专利名称：一株用重复筛选方法获得的高抗紫外线细胞克隆的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株用重复筛选方法获得的高抗紫外线细胞克隆，属于生物技术领域。
背景技术：
紫外线包括三个波段短波(UVC，200～280nm)、中波(UVB，280～320nm)和长波(UVA，320～400nm)紫外线，其中UVB和UVA可穿过大气层到达地面，对人体皮肤造成损伤，UVA穿透力极强，主要引起皮肤细胞DNA氧化性损伤而引起光老化；而UVB可引起皮肤细胞发生免疫抑制、炎症发生、DNA光加合物嘧啶二聚体形成，如对后者修复不善，可导致DNA突变及皮肤癌的发生；各种可以抵抗紫外线对细胞造成损伤的物质，特别是天然成分的分离、筛选已经成为医药、化妆品基础研发的热点，具有很高的实际应用价值。
由于植物的不可移动性和对光的生理需求(如光合作用等)，因此植物发展了许多避免受到强烈紫外线对细胞造成损伤的机制，植物体中具有防止紫外线损伤的物质主要有有机酸类(如鞣酸、异阿魏酸、黄木樨酸苷等)、黄酮类、醌类、皂甙类(如柴胡皂甙、黄芩皂甙等)矿物质、粘蛋白、超氧化物歧化酶SOD、抗氧化剂(如维生素E、维生素C和β-胡萝卜素、原花青素(OPC)、表没食子儿茶酚没食子酸酯(EGCG)等)，它们或是对紫外线有较强的吸收，或是有抑制酪氨酸酶的活性作用，或是有清除紫外线辐射产生的自由基的作用，近年来许多试验室开展了在植物提取物中筛选紫外线吸收物质和抗氧化物质的工作，也取得了很好的进展，很多成分已经广为应用在医药、保健品和化妆品领域，例如OPC、EGCG等的开发应用已经取得巨大的经济效益。
Larkin和Scowcroft把植物组织培养再生植株中出现的变异叫做体细胞无性系变异(somaclonal variation).近年来的研究表明，体细胞无性系变异是植物组织培养过程中出现的普遍现象，Veilleux和Johnsont将体细胞无性系分为5种类型染色体畸变、可转位因子的激活、DNA甲基化状态改变、基因点突变及表观遗传变异。对各种植物体细胞无性系变异株后代的分析也已经证明，其中绝大多数变异是可遗传的，在植物育种上广泛的应用前景已经得到公认。一般植物原生质体在5-20J/cm2紫外线(UVA+UVB)照射下，就会被杀死，已知柴胡皂甙具有明确的消炎、抗紫外线功能，柴胡细胞本身具有一定的抗紫外线伤害的能力，利用柴胡体细胞无性系变异筛选高抗紫外线的细胞克隆，为将来利用细胞工程技术生产抗紫外线制剂提供良好的工程细胞具有重要意义。
参考文献1.张红霞，刘胜祥，郑小江等，具有防晒作用的植物资源初步研究，中国野生植物资源，2004，2315-202.张贵民，化妆品防晒剂的研究进展及其安全性问题，日用化学品科学，2003，26119-1263.韦彦余，赵民安，王晓军，植物体细胞无性系变异在植物性状改良中的应用，植物生理学通讯，2004，40763-7714.C.E.Mothersill，M.J.Moriarty，C.B.Seymour，Radiotherapy and the potentialexploitation of bystander effects，Int.J.Radiat.Oncol.Biol.Phys.，2004，58575-579.
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发明内容
本发明的目的是通过对柴胡原生质体进行紫外线照射重复筛选，获得高抗紫外线的细胞克隆。
本发明是这样实现的本发明的培养基为在常规的MS培养基中添加物质后的培养基。
本发明的耐受紫外线47.5J/cm2、照射时间≥125秒钟的高抗紫外线细胞克隆经由原生质体的获得及紫外线重复筛选工序得到，具体步骤如下a.原生质体的获得挑取柴胡疏松的颗粒状愈伤组织，用镊子捏碎，转入添加了谷氨酰胺100-150mg/l、水解酪蛋白50--200mg/l、2，4-D 0.5--2mg/L、蔗糖3％、pH5.8--6.0的MS液体培养基中震荡培养7天，在无菌条件下，将已分散的悬浮细胞再转入相同配方的液体培养基上振荡培养7天，共3--5次，然后将悬浮细胞用0.4--0.8mol/L甘露醇、2-5mmol/L CaCl2、1％--3％纤维素酶RS和0.3％果胶酶Y-23、pH 5.8的等渗混合酶液去壁处理，并在50-200rpm/min震荡1-3小时，初步过滤后用300--500rpm/min离心2-10分钟，回收原生质体；b.紫外线重复筛选用0.4--0.8mol/L甘露醇、2-5mmol/L CaCl2、pH 5.8的等渗洗液清洗原生质体3-4次，将等渗洗液悬浮原生质体移入3个10cm直径的培养皿中，密度为103--107个/l，放置于超净工作台上，用38-48J/cm2紫外线照射100-130秒；照射完毕后，用添加了谷氨酰胺100-150mg/l、水解酪蛋白400--600mg/l、2，4-D0.5--2mg/L、蔗糖8-10％、对氧氮乙环乙烷吡咯磺酸800-1000mg/L、2，4-D 0.5--2mg/L、pH5.6--6.0的原生质体MS培养基置换洗液，然后盖上培养皿盖并用胶带封口，置于黑暗中，在25℃培养15-20天；随后取出形成了小细胞团的原生质体，在添加了谷氨酰胺100-150mg/l、水解酪蛋白50--200mg/l、2，4-D 0.5--2mg/L、蔗糖3％、0.7％的琼脂、pH5.8--6.0的MS固体培养基上培养7天，获得3个细胞克隆；将这3个细胞克隆繁殖至每个克隆有1g鲜重时，各取少量愈伤组织细胞重新去壁，再次用48J/cm2紫外线照射130秒，得到一个正常存活原生质体，随后再生细胞壁恢复分裂，得到来源于这一个原生质体的抗紫外线细胞克隆，命名为Anti-UV Clone。
本发明具有操作简便、成本低、抗紫外线效果佳等优点。可用于细胞工程方法大规模繁殖并提取抗紫外线有效成分。
具体实施例方式以下是本发明的实施例，但本发明的内容并不局限于此。
实施例1一株用重复筛选方法获得的高抗紫外线细胞克隆，经由原生质体的获得及紫外线重复筛选工序得到，具体步骤如下a.原生质体的获得挑取柴胡疏松的颗粒状愈伤组织，用镊子捏碎，转入添加了谷氨酰胺100mg/l、水解酪蛋白200mg/l、2，4-D 0.5mg/L、蔗糖3％、pH5.8的MS液体培养基中震荡培养7天，在无菌条件下，将已分散的悬浮细胞再转入相同配方的液体培养基上振荡培养7天，共3次，然后将悬浮细胞用0.4mol/L甘露醇、2mmol/L CaCl2、1％纤维素酶RS和0.3％果胶酶Y-23、pH 5.8的等渗混合酶液去壁处理，并在50rpm/min震荡1小时，初步过滤，再用300rpm/min离心2分钟，回收原生质体；b.紫外线重复筛选用0.4mol/L甘露醇，、2mmol/L CaCl2、pH 5.8的等渗洗液清洗原生质体3次，将等渗洗液悬浮原生质体移入3个10cm直径的培养皿中，密度为103个/l，放置于超净工作台上，38J/cm2紫外线照射；照射完毕后，用添加了谷氨酰胺100mg/l、水解酪蛋白400mg/l、2，4-D 0.5mg/L、蔗糖8％、对氧氮乙环乙烷吡咯磺酸800mg/L、2，4-D 0.5mg/L、pH5.6的MS原生质体培养基置换洗液，然后盖上培养皿盖并用胶带封口，置于黑暗中，在25℃培养15天；随后取出形成了小细胞团的原生质体，在添加了甘氨酸1mg/l、谷氨酰胺100mg/l、水解酪蛋白50mg/l、2，4-D0.5--2mg/L、蔗糖3％、0.7％的琼脂、pH5.8的MS固体培养基上培养7天，获得3个细胞克隆；将这3个细胞克隆繁殖至每个克隆有1g鲜重时，各取少量愈伤组织细胞重新去壁，再次用48J/cm2紫外线照射，得到一个存活原生质体，再生细胞壁后开始分裂，获得来源于这一个原生质体的抗紫外线细胞克隆，命名为“Anti-UV Clone”。
实施例2基本同实施例1。不同之处为a.原生质体的获得过程中谷氨酰胺120mg/l、水解酪蛋白100mg/l，2，4-D 1mg/L，pH5.9；振荡培养7天，共4次；0.6mol/L甘露醇，3mmol/L CaCl2，2％纤维素酶RS，在100rpm/min震荡2小时，再用400rpm/min离心6分钟，回收原生质体；b.紫外线重复筛选过程中0.6mol/L甘露醇，4mmol/L CaCl2；密度为105个/l，用40J/cm2紫外线照射；谷氨酰胺120mg/l、水解酪蛋白500mg/l，2，4-D 1mg/L，蔗糖9％，对氧氮乙环乙烷吡咯磺酸900mg/L，2，4-D 1mg/L，pH5.8；培养皿中在25℃培养18天；甘氨酸3mg/l、谷氨酰胺130mg/l、水解酪蛋白100mg/l，2，4-D 1mg/L，pH5.9。
实施例3基本同实施例1。不同之处为a.原生质体的获得过程中谷氨酰胺150mg/l、水解酪蛋白200mg/l，2，4-D 2mg/L，pH6.0；振荡培养7天，共5次；0.8mol/L甘露醇，5mmol/L CaCl2，3％纤维素酶RS，在200rpm/min震荡3小时，再用500rpm/min离心10分钟，回收原生质体；b.紫外线重复筛选过程中0.8mol/L甘露醇，5mmol/L CaCl2；密度为107个/l，用48J/cm2紫外线照射；谷氨酰胺150mg/l、水解酪蛋白600mg/l，2，4-D 2mg/L，蔗糖10％，对氧氮乙环乙烷吡咯磺酸1000mg/L，2，4-D 2mg/L，pH6.0；培养皿中在25℃培养20天；甘氨酸5mg/l、谷氨酰胺150mg/l、水解酪蛋白200mg/l，2，4-D 2mg/L，pH6.0。
发明人将上述细胞克隆用常规的乙醇研墨，过滤，用旋转蒸发仪除去溶剂，收集胶状物，用纯水复溶，按1％-3％涂抹于豚鼠皮肤，获得相当于SPF15-28的防晒效果。
权利要求
1.一株用重复筛选方法获得的高抗紫外线细胞克隆，其特征在于(1)耐受紫外线47.5J/cm2的高抗紫外线的细胞克隆经由原生质体的获得及紫外线重复筛选工序得到，具体步骤如下a.原生质体的获得挑取柴胡疏松的颗粒状愈伤组织，用镊子捏碎，转入添加了谷氨酰胺100-150mg/l、水解酪蛋白50--200mg/l、2，4-D 0.5--2mg/L、蔗糖3％、pH5.8--6.0的MS液体培养基中震荡培养7天，在无菌条件下，将已分散的悬浮细胞再转入相同配方的液体培养基上振荡培养7天，共3--5次，然后将悬浮细胞用0.4--0.8mol/L甘露醇、2-5m mol/L CaCl2、1％--3％纤维素酶RS和0.3％果胶酶Y-23 pH5.8的等渗混合酶液去壁处理，并在50-200rpm/min震荡1-3小时，初步过滤后用300--500rpm/min离心2-10分钟，回收原生质体；b.紫外线重复筛选用0.4--0.8mol/L甘露醇、2-5m mol/L CaCl2、pH5.8的等渗洗液清洗原生质体3-4次，将等渗洗液悬浮原生质体移入3个10cm直径的培养皿中，密度为103--107个/l，放置于超净工作台上，用38-48J/cm2紫外线照射100-130秒；照射完毕后，用添加了谷氨酰胺100-150mg/l、水解酪蛋白400--600mg/l、2，4-D0.5--2mg/L、蔗糖8-10％、对氧氮乙环乙烷吡咯磺酸800-1000mg/L、2，4-D 0.5--2mg/L、pH5.6--6.0的原生质体MS培养基置换洗液，然后盖上培养皿盖并用胶带封口，置于黑暗中，在25℃培养15-20天；随后取出形成了小细胞团的原生质体，在添加了谷氨酰胺100-150mg/l、水解酪蛋白50--200mg/l、2，4-D 0.5--2mg/L、蔗糖3％、0.7％的琼脂、pH5.8--6.0的MS固体培养基上培养7天，获得3个细胞克隆；将这3个细胞克隆繁殖至每个克隆有1g鲜重时，各取少量愈伤组织细胞重新去壁，再次用48J/cm2紫外线照射130秒，得到一个正常存活原生质体，随后再生细胞壁恢复分裂，得到来源于这一个原生质体的抗紫外线细胞克隆，命名为Anti-UV Clone。
全文摘要
本发明涉及一株用重复筛选方法获得的高抗紫外线细胞克隆，属于生物技术领域。本发明的高抗紫外线细胞克隆经由原生质体的获得及紫外线重复筛选工序得到，命名为Anti－UV Clone。该细胞克隆游离成原生质体后可耐受47.5J/cm
文档编号C12N13/00GK1844369SQ200610010858
公开日2006年10月11日 申请日期2006年4月27日 优先权日2006年4月27日
发明者陈穗云, 夏光敏, 肖春杰 申请人:云南大学