专利名称：半滑舌鳎雌性特异aflp片段及遗传性别鉴定的pcr方法
技术领域：
本发明属于水产生物技术领域中的鱼类遗传性别鉴定和性别控制技术，是一种能在鱼类单性育种中应用的鱼类遗传性别鉴定的分子生物学方法。
背景技术：
我国有着丰富的鱼类资源，其中许多鱼类在生长速率上存在着性别差异，例如，罗非鱼雄性比雌性生长快约40％以上，而牙鲆和半滑舌鳎等海水鱼类，雌性个体比雄性个体生长快40％-100％，因此，开展这些鱼类遗传性别检测和性别控制的研究，既有重要的科学意义，又有重大的应用潜力和推广前景。
半滑舌鳎(Cynoglossus semiliaevis)是我国特有的一种名贵经济海水鱼类，属于近海温水性底层鱼类，我国沿海均有分布，以黄海、渤海为多。半滑舌鳎由于其味道鲜美，肉质细嫩，营养丰富，深受广大消费者欢迎，其市场价值极高，养殖前景非常广阔。近2年来，半滑舌鳎人工育苗技术获得突破，年产半滑舌鳎苗种近百万尾，但研究表明，半滑舌鳎雌性个体和雄性个体，在生长速率上存在巨大差别，其雌性个体比雄性个体大2-3倍(中国水产科学研究院黄海水产研究所，孟田湘等，1988)。由于雄性个体生长过慢，降低了半滑舌鳎的养殖产量，增加了养殖成本，因而严重影响了半滑舌鳎苗种的推广及养殖产业的形成，由于难以鉴定半滑舌鳎的遗传性别，严重影响了半滑舌鳎雌核发育和性别控制研究的进行。
有关鱼类性别鉴定方法的研究，目前只是在少数几种鱼类上进行过。加拿大西温哥华实验室的Devlin(1994)找到了大鳞大马哈鱼Y染色体特异的DNA片段；英国的Griffiths等(2000)在三椎棘鱼(Gasterosteusaculeatus L.)中找到了两个雄性特异的AFLP标记，但是，当应用于另外两种棘鱼时，却不能正确的鉴定其性别。英国的Ezaz等(2004)用AFLP技术扫描尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus L.)基因组，找到3个Y染色体连锁和一个X染色体连锁的AFLP标记，然而这些标记却不能鉴别没有亲缘关系的个体的性别，表明这些标记和性别决定位点之间发生了重组。日本的Watanabe等(2005)利用AFLP技术，应用EcoRI和MseI限制性内切酶消化孔雀鱼(Poecilia reticulata)的基因组DNA，筛选了32组引物组合，最后找到5个与性别决定位点相连锁的标记。后来他们又采了48个样品对这几个标记进行验证，发现性别表型和基因型之间并非完全一致，其中A2-218标记在性别表型和基因型之间的一致性达到90％，是与性别联系比较紧密的1个标记。但有关鳎科鱼类雌性特异DNA标记和遗传性别鉴定的PCR方法，目前国内外均未见报道。
发明内容
本发明的目的是为了克隆出半滑舌鳎雌性特异AFLP(扩增片段长度多态性)片段，分析其序列，设计特异的PCR引物，建立半滑舌鳎遗传性别鉴定的简单有效的PCR检测方法，为半滑舌鳎性别控制和全雌育种研究提供技术手段。
本发明其技术内容如下包括两个方面一、半滑舌鳎雌性特异AFLP片段的克隆与序列分析；二、半滑舌鳎遗传性别鉴定的PCR方法。
一、半滑舌鳎雌性特异AFLP片段的克隆与序列分析它的技术内容包括1)半滑舌鳎雌性特异AFLP片段的回收；2)雌性特异AFLP片段的克隆；3)雌性特异AFLP片段的序列分析1)、雌性特异AFLP片段的回收选取能扩增出382bp雌性特异AFLP条带的引物组合，进行AFLP扩增，扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，用刀片切下含有382bp雌性特异DNA条带的聚丙烯酰胺凝胶，溶解后回收目的片段备用。
2)、AFLP片段的克隆将回收的雌性特异AFLP片段，克隆到pMD 18-T载体中，采用标准方法进行连接和转化，采用常规PCR法筛选含有目的片段的克隆，用琼脂糖凝胶电泳检测产物的长度，符合预期长度的样品可以视为阳性克隆。
3)、序列分析选取阳性克隆，用ABI3730测序仪进行序列分析。将来自8个阳性克隆的雌性特异AFLP片段的核苷酸序列，用DNAMAN Version 4.0进行多序列比对，其同源性为99.37％，表明各个个体得到的条带是同一个序列。共有序列同源性比对和相似性搜索用BLAST软件进行，在GenBank中没有找到任何同源的序列。
二、半滑舌鳎遗传性别鉴定的PCR方法抽取待测半滑舌鳎鱼的血液，提取基因组DNA，根据获得的半滑舌鳎雌性特异片段的序列，设计1对特异引物，CseF382N1和CseF382C1。提取24个雌性个体和22个雄性个体的基因组DNA，用合成的特异引物进行PCR扩增。如果某个个体产生了特异片段，即可认为这些鱼为遗传上的雌性个体，而没有这些片段的个体则被认为是遗传上的雄性个体。
本发明与已有技术对比其特点是本发明克隆了半滑舌鳎雌性特异的AFLP片段，进行了序列分析，从而将AFLP分子标记转换为SCAR标记，设计了雌性特异片段的引物，首次建立了我国养殖鱼类遗传性别鉴定的常规PCR分析技术。该技术具有快速、准确、灵敏等优点，为鱼类性别控制和单性育种开辟了新的技术途径，适宜在其它养殖鱼类上推广应用，对养殖鱼类单性育种具有重要意义和应用价值。
图1、半滑舌鳎雌性特异DNA片段的核苷酸序列图2、半滑舌鳎雌性个体和雄性个体遗传性别鉴定结果
具体实施例方式采用分子克隆技术，克隆出性别特异的AFLP片段，建立半滑舌鳎遗传性别鉴定的常规PCR分析技术，这对于培育半滑舌鳎全雌苗种，进行全雌苗种养殖，提高半滑舌鳎的养殖产量，提高养殖的经济效益，真正将半滑舌鳎开发为一个被广大养殖户接受的优良养殖品种，推动半滑舌鳎养殖产业的发展及海水鱼类养殖品种的更新换代，具有重要的现实意义和巨大的经济效益。
下面通过‘半滑舌鳎雌性特异AFLP片段的克隆及遗传性别鉴定的PCR方法的建立’的实施例，结合附图对本发明的技术内容进行详细说明一、半滑舌鳎雌性特异AFLP片段的克隆与序列分析，包括1、雌性特异AFLP片段的回收；2、AFLP片段的克隆；3、序列分析。
1、雌性特异AFLP片段的回收根据雌性特异AFLP标记的筛选结果，选取能扩增出382bp雌性特异AFLP条带的引物组合，进行AFLP扩增，然后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，获得382bp的雌性特异AFLP条带，用无污染的刀片切下含有目的DNA片段的聚丙烯酰胺凝胶，加20μl超纯水，4℃过夜溶解，得到了微量的DNA，回收目的片段备用。
2、AFLP片段的克隆采用商品化的pMD 18-T连接试剂盒将回收的雌性特异AFLP片段，克隆到pMD 18-T载体中，采用标准的CaCl2转化方法将连接产物转化感受态细菌，将转化产物涂布LB培养皿，37℃过夜培养。次日，用灭菌的牙签挑取单菌落，投入3ml LB(含氨卞青霉素)液体培养基中，37℃、250rpm过夜培养。然后采用PCR法筛选目的克隆，从每个样品中取1μl菌液做为模板，用所对应的选择性扩增的引物和反应程序进行扩增，用琼脂糖凝胶电泳检测产物的长度，符合预期长度的样品可以视为阳性克隆。
3、序列分析选取阳性克隆，用ABI3730测序仪进行序列分析。将来自8个阳性克隆的雌性特异AFLP标记的核苷酸序列，用DNAMAN Version 4.0进行多序列比对，其同源性为99.37％，表明各个个体得到的条带是同一个序列。共有序列同源性比对和相似性搜索用BLAST软件进行，在GenBank中没有找到任何同源的序列。半滑舌鳎雌性特异AFLP片段的核苷酸序列(示于图1)。
二、遗传性别鉴定的PCR方法抽取待测半滑舌鳎鱼的血液，提取基因组DNA，根据获得的半滑舌鳎雌性特异片段的序列，设计1对特异引物，Cse-382N1和Cse382C1。提取24个雌性个体和22个雄性个体的基因组DNA，用合成的特异引物进行PCR扩增。优化的25.0μl PCR反应体系为2.5μl 10×PCR缓冲液，1.0μl2.5mM dNTP，2.0μl 10pM引物混合液，基因组DNA 0.8～1.5μl，双蒸水16.3-17μl，Taq酶(5Us/μl)0.2μl。PCR反应步骤为第一步在95℃变性5mins；第二步，95℃变性30s，53.5-54.5℃退火30s，72℃延伸60s，如此进行30个循环；第三步在72℃延伸5mins。如果某个个体产生了特异片段，即可认为这些鱼为遗传上的雌性个体，而没有这些片段的个体则被认为是遗传上的雄性个体。PCR结果表明24个假定的雌性个体都扩增出性别特异的片段，而雄性个体都没有扩增出该片段(图2)。
序列表<110>中国水产科学研究院黄海水产研究所<120>半滑舌鳎雌性特异AFLP片段及遗传性别鉴定的PCR方法<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>358<212>DNA<213>半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)<400>1aattcactga cccctgagag cggcgaagtt aggcagttcg ctgagtccag tgcaaacatc 60aacgttctta tatgccaaca gactttagaa gccaagaatt atgtgtcata tttgttttga 120ctccaggttc agtttactta ggacaaactc agggatttga aatgacgagc aacatcttat 180cgcctcaagt gcacatgggt aaaaagatcc ttccgagcca gggctggaga aagcaggctt 240ctcaggtgac acagtgggtt tggccgagac tagttttaca atgatggtgc cacaaaaaaa 300gaaagggaaa ctctatgagt ggacacagac tgagacattt gtcgtgtgtg agttgtta 358
权利要求
1.一种半滑舌鳎雌性特异AFLP片段的克隆与序列分析，其特征在于它的技术内容包括如下三个方面1)雌性特异AFLP片段的回收；2)雌性特异AFLP片段的克隆；3)雌性特异AFLP片段的序列分析1)、雌性特异AFLP片段的回收选取能扩增出382bp雌性特异AFLP条带的引物组合，进行AFLP扩增，扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，用刀片切下含有382bp雌性特异DNA条带的聚丙烯酰胺凝胶，溶解后回收目的片段备用；2)、雌性特异AFLP片段的克隆将回收的雌性特异AFLP片段，克隆到pMD 18-T载体中，采用标准的方法进行连接和转化，采用常规PCR法筛选含有目的片段的克隆，用琼脂糖凝胶电泳检测产物的长度，符合预期长度的样品可以视为阳性克隆；3)、雌性特异AFLP片段的序列分析选取阳性克隆，用ABI3730测序仪进行序列分析；将来自8个阳性克隆的雌性特异AFLP标记的核苷酸序列，用DNAMAN Version 4.0进行多序列比对，其同源性为99.37％，表明各个个体得到的条带是同一个序列；半滑舌鳎雌性特异AFLP片段的序列为Primer CseF382N1ATTCACTGACCCCTGAGAGCGGCGAAGTTAGGCAGTTCGCTGAGTCCAGTGCAAACATCAACGTTCTTATATGCCAACAGACTTTAGAAGCCAAGAATTATGTGTCATATTTGTTTTGACTCCAGGTTCAGTTTACTTAGGACAAACTCAGGGATTTGAAATGACGAGCAACATCTTATCGCCTCAAGTGCACATGGGTAAAAAGATCCTTCCGAGCCAGGGCTGGAGAAAGCAGGCTTCTCAGGTGACACAGTGGGTTTGGCCGAGACTAGTTTTACAATGATGGTGCCACAAAAAAAGAAAGGGAAACTCTATGAGTGGACACAGACTGAGACATTTGTCGTGTGTGAGPrimer CseF382C1
2.一种半滑舌鳎遗传性别鉴定的PCR方法，其特征在于它的方法是抽取待测半滑舌鳎鱼的血液，提取基因组DNA，根据获得的半滑舌鳎雌性特异片段的序列，设计1对特异引物，CseF382N1和CseF382C1，提取雌性个体和雄性个体的基因组DNA，用合成的特异引物进行PCR扩增，如果某个个体产生了特异片段，即可认为这些鱼为遗传上的雌性个体，而没有这些片段的个体则被认为是遗传上的雄性个体。
全文摘要
一种半滑舌鳎雌性特异AFLP片段及遗传性别鉴定的PCR方法，包括雌性特异AFLP片段的回收、AFLP片段的克隆、序列分析以及半滑舌鳎遗传性别鉴定的PCR方法；建立了分离和克隆半滑舌鳎雌性特异AFLP片段的技术，获得了雌性特异DNA片段，设计了特异的引物，将AFLP标记转化成SCAR标记，创建了半滑舌鳎遗传性别鉴定的PCR技术。本发明首次分离到半滑舌鳎雌性特异的DNA片段，查明了其DNA序列，建立了半滑舌鳎遗传性别鉴定的PCR分析技术。本发明具有先进、高效、准确、可靠的特点，在半滑舌鳎性别控制和单性苗种生产中具有重要应用价值，同时在其它鱼类遗传性别鉴定和性别控制研究中也具有应用前景。
文档编号C12Q1/68GK1880478SQ20061004417
公开日2006年12月20日 申请日期2006年5月12日 优先权日2006年5月12日
发明者陈松林, 李静, 田永胜, 沙珍霞, 王清印, 庄志猛, 徐建勇 申请人:中国水产科学研究院黄海水产研究所