细菌如农杆菌和根瘤菌所得到的启动子DNA。在发育控制下的启动子例子包括了在某些组织如叶、根或种子中优先启动转录的启动子。这类启动子被称为“组织优先”。只有在某种组织中才能启动转录的启动子被称为“组织特异”。“细胞型”特异启动子主要驱动在一种或多种器官中的某种细胞类型的基因表达，如根和叶中的维管细胞。“可诱导”或“可抑制”启动子是指受环境控制的启动子。比如可能影响由可诱导启动子启动转录的环境条件包括缺氧条件、某些化学药物或光照条件。组织特异性、组织优先性、细胞型特异性和可诱导启动子构成了“非组成性”启动子类型。“组成性”启动子是指在大多数环境下都有活性的启动子。
在这里使用的“可操纵地连接”指将两个或更多的DNA片断连接到一个DNA结构中，以便使其中的一个，如编码蛋白的DNA，受控于另一个，如启动子。
此处所用的“表达的”指产生的，如一个蛋白在某个植物细胞中表达，就是指它的DNA转录生成mRNA并翻译成蛋白质。
此处所用的“对照植物”指不含有表达能表现改良性状蛋白的DNA的植物。对照植物用于鉴定和筛选具有改良性状的转基因植物。一个合适的对照植物可以是用于产生转基因植物的亲本系中的未转基因植物，即缺乏重组DNA的植物。合适的对照植物在一些条件下也可能是半合子转基因植物系的子代，该子代不含有重组DNA，比如说阴性分离子。
其中所用的“改良性状”指转基因植物的特性，包括但不仅限于植物形态、生理、生长发育、产出、营养改善、抗病虫害或环境或化学药物耐受性等改良的农业性状。在本发明中的更具体方面，改良性状选自于具有改良性状的种群，包括提高的水利用率、增强的抗冻性、提高产量、提高的氮利用率、改良种子中的蛋白和油脂含量。在本发明的一个重要方面，改良性状是高产量，包括在无压力条件下的高产和在环境压力条件下的高产。压力条件可以包括，如干旱、日照不足、真菌病、病毒病、细菌病、昆虫害、线虫害、低温、高温、渗透压、低氮营养供给、低磷营养供给和高植物密度。“产量”能被很多植物特征所影响，包括无界限、植物高度、结荚数、在植物上的结荚位置、结间数量、结荚的损坏率、粒度、根瘤生成率和固氮率、营养同化效率、耐受生物和非生物的压力、碳同化、植物结构、抗倒伏、种子出芽率、幼苗活力和幼苗性状。产量也能受出芽率(包括在压力条件下的出芽率)、生长速率(包括在压力条件下的生长速率)、麦穗数量、每个麦穗上的种子数量、种子大小、种子成份(淀粉、油脂、蛋白)和种子饱满特征等影响。
本发明中的转基因植物所提高的产量可以用多种方法进行测量，包括测定重量、每株植物的种子数量、种子重量、每单位面积的种子数量(即每英亩地的种子数量或重量)、每英亩产量的蒲式耳数(bu/a)，每英亩产量的公吨数、每英亩产量的吨数、每公顷产量的公斤数。例如，玉米产量可以用每单位生产面积的去壳玉米产量来测定，比如每英亩的蒲式耳数或每公顷的公吨数，通常的报道要基于水分校正，如15.5％的水分。产量提高可能是因为对重要生物化学化合物的利用增加，如氮、磷和碳水化合物，或者是因为改善了对环境压力的反应，如冷、热、干燥、盐份或病虫害。本发明中应用的重组DNA也能用于改善植物的生长发育并最终提高产量，如调整植物生产调节因子的表达、或修改细胞周期或光合作用途径。还有意思的是，转基因植物世代中表现出种子某成分的高产可能会也可能不会与整个植物产量有关。这样的特点包括在种子油脂、种子中的分子如维生素E、蛋白质和淀粉，或者油脂，特别是由于种子成份比例的改变而显示出来的油脂成份的改良。
本发明的一种核酸分子的亚型包括公开的重组DNA片断，该片段是由至少15个，优选至少16或17个，更优选为至少18或19个，甚至再优选为至少20个或以上的连续核苷酸组成的寡核苷酸。这样的寡核苷酸是更大的具有从SEQ ID NO1到SEQ ID NO4组中选择序列的分子的片段，发现能作为如探针和引物来探测本发明的多聚核苷酸。
DNA结构的装配使用了本领域具备普通技能的人员都熟知的方法进行，具代表性结构包括可操纵地连接于DNA上的启动子，而该DNA的表达能表现改良的农业性状。其它的结构组份可包括附加的调节元件，如增强表达的5′前导序列和内含子，3’非翻译区(如多聚腺苷酸信号和位点)，转运或信号肽的DNA。
很多在植物细胞中有活性的启动子在文献中都有描述。它们包括在植物基因组中存在的启动子，以及其它来源的启动子，包括在根癌农杆菌的根癌诱导质粒上胆脂碱合成酶(NOS)启动子和真蛸碱合成酶(OCS)启动子，花椰菜病毒组启动子，如花椰菜花叶病毒。例如，美国专利No.5,858,742和No.5,322,938公开了来自于花椰菜花叶病毒(CaMV35S)组成型启动子的模型，美国专利No.5,641,876公开了水稻肌动蛋白启动子，美国专利申请2002/0192813A1公开了对于设计高效植物表达载体非常有用的5′，3′和内含子元件，美国专利申请系列号08/706,946公开了水稻谷蛋白启动子，美国专利申请09/757,089公开了玉米醛缩酶(FDA)启动子，以及美国专利申请系列号60/310，370公开了玉米nicotianamine合成酶的启动子，以上所有文献其中引入作为参考文献。这些以及其它很多在植物细胞中发挥功能的启动子为本领域技术人员熟知并可用于本发明的多聚核苷酸中使转基因植物细胞中的期望基因得以表达。
在本发明的另外一些方面，期望得到在植物绿色组织中的优选表达。用于这些用途的启动子包括从如拟南芥核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(Rubisco)小亚基(Fischhoff等.(1992)Plant MoI Biol.2081-93)、醛缩酶和丙酮酸磷酸二激酶(PPDK)(Taniguchi等(2000)Plant CellPhysiol.41(1)42-48)基因中得到的启动子。
而且，启动子可以被改变为含有多重“增强子序列”以帮助提高基因表达。这些增强子在本技术领域为人熟知。通过在这样的结构中加入增强子，所选择蛋白的表达量可能会增强。这些增强子通常发现位于在对真核细胞起作用的启动子的5’端到转录起点区域，但常能被插入编码序列的上游(5’)或下游(3’)。在一些例子中，这些5’增强元件是内含子。作为增强子特别有用的是水稻肌动蛋白1(见美国专利5,641,876)和水稻肌动蛋白2基因的5’内含子、玉米乙醇脱氢酶基因内含子、玉米热休克蛋白70基因内含子(美国专利5,593,874)和玉米萎缩1基因。
本发明的另一些方面中，为了有效改善种子组成成分，希望在植物种子组织中实现充分表达。可效仿的用于变更种子组成的启动子包括来源于种子基因的启动子如napin基因(美国专利5,420,034)、玉米L3油质蛋白基因(美国专利6,433,252)、玉蜀黍蛋白Z27基因(Russell等.(1997)Transgenic Res.6(2)157-166)、球蛋白1基因(Belanger等(1991)Genetics 129863-872)、谷蛋白1基因(Russell(1997)supra)和peroxiredoxin antioxidant(Perl)基因(Stacy等.(1996)Plant MoI Biol.31(6)1205-1216)。
按本发明制备的重组DNA结构也通常包括了一个典型含有多聚腺苷酸的信号和位点的3’元件。著名的3’元件包括来自于根癌农杆菌基因的如nos 3’、trnl 3’、tmr 3’、tms 3’、ocs 3’、tr73’之类的3’元件，例如美国专利6,090,627所公开的，其中引入作为参考文献；来自于植物基因的3’元件如来自小麦(Triticum aesevitum)热休克蛋白17(Hsp173)基因、小麦泛素基因、小麦果糖-1，6-二磷酸酯酶基因、水稻谷蛋白基因、水稻乳酸脱氢酶基因和水稻β微管蛋白基因，所有这些基因都在美国出版的专利申请2002/0192813 A1中公开，纳入此处作为参加文献；以及豌豆(Pisum sativum)核酮糖二磷酸羧化酶基因(rbs3′)和来自于宿主植物内基因的3’元件。
基因结构和载体也可以包含导肽以使基因产物定位至植物细胞器，特别是叶绿体、无色体或其它质体细胞器。为阐述叶绿体导肽的作用，请见美国专利No.5,188,642和No.5,728,925，其中纳入作为参考文献。为阐述本发明中有用的拟南芥EPSPS基因导肽区，请见Klee，HJ.等(MGG(1987)210437-442)。
转基因植物，包括或源自于本发明中由重组DNA转化的植物细胞，可由于叠加性状而被进一步改良，例如，一种具有改良性状的玉米植物，由于表达了其中公开的DNA，可兼有抗除草剂和/或抗虫害的性状。例如，本发明的基因可以与其它农业上感兴趣的性状叠加，如能抗除草剂或抗昆虫害的性状，如使用来源于苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringensis)的基因来产生对鳞翅类、coliopteran、同翅类、半翅类和其它昆虫的抗性。转基因植物表现出耐受并在本发明的方法中得以应用的除草剂包括但不仅限于草甘膦、麦草畏、草铵膦、磺酰脲类、溴草腈和达草灭。编码抗除草剂相关蛋白的多聚核苷酸分子在本领域众所周知，包括但不仅限于编码5-烯醇式丙酮基莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)的多聚核苷酸分子，于美国专利5,094,945；5,627,061；5,633,435和6,040,497公开，应用于表现草甘膦抗性。编码草甘膦氧化还原酶(GOX)和草甘膦-N-乙酰转移酶(GAT)的多聚核苷酸分子分别在美国专利5,463,175和美国专利申请公开物2003/0083480 A1中公开，它们也能应用于表现草甘膦抗性；在美国专利申请公开物2003/0135879 A1中公开的麦草畏加单氧酶能表现出麦草畏抗性；美国专利4,810,648公开的编码溴草腈水解酶(Bxn)的多聚核苷酸分子能用于表现溴草腈抗性；编码八氢番茄红素去饱和酶(crtl)的多聚核苷酸分子用于达草灭抗性在Misawa等，(1993)Plant J.4833-840和Misawa等，(1994)Plant J.6481-489的文章中有所阐述；编码乙酰羟酸合成酶(AHAS，okaALS)的多聚核苷酸分子用于表现磺酰脲类除草剂抗性在Sathasiivan等.(1990)Nucl.Acids Res.182188-2193的文章中有所阐述。多聚核苷酸分子如bar基因，在DeBlock，等.(1987)EMSO J.62513-2519文章中公开，可应用于glufosinate和bialaphos抗性；美国专利申请公开物2003/010609 A1公开的多聚核苷酸分子用于表现N-氨基甲基膦酸抗性；美国专利6,107,549公开的多聚核苷酸分子能表现出吡啶除草剂抗性；对于表现对多种除草剂，如草甘膦、阿特拉津、ALS抑制剂、isoxoflutole和glufosinate，抗性使用的分子和方法在美国专利6,376,754和美国专利申请公开物2002/0112260中公开，所有所述美国专利和美国专利申请公开物均纳入此处作为参考文献。对于表现对昆虫/线虫/病毒抗性所用的分子和方法在美国专利5,250,515；5,880,275；6,506,599；5,986,175和美国专利申请公开物2003/0150017 A1中公开，均其中纳入作为参考文献。
在特殊的具体实施方案中，发明者期望使用能与此处公开蛋白结合的抗体，或者是单克隆或者是多克隆。用于制备和特异化抗体的方法在其领域中是熟知的(比如见AntibodiesA Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory，1988，纳入此处作为参考文献)。产生单克隆抗体(mAbs)的方法刚开始时与制备多克隆抗体是一样的。简要地说，多克隆抗体是按照本发明方法用免疫原性化合物免疫动物并从被免疫动物上收集抗血清而制备的。很多种类的动物可以用来制备抗血清。典型的用于生产抗血清的动物有兔子、小鼠、大鼠、仑鼠、豚鼠或山羊。因为兔子有相对大的血容量，所以兔子是生产多克隆抗体的优先选择。
本领域公知给定化合物可能有不同的免疫原性。因此加强刺激宿主免疫系统常常是必要的，可以通过将多肽或多肽抗原偶联在一个载体上达到效果。可作为范例和优选的载体是钉形贝血蓝蛋白(KLH)和牛血清白蛋白(BSA)。其它白蛋白如卵清蛋白、小鼠血清白蛋白或兔血清白蛋白也能被作为载体。偶联多肽和载体蛋白方法在本领域众所周知，包括使用戊二醛、间马来酰亚氨基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯、碳二亚胺和bis-biazotized联苯胺。
本领域也公知，对一个特殊的免疫原组分，其免疫原性可以利用免疫反应的非特异性刺激而被加强，如大家所知的佐剂。可作为范例和优选佐剂包括弗氏完全佐剂(一种免疫反应的非特异刺激物，含有灭活的结核分支杆菌)，弗氏不完全佐剂和氢氧化铝佐剂。
用于生产多克隆抗体的免疫原组分的量可以因免疫原的性质和被免疫动物的不同而变化。免疫原的给药途径也可以不同(皮下注射、肌肉注射、真皮内注射、静脉注射和腹膜注射)。多克隆抗体产量可以在免疫之后不同的时间点采取被免疫动物的血样进行监控。也可以给予二次加强注射。重复加强和滴度测定过程直到得到合适的抗体滴度。当获得期望的免疫程度时，将被免疫动物放血，分离血清并贮存，和/或将该动物用于产生mAbs。
mAbs可以使用熟知的技术很容易地制备，如美国专利No.4,196,265所例举的方法，纳入此处作为参考。典型的这种技术包括使用所选的免疫原组分免疫合适的动物，例如一种纯化的或部分纯化的抗真菌蛋白、多肽或肽。免疫组分用一定方式给药以有效地刺激产生抗体的细胞。啮齿类如小鼠和大鼠是优选动物，而也可能用兔子和绵羊或青蛙细胞。使用大鼠可能有某些优势(Goding，1986，pp.60-61)，但小鼠是优选的，BALB/c小鼠是最优选择，因为它最为常用并通常可产生高比例的稳定融合。
免疫之后，具有产生抗体潜能的体细胞，特别是B淋巴细胞(B细胞)，被筛选出来于mAb生产。这些细胞可以从活体的脾脏、扁桃体或淋巴结中获得，或从外周血中取样。脾细胞和外周血细胞是优选，前者是因为它是抗体生成细胞的富有源，并且这些细胞正处于分化浆母细胞阶段；后者是因为外周血易于获取。通常，一组动物在免疫后，具有最高抗体滴度的脾将被切除下来，用注射器均浆后可得到脾淋巴细胞。典型地说，从一个被免疫老鼠的脾脏中可获得大约5×107到2×108个淋巴细胞。
将来源于被免疫动物的产生抗体的B淋巴细胞与永生的骨髓瘤细胞融合，这种细胞通常来自与被免疫动物同一种类的动物。适合于杂交瘤融合操作的骨髓瘤细胞系，应优选无抗体产生、具有高融合效率和酶缺陷型细胞系，这样在只支持期望的融合细胞(杂交瘤)生长的选择性培养基中，未融合细胞则不能生长。
为本领域的技术人员所熟知，许多骨髓瘤细胞中的任何一种都可用(Goding，1986，pp.65-66；Campbell，1984，pp.75-83)。例如，当使用小鼠作为被免疫动物时，可用P3-X63/Ag8，X63-Ag8.653，NS1/1.Ag41，Sp210-Ag14，FO，NSO/U，MPC-11，MPC11-X45-GTG1.7和S194/5XX0细胞系；对于大鼠，则可用R210.RCY3，Y3-Ag 1.2.3，IR983F和4B210细胞系；而U-266，GM1500-GRG2，LICR-LON-HMy2和UC729-6细胞系则全部用于与人类细胞融合。
一种优选的鼠类骨髓瘤细胞是NS-1骨髓瘤细胞系(也被命名为P3-NS-1-Ag4-1)，该细胞可以很容易地从国立普通医学科学研究所人类遗传变异细胞贮存库获得，索求细胞系贮存号为GM3573。另一种可用的小鼠骨髓瘤细胞系是8-氮杂鸟嘌呤抗性小鼠骨髓瘤细胞非SP2/0生成细胞系。
用于产生抗体生成脾或淋巴结细胞与骨髓瘤细胞的杂合体的方法通常包括，以2:1的比例混合体细胞与骨髓瘤细胞，在有一种或多种促细胞膜融合因子(化学的或电的)的存在下，这个混合比例可以分别从大概20:1到1:1不等。(Kohler和Milstein，1975；1976)文中阐述了使用Spend病毒融合的方法，也有使用聚乙二醇(PEG)，如37％(v/v)PEG的方法(Gefter等，1977)。使用电介导融合的方法也能适用(Goding，1986，pp.71-74)。
融合操作产生的可传代杂合体的几率常常较低，大约1×10-6到1x10-8。但是这并不成什么问题，因为在选择性培养基中培养时，可传代的融合杂合体可以由亲代未融合的细胞分化(特别是未融合的骨髓瘤细胞通常可以继续不定地分裂)而来。一般来说，选择性培养基是含有一种能阻断核苷酸新合成的试剂的组织培养基。可作为范例和优选的试剂是氨喋呤、甲氨喋呤和氮丝氨酸。氨喋呤和甲氨喋呤可同时阻断嘌呤和四氢化吡咯的新合成，而氮丝氨酸只阻断嘌呤合成。当使用氨喋呤和甲氨喋呤时，培养基需补加次黄嘌呤和脱氧胸苷作为核苷酸来源(HAT培养基)。当使用氮丝氨酸时，培养基中应补加次黄嘌呤。
培养基优选HAT。只有能进行核苷酸补救途径的细胞才能在HAT培养基中存活下来。骨髓瘤细胞缺乏补救途径的关键酶，如次黄嘌呤转磷酸核糖基酶(HPRT)，不能存活下来。B细胞能进行这种途径，但是它们在培养时生命有限，通常在大约两周之内死亡。所以，能生存于选择性培养基中的细胞只有由骨髓瘤细胞和B细胞形成的杂合体。
这种培养能提供一个杂交瘤细胞种群，从中特异的杂交瘤细胞可被筛选出来。典型地说，杂交瘤细胞的筛选是这样进行的，先在微量滴定板中培养单克隆稀释后的细胞，然后测定各单克隆上清液以检测期望的活性(在大约两周或三周之后)。测定应该灵敏、简单和快速，如放射免疫测定法、酶免疫测定法、细胞毒性测定法、噬菌斑测定法、圆点免疫结合测定法等诸如此类。
所选择的杂交瘤细胞再进行连续稀释并克隆成为单一抗体生成细胞，这样这些克隆就能无繁殖用于产生单克隆抗体。该细胞系可以通过两种基本方法用来生产mAb。一个例子就是将杂交瘤注射进一个动物体内(常常是注射入腹膜腔内)，该动物与提供最初融合所用体细胞和骨髓瘤细胞的动物类型之间组织相容。被注射的动物体内生长出能分泌由融合细胞杂合体产生的特异单克隆抗体的肿瘤。动物的体液，如血清或腹积液，可被抽出以提供高浓度的mAbs。单个细胞系也可以在体外进行培养，这时，mAbs就自然地分泌进入培养基中，从培养基里可以很容易地得到高浓度的抗体。如果希望的话，两种方法生产的mAbs都可被进一步纯化，可用过滤、离心和各种层析方法，如HPLC或亲和层析进行。
植物细胞转化方法 为本领域所熟知的，有许多方法可以用于重组DNA转化植物细胞，这些方法也可用于本发明中。两个通常使用的转化植物的方法是农杆菌介导的转化和微粒轰击。微粒轰击方法在美国专利5,015,580(大豆)；5,550,318(玉米)；5,538,880(玉米)；5,914,451(大豆)；6,160,208(玉米)；6,399,861(玉米)和6,153,812(水稻)中有图解说明，农杆菌介导的转化方法在美国专利5,159,135(棉花)；5,824,877(大豆)；5,591,616(玉米)；和6,384,301(大豆)中得以阐述，所有以上专利均纳入此处作为参考。对于基于根癌农杆菌的植物转化系统，在转化构建中出现的附加元素包括T-DNA的左缘和右缘序列，它们能使重组多聚核苷酸很方便地整合进入植物基因组。
通常，随机导入重组DNA，即非特异地定位于目标植物种系的基因组里，都是有用的。在一些特殊的例子中，定位重组DNA的插入以得到位点特异性的整合可能是有用，例如，用于取代一个基因组中已经存在的基因，利用植物基因组中已经存在的启动子或者插入重组的多聚核苷酸到一个预先确定的位点，该位点是已知活跃的基因表达位点。已知有几个位点特异性重组系统在植物中有效，包括美国专利4,959,317中公开的cre-lox，美国专利5,527,695中公开的FLP-FRT，两者均纳入此处作为参考文献。
本发明的转化方法优选地应用于培养基和受控环境中的组织培养。“培养基”指在体外，即在完整的活器官之外，培养细胞所用的许多营养物质的混合物。受体细胞目标包括但不仅限于分生组织细胞、愈伤组织细胞、未成熟胚细胞和配子细胞如小孢子、花粉、精子和卵细胞。任何可以再生成为可育植物的细胞均可以考虑用来作为受体细胞。本发明中用于产生转基因植物的实际转化方法和材料，例如各种不同的培养基、受体目标细胞、未成熟胚细胞转化和可育转基因植物的后继再生，均在美国专利6,194,636和6,232,526中公开，其中纳入作为参考。
转基因植物的种子可以从可育转基因植物收获，并用来种植本发明所述转化植物的子代，包括用于选择具有改良性状植物的杂合植物株系。除了使用重组DNA进行直接转化，转基因植物也可以通过带有重组DNA的植物与不带重组DNA的植物的杂交而获得。例如，重组DNA能被导入第一种植物株系转化产生转基因植物，这种转基因植物可与第二种植物株系杂交而使重组DNA渗入第二种植物株系中。将具有提供一种改良性状，如提高产量，的重组DNA的转基植物可以与具有提供另一种性状，如抗除草剂或抗虫害，的重组DNA的转基植物杂交，可以产生具有提供两种性状的重组DNA的子代。典型地说，在对组合性状的这种培育中，提供附加性状的转基因植物是父系，而带有基础性状的转基因植物则是母系。这种杂交产生的子代将出现性状分离，以至于有些植物可携带同时表现双亲性状的DNA而有些则带有只表现一个亲本性状的DNA；这样的植物可以用与亲本重组DNA偶联的标记进行鉴定，如通过对重组DNA分析进行的标记鉴定，或者在一些例子中，一个可选标记连接在重组DNA上，通过使用选择试剂，如除草剂来鉴定除草剂耐受型标记，或选择改良性状加以鉴定。带有能表现亲本双方性状DNA的子代植物可以与母本系进行多次回交，比如通常6至8代，以产生具有与初始转基因亲本之一基本上相同的基因型的子代植物，要不是有另一个转基因亲本的重组DNA。
实际上，在任何一次转基因实验中，转化DNA一般只能导入很小比例的目标植物细胞中。标记基因用于提供一个有效的系统来鉴定那些通过接收和整合转基因DNA进入自己基因组的稳定转化细胞。优选的标记基因提供能对选择试剂产生耐受性的选择性标记，如抗生素或除草剂。任何一种除草剂，只要本发明中的植物可以耐受，都可以用作鉴定选择性标记的试剂。将可能被转化的细胞用选择试剂处理。对于存活的细胞种群，一般来说，提供耐受性的基因是整合的，并能以足够高的水平进行表达以维持细胞存活。细胞可以被进一步地测定以确定外源DNA的稳定整合。常用的选择标记基因包括那些对抗生素产生抗性的基因，如卡那霉素和巴龙霉素(nptll)、潮霉素B(aph IV)和庆大霉素(aac3和aacCA)，或抗除草剂的基因如glufosinate(bar或者pat)和草甘膦(aroA或者EPSPS)。对这些选择性的实例在美国专利5,550,318；5,633,435；5,780,708和6,118,047中有图注说明，所有纳入此处作为参考。能够使肉眼观察就能鉴定转化体的可选择标记也可以使用，比如表达有色或荧光蛋白，如荧光素酶或绿色荧光蛋白(GFP)，的基因，或者表达β-葡糖苷酸酶或uidA基因(GUS)，因为它具有多种已知的显色底物。
那些经选择试剂处理后存活的植物细胞或者在筛选测定中被评分为阳性的细胞，可以在再生培养基中培养并长成植物。在转移至温室或成熟生长箱之前，将正在生长的从转化植物细胞再生的小植物转移到植物生长混合培养基中，使其硬化，例如在一个环境可控的培养箱中，大约85％的相对湿度、600ppm CO2以及25-250微爱因斯坦m-2s-1的光照强度。在转化子的鉴定后，植物的再生需要大约6周至10个月的时间，这取决于原始组织。植物可以使用本领域技术人员熟知的常规植物育种方法时行受粉和种子生产，例如转基因玉米常用自花受粉。再生的转化植物或其子代种子或植物需被鉴定重组DNA的表达并选择改良农业性状。
转基因植物和种子 培育源自于本发明植物细胞的转基因植物，使其生长成为相对于对照植物具有改良农业性状的转基因植物，并产生本发明所述转基因种子和单倍体花粉。这些具有改良农业性状的植物是通过筛选转化植物或子代种子的改良性状而鉴定的。为了提高效率，应设计一种选择方法以评估多个含有重组DNA的转基因植物(事件)，比如从2-20的多个植物或更多的转基因事件。此处提供的由传基因种子生长起来的传基因植物表现出更好的农业性状，使得产量增加或由其它性状提升了植物的价值，包括如更好的种子质量。特别的好处是植物具有提高的水利用率、增强的抗冻性、提高的产量、提高的氮利用率、改良的种子蛋白和改良的种子油脂。
表1提供了编码蛋白的DNA(基因)列表，可用这些基因作为重组DNA来产生具有改良农业性状的转基因植物。表1的各要素通过以下进行 “PEP SEQ”是从SEQ ID NO5-8.中鉴定的一个氨基酸序列。
“NUC SEQ”是从SEQ ID NO1-4中鉴定的一段DNA序列。
“基础载体”是一个基础质粒，用于重组DNA的转化。
“蛋白质名称”是指由重组DNA编码的蛋白质的通用名。
“质粒ID”指包含重组DNA的植物转化质粒的简称，该质粒的作用是在植物细胞中表达重组DNA。
表1 具有改良农业性状的转基因植物的筛选方法 许多转基因事件可以产生存活的可育的转基因植物，这些转基因植物可以产出种子和子代植物，但不表现改良的农业性状。筛选是鉴定本发明的转基因植物所必需。通过不同的测定改良性状的的检验方法对植物性状评估，可将具有改良农业性状的转基因植物从其中所述转化植物种群中鉴定出来。这些检验可能会采用多种形式，包括但不仅限于分析测定植物的化学成份、生物量、生理特征、形态学的变化。化学成份的变化如玉米营养成份的变化能通过分析种子成份和蛋白、自由氨基酸、油脂、自由脂肪酸、淀粉或维生素E含量而被检测。生物量特征能因温室或大田的种植而改变，可包括植物的高、茎粗、根和枝条的干重，以及对于玉米植物的穗长和直径。生理性质的改变可以由评估对压力条件的反应来鉴定，例如在施加压力条件下，如缺水、缺氮、低温生长条件、病虫害、缺少光照或提高植物密度，进行检验。形态学改变可以通过观察具有改良性状的转基因植物与正常植物比较产生的可见变化趋势来进行测量，如比较分枝，较高、较厚、较窄的叶片，条纹叶片，结的性状，萎黄，白化，花青素的产生或变化的雄花穗、穗或根。其它的筛选特征包括产生花粉的天数、抽丝的天数、叶的扩展率、叶绿素的含量、叶片温度、林分、幼苗活力、结间长度、植物高度、叶数、叶面积、分蘖、支柱根、滞绿、茎倒伏、根倒伏、植物健康度、不育/多产、生长打断(green snap)和抗虫性。另外，可以评估收获谷粒的表型特征，包括穗上每排的米粒数、穗上米粒的排数、米粒败育、米粒重量、米粒大小、米粒密度和谷粒的生理品质。
本发明中对于具改良农业性状的转基因植物的优选种子是玉米和大豆植物，其它的种子则是棉花、油菜、小麦、葵花、高粱、苜蓿、大麦、小米、水稻、烟草、水果和蔬菜作物，以及草坪用草。
提高的氮利用率的筛选 本发明中的一个优选转基因植物的改良农业性状就是相对于对照植物具有提高的氮利用率。高氮土壤的应用可以提高种子的蛋白和淀粉的积累，产生更大的种子重量和每穗更多的谷粒数量。最近的在改良高产杂交玉米基因型上的进展包括了对氮的高效利用。在农作物中产生提高的氮利用率的基因非常有用，例如，能提高产量。提高的氮利用率可以用测定植物生长的改度来进行评估，比如测定植物生长在氮限制和/或氮充足条件下的叶面积产量、枝的生物量、叶绿素含量。在氮限制条件下进行第一次筛选并在氮限制和氮充足条件下确认复制的转基因事件是非常有用的。表2展示了用于氮利用率筛选的氮限制条件(低氮生长条件)和氮充足条件(高氮生长环境)中所用的营养液中各营养成分的量。例如在温室筛选盆中，分别在进行高氮和低氮选择种植后的8天和10天开始，将转基因植物和对照植物用100ml的营养液处理，隔日一次，每周三次。
表2
注意用HCl或KOH将pH调至5.6 对于低氮筛选在植物生长28天和对高氮筛选的23天后，进行如下方面测定总枝干的鲜重、叶片的叶绿素、叶片面积、叶片鲜重和叶片干重。
对高产的筛选 本发明的许多转基因植物相对于对照植物表现出提高的产量。高产可以是因为改良的种子的库容量，即胚乳细胞或者米粒的数量和大小；和/或改良的库强度，即淀粉生物合成的速率。库容量在米粒发育很早的时候就能建立，如胚乳细胞数量、细胞大小都在受粉后的前几天就确定下来的。
在过去几十年中，许多提高玉米产量的方法都是提高种植密度的结果。在这期间，玉米产量以2.1蒲式耳/英亩/年的速度提升，但种植密度则以250株/英亩/年的速度增加。现代杂交玉米的一个特征就是这些品种能在高密度下种植。很多研究已经显示出比现在更高的种植密度的结果是更高的生物量的产出，但在这些更高的密度下现在的种质则没能有好的表现。一个提高产量的途径就是在高密度种植时提高收获指数(HI)，即相对于总生物量米粒分配到的生物量占的比例。
对转基因玉米产量的有效筛选利用转基因事件杂交子代在最优的生产管理以及最好害虫控制下于多个地点进行种植。对于高产有用的指标是相对于种植对照植物的种子在产量上有5％到10％的提升。有效的筛选需在多个不同的地理位置，如多至16或更多的地点，和多于一个或多个种植季节，如至少两个种植季节进行，以从统计学上区别产量提升和自然环境的影响。要种植多种转基因植物、阳性和阴性对照植物和传粉植物，将它们种植于标准样地中，例如，两排样地，20英尺长，5英尺宽，每排间隔30英寸，行列之间有3英尺的小径。转基因事件由重组DNA的结构进行分组，各组随机播种于地中。在使用雄性不育转基因事性时，每两个样地间需种植一个样地的高品质玉米种系传粉者以进行自由传粉。有效的种植密度为大约30000个植物/英亩。
用于产量提高筛选的替代指标包括源容量(生物量)、源产出(蔗糖和光合作用)、库组成(米粒大小、穗大小、种子中的淀粉)、发育(光反应、高度、密度耐受性)、成熟、早期开花性状和对高密度种植的生理反应，例如每英亩45000个植物的种植密度，如表3和表4所展示。
表3 当对产量提高进行筛选时，一个有效的统计学检测途径包括三个组成部分，即分别对分布各个区域实验地建立空间自相关模型，对针对各区域的空间依赖性进行重组DNA事件的性状校正，和进行交叉地域分析。建立空间自相关模型的第一步是估计半变异函数的协方差参数。假定用一个球体协方差模型来建立空间自相关模型。因为实验的大小和性质，空间自相关可能会改变。所以需与球体协方差同时假定各向异性。以下的一套方程式描述了各向异性球状协方差模型。
其中I(·)是指标函数 和 其中S1＝(x1，y1)是一个区域的空间坐标，S2是第二个区域的空间坐标。有5个协方差参数。
θ＝(v，σ2，ρ，ωn，ωj) 其中v是硬块效应，σ2是偏坎(partial sill)，ρ是从北顺时旋转度数，ωn是短轴的定标参数，ωj是相等协方差的各向异性椭圆的长轴定标参数。使用来自大量复制授粉器曲线经由最大限制性似然途径的数据来估计定义空间趋势的五个协方差参数。在多区域田地试验中，对每个区域要分别进行空间趋势建模。
在获得模型不同参数后，要对准备分析的数据建立变异数协方差结构。该变异数协方差结构包括用于校正空间依赖性产量数据的空间信息。在这种情况下，一个最能表现该研究处理和实验设计的嵌套模型将与变异数协方差结构一起用于对产量数据的校正。在这个过程中，苗圃或种子批次影响也能建模并被评估以校正对任何由于种子批间不同所引起的产量差异。
在对来自于不同区域的数据进行空间校正之后，所有的被校正数据将在假设区域重复条件下被合并分析。在该分析中，区域内或区域间的变量被结合起来以估算转基因植物和对照植物产量的标准差。相对平均比较用于显示有统计学意义的产量提高。
对水利用率的筛选 本发明使得转基因植物具有高产量的一个方面是因为提高的水利用率和/或抗旱性。在这个例子中所述是一种对于转基因玉米植物相对于野生型玉米植物(用作测试的为近交系或杂合系)水利用率的高通量温室筛选方法。这个筛选过程在植物11天的初始压力自由生长后在共15天期间加上了三个干旱/再供水循环。每5天一个循环，每个循环前4天不供水，第5天进行水淬。由该筛选方法主要分析的基因型是那些在保证营养的干旱处理期间植物生长率发生改变的植物，这个生长率由植物高度和生物量所决定。枝条的水合状态干旱处理后被测定。在三个时间点测定植物的高度。第一个时间点在植物11天大时开始干旱处理之前取得，这时为枝杆的初始早度(SIH)。植物高度也会在干旱/再供水法的中途，种植后的18天被测量，以获得枝杆的中期干旱高度(SMH)。在最后一个干旱循环完成时，即种植后的26天，收获植物的枝杆部分，并测量最终高度，即枝杆的萎蔫高度(SWH)，同时也测定枝杆的萎蔫生物量(SWM)。将枝杆置于40摄氏度水中，避光。三天后，称量枝杆重量即为枝杆吸胀重量(STM)。用烘箱干燥4天后，称量枝杆重量即为枝杆干燥生物量(SDM)。枝杆均高(SAH)是三次高度测定后的植物平均高度。上述阐述的过程可以根据条件在每步上调整+/-一天。
为了校正植物之间的轻度差别，从SIH和SWH中衍生出一个大小校正生长值。这就是相对生长率(RGR)。每个枝条的相对生长率可依照公式[RGR％＝(SWH-SIH)/((SWH+SIH)/2)*100]进行计算。相对水含量(RWC)是对收获时水在植物中所占比例(％)。每个枝条相对水含量(RWC)可依照公式[RWC％＝(SWM-SDM)/(STM-SDM)*100]进行计算。完全供水的玉米植物其中年龄的RWC约为98％。
对在寒冷压力下生长的筛选 本发明一个方面提供了在寒冷压力下具有改良生长状况的转基因植物，例如在早期幼苗生长测定中，测定了3批种子。第一批是一组是从转基因植物收获的转基因种子；第二批是转基因种子的阴性分离子；第三批是从两种抗冻和两种不抗冻的野生型对照植物获得的种子。所有的种子均用以上提及的杀霉剂处理。将种子种于萌发纸上(12英寸x18英寸Anchor Paper#SD7606)，用0.5％KNO3和0.1％Thyram溶液湿润。在每片纸上将15粒种子沿直线平均放置，以使根向同一边缘生长。将湿纸均匀卷紧，以保持种子的位置。把纸卷小心地放入有两个大纸夹的地方，一个夹在顶部，一个夹中底部。将纸卷按完全随机组设计装入合适的容器，在温度为23℃的培养室中孵育三天。培养室的湿度设置为65％，无光照循环。对进行寒冷压力处理组，将纸卷在12℃培养室中孵育14天，培养室的湿度设置为65％，无光照循环。对进行热处理组，将纸卷在23℃多孵育两天。将处理后的萌发纸打开，弃去未发芽的种子。测量每粒种子的胚根与胚芽鞘长度。从每组六个单独米粒收集胚芽鞘样本以确定重组DNA的表达。用经过前处理和冷处理后的根和苗在长度上的统计学差异来评估寒冷处理在玉米植物上的影响。分别单独对热和冷处理组进行分析。
对植物种子中改良的油脂、淀粉或蛋白含量的筛选 植物种子中的油脂含量由低分辨率sup1H核磁共振(NMR)来确定(Tiwari等，JAOCS，51104-109(1974)；或Rubel，JAOCS，711057-1062(1994))。也可用近红处光谱(NIR)来确定油脂、淀粉和蛋白的含量。
以下实施例用于说明本发明。
实施例1 该实施例说明用于转运重组DNA进入植物细胞的质粒的构建，而该植物细胞可以再生成为本发明所述转基因植物。用于PCR扩增重组DNA蛋白编码核苷酸的引物被设计在或靠近编码序列的起始和中止密码子处，以清去大部分的5’和3’的非翻译区。在插入基础载体之前，如表1中引用，每一个编码表1中所鉴定蛋白的重组DNA都将用PCR进行扩增。
使用GATEWAY(TM)Destination植物表达载体系统(由Invitrogen生命科技Carlsbad，CA提供)构建一种基础植物转化载体pMON65154用于重组DNA转化进入玉米组织。参考表5下部所述元件和SEQ IDNO9，pMON65154包括了一个可选的标记表达盒和一个模板重组DNA表达盒。标记表达盒包括了一个CaMV 35S启动子，连接在新霉素磷酸转移酶II(riptII)编码基因上，后面再接着一个根癌农杆菌胆脂碱合成酶(nos)基因。模板重组DNA表达盒与标记表达盒尾尾相对。模板重组DNA表达盒包含了5’调控DNA，包括水稻肌动蛋白1的启动子、外显子和内含子，接着是一个GATEWAYTM重组DNA插入位点，然后是土豆蛋白酶抑制物II(pinII)基因的3’区域。在重组DNA被插入进插入位点后，该质粒就能用于植物转化，比如使用微粒轰击法。 表5
相似的载体质粒pMON72472(SEQ ID NO10)也被构建起来用于农杆菌介导的植物转化方法，该质粒与pMON65154相似，除了(a)在模板重组DNA表达盒中的5’调节DNA是一个水稻肌动蛋白启动子和一个水稻肌动蛋白内含子，(b)加入了来自于农杆菌T-DNA左右边缘序列，其中右边缘序列加在水稻肌动蛋白1启动子的5’端，而左边缘序列则位于35S启动子的3’端；(c)加入DNA以使质粒在大肠杆菌和根癌农杆菌中均容易复制。该DNA加在质粒T-DNA边缘序列之外，包括了一个在农杆菌中有效的orN宽宿主范围DNA复制起点和在大肠杆菌中有效的pBR322复制起点，以及一个同时能用于大肠杆菌和农杆菌选择的大观霉素/链霉素抗性基因。pMON74775由一个与pMON72472基本相同的基础质粒所构建。
其它与上述相似的基础质粒也被构建出来，包括含有丙酮酸磷酸二激酶(PPDK)启动子(SEQ ID NO11)和作为增强子的玉米DnaK内含子(SEQ ID NO12)的pMON81244。
用于大豆转化的植物表达载体 用于大豆转化的质粒也已被制备出来。可作范例的通用表达载体质粒pMON74532(SEQ ID NO13)的各组件都在表7下展示。
构建类似于上述的用于大豆转化的质粒载体以用于农杆菌(Agrobacterium)介导的大豆转化，pMON74537，其含有Arabidopsisthaliana核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(Rubisco)小亚单位启动子(SEQ IDNO14)。
在插入位点插入载体之前，通过PCR来扩增编码重组DNA片段的蛋白。在或接近起始密码子和终止密码子设计用于PCR扩增的引物，以消除大部分5’和3’未翻译区域。
表7
实施例2 该实施例说明植物转化在产生本发明的转基因玉米植物上很有作用。将一种易转化的玉米植物种植于温室之中，当胚长到1.5到2.0mm长时，收获其穗。通过喷撒或将穗浸泡入80％乙醇来对穗表面消毒，然后风干。在表面消毒的穗上的各个米粒中分离出未成熟胚。在接种玉米细胞之前，将农杆菌细胞在室温培养过夜。将切下来的未成熟的玉米胚立即与农杆菌在一起，并与农杆菌在室温共同孵育5-20分钟。把未成熟胚与农杆菌在23℃避光共同培养1-3天。共培养后的胚被转移至选择培养基中并培养大约两周让胚愈伤组织得以发育。胚愈伤组织再被转移到含有100mg/L巴龙霉素的培养基中，间隔大概两周进行亚培养。在初始筛选后6-8周可得到转化株。
制备质粒载体克隆在表1中鉴定的DNA，以用于玉米的转化并且产生转基因玉米植物和种子。
对于玉米愈伤组织农杆菌介导的转化，未成熟胚需在切割后培养8-21天让愈伤组织得以发育。将愈伤组织在室温下与农杆菌悬液共同孵育30分钟，然后吸干液体。在非选择条件下将愈伤组织和农杆菌共培养3-6后，再用巴龙霉素选择培养大概6周，每两周转入新鲜培养液，巴龙霉素抗性愈伤组织被鉴定为含有表达盒中的重组DNA。
对于用微粒轰击的转化，未成熟玉米胚在轰击之前被分离出来并培养3-4天。进行微粒轰击前，制备一种金颗粒悬液，并在上面沉淀期望的重组DNA表达盒。如美国专利5,550,318和6,399,861所阐述，用放电粒子加速基因送递仪将DNA导入玉米细胞。在微粒轰击之后，将组织于27℃下避光培养。
为了产生转基因玉米植物，由转化产生的转基因愈伤组织被置于培养基上以开始枝杆发育并形成小植物，将小植物转移到盆载土壤中在26℃培养室中进行初始培养，接着进行“mist bench”，然后将之移植到5英寸盆中让植物生长成熟。让植物进行自花授粉，收集产生的种子，用于种子、幼苗、子代R2植物或杂合体的筛选，例如上述的产量筛选试验。
实施例3 该实施例进一步说明对具有改良农业性状，即相对于对照植物来说提高的氮利用率、高产、提高的水利用率、改良的耐冻性和/或改良的种子成份，的转基因玉米种子的生产和鉴定。通过转化，制备了含有重组DNA的转基因玉米种子和植物，该重组DNA来自于克隆在如表1中所鉴定的基础载体之一中的各个基因。许多转基因事件虽然可产生存活的可育转基因植物并能产生种子和子代植物，但却不能显现出改良的农业性状。具有本发明所述改良农业性状的转基因植物和种子通过筛选其氮利用率、产量、水利用率和抗冻性而被鉴定出来。具有改良种子成分的供种转基因植物通过分析种子的成分包括蛋白、油脂和淀粉含量而被鉴定出来。
A.提高的氮利用率 本发明提供的具有提高的氮利用率的转基因植物是通过按照上述的标准程序的筛选过程而筛选出来的，以下表8显示了这些转基因植物的性能。
产量 本发明提供的具有改良产量的转基因植物是通过按照上述的标准程序的筛选过程而筛选出来的，以下表9和表10显示了这些转基因植物的性能，在表示玉米产量的变化上是用蒲式耳/英亩为单位的。表9
表10 水利用率 本发明提供的具有改良水利用率的转基因植物是通过按照上述的标准程序的筛选过程而筛选出来的，以下表11显示了这些转基因植物的性能。 表11 抗冻性 本发明提供的具有改良抗冻性的转基因植物是通过按照上述的标准程序的筛选过程而筛选出来的，以下表12显示了这些转基因植物早期幼苗的生长性能。
改良的种子组成 本发明提供的具有改良种子组成的转基因植物是通过按照上述的标准程序的筛选过程而筛选出来的，以下表13-5显示了这些转基因植物的性能。
表14油脂
表15蛋白质 实施例4 该实施例阐明了具有通过组合的改良性状的转基因植物。如实施例3中所述，通过引入来自于表1所鉴定的各个基因的重组DNA，产生具有各种改良农业性状的转基因植物。为了将这些转基因植物农业性状进一步改良，将表1中的基因与一个或多个能够改良农业性状的其它基因进行组合，以产生相对于单独使用其中一个基因，在一个或多个农业性状上具有更高改良的转基因植物。达到这种组合形式，可以通过转化的方法也可以使用育种的方法。以下的例子可说明这种原理。一种转基因玉米植物由质粒pMON74923稳定转化，该质粒含有由玉米醛缩酶(FDA)启动子(美国专利申请No.09/757,089)控制的玉米植物色素B(phyB)基因(SEQ ID NO15)，将该玉米植物与由pMON68392稳定转化的转基因玉米植物杂交。相对于只含phyB基因的玉米植物提高的产量(2.4％)，杂交品种提高的产量(bu./a)达到7.2％。
实施例5.大豆植物的转化 该实施例说明了用于生产本发明所述转基因大豆上的植物转化，以及用于产生具有改良农业性状的转基因大豆的转基因种子的生产和鉴定，即相对于对照植物具有的提高的氮利用率、提高的产量、改良水利用率、在寒冷压力下改良的生长力和/或改良的种子油脂、蛋白和/或淀粉含量。对于农杆菌介导的转化，让大豆种子萌发过夜，切下分生组织外植块。将分生组织和外植块放进一个创伤管里。将大豆外植块和包含质粒DNA的农杆菌株诱导细胞混合在一起，该质粒DNA带有目的表达盒的基因和一个植物选择性标记盒，整个过程从种子萌发起始到声裂创伤时间不超过14个小时。在创伤处理之后，将外植块共同培养2-5天，然后将它们转移到选择培养基中培养6-8周让转基因枝杆得以选择和生长。性状阳性枝杆在大约在轰击后6-8周时收集，并放于选择性生根培养基中2-3周。长出根的枝杆被转移到温室，在土壤中盆栽。在选择培养时保持健康但不生根的枝杆被转移至非选择性生根培养基中继续培养两周。在所有选择结束后生根的枝杆移植于温室土壤盆载之前，测定这些枝杆的根是否有植物选择性标记表达。
实施例6 该实施例进一步阐述了用于产生具有改良农业性状的转基因大豆的转基因种子的生产和鉴定，这些改良的性状即是相对于对照植物所具有的提高的氮利用率、提高的产量、改良水利用率、在寒冷压力下改良的生长力和/或改良的种子成份。通过转化制备了包含重组DNA转基因大豆种子和植物，该重组DNA来自于克隆在如表1中所鉴定的基础载体之一中的各个基因。许多转基因事件虽然可产生存活的可育转基因植物并能产生种子和子代植物，但却不能显现出改良的农业性状。具有本发明所述改良的农业性状转基因植物和种子通过筛选其氮利用率、产量、水利用率和抗冻性而鉴定出来。具有改良种子成分的供种转基因植物通过分析种子的成分包括蛋白、油脂和淀粉含量而被鉴定出来。
序列表
<110>Monsanto Technology LLC
Lund，Adrian
Deikman，Jill
Anstrom，Donald
Chomet，Paul
Heard，Jacqueline
<120>具有改良农业性状的转基因植物
<130>38-21(53720)C
<150>60/638,099
<151>2004-12-21
<150>60/660,320
<151>2005-03-10
<160>15
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>828
<212>DNA
<213>拟南芥
<400>1
<210>2
<211>678
<212>DNA
<213>玉米
<400>2
<210>3
<211>642
<212>DNA
<213>大豆
<400>3
<210>4
<211>690
<212>DNA
<213>水稻
<400>4
<210>5
<211>275
<212>PRT
<213>拟南芥
<400>5
<210>6
<211>225
<212>PRT
<213>玉米
<400>6
<210>7
<211>213
<212>PRT
<213>大豆
<400>7
<210>8
<211>229
<212>PRT
<213>水稻
<400>8
<210>9
<211>9215
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>载体
<400>9
<210>10
<211>9747
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>载体
<400>10
<210>11
<211>1023
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>启动子
<400>11
<210>12
<211>804
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>元件
<400>12
<210>13
<211>9754
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>载体
<400>13
<210>14
<211>1696
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>元件
<400>14
<210>15
<211>1696
<212>DNA
<213>玉米
<400>1权利要求
1.一种具有稳定整合的重组DNA的植物细胞，该重组DNA包括一个在植物细胞中有功能的启动子，该启动子可操纵地连接于编码蛋白的DNA上，被编码的蛋白在序列上具有的氨基酸结构域在与Pfam同源异型框蛋白结构域家族和Pfam HALZ蛋白结构域家族的氨基酸序列比对上超过了Pfam富集中止区；其中对于同源异型框蛋白结构域家族，Pfam的富集中止区在-4，对于HALZ蛋白结构域家族，Pfam的富集中止区在17；其中所述植物细胞是从带有所述重组DNA的植物细胞种群中筛选出来的，筛选的条件是所筛选的植物是从该种群中的植物细胞再生而来并表达能让该植物相对于没有该重组DNA的对照植物表现出改良性状的蛋白；并且其中所述改良性状选自提高的水利用率、增强的抗冻性、提高的产量、提高的氮利用率、改良的种子蛋白和改良的种子油脂。
2.权利要求1的植物细胞，其中所述蛋白质具有一个与在共有氨基酸序列组中的共有氨基酸序列至少有90％的一致性的序列，该共有氨基酸序列组由通过SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:8的比对所构建的共有氨基酸序列组成。
3.权利要求1的植物细胞，其中所述蛋白质选自具有SEQ IDNO:5至SEQ ID NO:8的氨基酸序列的蛋白。
4.权利要求1的植物细胞，该细胞还包含一段DNA，该DNA所表达的蛋白能够产生忍耐以对所述植物细胞的野生型致死水平施加的除草剂处理的耐受性。
5.权利要求4的植物细胞，其中所述除草剂是草甘膦、麦草畏或草铵膦化合物。
6.一种转基因植物，该植物包含多个权利要求1的植物细胞。
7.权利要求6的转基因植物，该植物对于所述重组DNA是纯合子。
8.一种转基因种子，该种子包含多个权利要求1的植物细胞。
9.权利要求8的转基因种子，该种子来自于玉米、大豆、棉花、芸苔、苜蓿、小麦或水稻植物。
10.权利要求9的非天然的转基因玉米种子，其中所述种子能产生可抵抗由MaI de Rio Cuarto病毒或玉米锈病(Puccina sorghi)真菌两者或两者之一引起的疾病的玉米植物。
11.一种转基因花粉粒，该花粉粒包括由权利要求1的植物细胞所衍生出来的单倍体。
12.一种用于产生由于稳定整合的重组DNA表达而具有改良性状的转基因植物作物的非天然的转基因种子的方法，该重组DNA包括一个启动子，该启动子(a)在植物细胞中有功能并且(b)可操纵地连接到编码蛋白的DNA上，其中被编码的蛋白在序列上具有的氨基酸结构域在与Pfam同源异型框蛋白结构域家族和Pfam HALZ蛋白结构域家族的氨基酸序列比对上超过了Pfam富集中止区；其中对于同源异型框蛋白结构域家族，Pfam的富集中止区在-4，对于HALZ蛋白结构域家族，Pfam的富集中止区在17；其中所述改良性状选自提高的水利用率、增强的抗冻性、提高的产量、提高的氮利用率、改良的种子蛋白和改良的种子油脂，所述用于制备所述种子的方法包括:
(a)针对所述改良性状和所述重组DNA筛选一个种群的植物，其中所述种群中，单个植物所表现出所述性状的水平低于、基本相当于或高于在没有表达该重组DNA的对照植物上所表现出来的所述性状的水平，
(b)从所述种群中选择出一个或多个表现该性状的水平高于对照植物所表现该性状的水平的植物，
(c)验证所述重组DNA已经稳定地整合进了该选择的植物中，
(d)分析所选择的植物的组织以确定功能蛋白的产生，该功能蛋白由在序列上为SEQ ID NO:1-4之一的核苷酸所编码；和
(e)收集所选择植物的种子。
13.权利要求12的方法，其中所述种群中的植物还包含一段DNA，该DNA所表达的蛋白能够产生忍耐以对野生型植物细胞致死水平施加的除草剂处理的耐受性，并且其中所述选择是通过用所述除草剂处理该种群而进行的。
14.权利要求13的方法，其中所述除草剂包括草甘膦、麦草畏或草铵膦化合物。
15.权利要求12的方法，其中所述选择是通过鉴定具有所述改良性状的植物而进行的。
16.权利要求12的方法，其中所述种子是玉米、大豆、棉花、苜蓿、小麦或水稻种子。
17.一种产生杂交玉米种子的方法，所述方法包括:
(a)从抗除草剂的玉米植物上获取杂交玉米种子，该玉米植物同时含有稳定整合的重组DNA，此重组DNA包括了一个启动子，该启动子(a)在植物细胞中有功能并且(b)可操纵地连接到编码蛋白的DNA上，其中被编码的蛋白在序列上具有的氨基酸结构域在与Pfam同源异型框蛋白结构域家族和Pfam HALZ蛋白结构域家族的氨基酸序列比对上超过了Pfam富集中止区；其中对于同源异型框蛋白结构域家族，Pfam的富集中止区在-4，对于HALZ蛋白结构域家族，Pfam的富集中止区在17；
(b)从所述交杂玉米种子生产玉米植物，其中一部分从该杂交玉米种子产生的植物对所述重组DNA是纯合子，一部分从该杂交玉米种子产生的植物对所述重组DNA是半合子，还有一部分从该杂交玉米种子产生的植物不具有所述重组DNA；
(c)使用除草剂处理以选择对所述重组DNA为纯合子和半合子的玉米植物；
(d)收集除草剂处理后存活的玉米植物的种子，并种植该种子产生下一子代的玉米植物；
(e)重复步骤(c)和(d)至少一次，以产生近交玉米系；
(f)将所述近交系玉米与另一系玉米杂交以产生杂交种子。
18.选择包括权利要求1的细胞的植物的方法，其中使用免疫反应性抗体来检测种子或植物组织中所述蛋白的存在。
19.用于反假冒的碎种子，其含有权利要求1的植物细胞作为原始标记。
20.一种无需灌溉的种植玉米、棉花或大豆作物的方法，所述方法包括种植具有权利要求1的植物细胞的种子，该种子是针对提高的水利用率而被选择出来的。
21.权利要求20的方法，包括在种植所述作物期间最多提供300毫米的地面水。
22.一种无需施加氮肥的种植玉米、棉花或大豆作物的方法，所述方法包括种植具有权利要求1的植物细胞的种子，该种子是针对提高的氮利用率而被选择出来的。
全文摘要
本公开描述了一种从用重组DNA转化以表达具有同源结构域蛋白的植物细胞中筛选出一定数量转基因植物的方法，以鉴定已转入用于表达改良性状的特定基因的转基因农业植物。这些性状包括增加氮的利用率、提高产量、增加水的利用率、增强对冷负荷的耐受力和/或改良种子成分。同时也公开了转基因种子，这些种子能生长成为在基因组中带有重组DNA并表现出所筛选的增强性状的转基因植物。还公开了基于转基因事件的产生种子和植物的方法。
文档编号C12N15/00GK101384167SQ200580048513
公开日2009年3月11日 申请日期2005年12月19日 优先权日2004年12月21日
发明者A·伦德 申请人:孟山都技术有限公司