可控发酵的方法和步骤的制作方法

专利名称：可控发酵的方法和步骤的制作方法
技术领域：
本发明涉及对发酵过程中的细胞补料进行控制的新方法和步骤。
背景技术：
发酵是生物技术工业中制备产品的一种重要的方法。例如，许多酶、 抗生素、生化药剂、诊断剂以及治疗剂都是在发酵生产设备中大批量生产 制得的。通常，发酵是通过补料-分批培养、连续或细胞循环的连续培养 在水性状态下完成。
发酵的一个主要目标是实现培养基中细胞产率的最大化。产率通常随 着细胞密度的增加而增加。然而，高密度的培养基存在各种问题，包括 固态和气态基质在水性培养基中的可溶性、基质在增长方面的限制和/或抑 制、基质和产品的不稳定性以及挥发性、产品或代谢副产物会积聚至生长 抑制的程度、产品的降解、C02以及热的高散出率、高的氧需求以及在非
常粘稠的培养基中增加的培养基粘度(Risenberg and Guthke, 1999 )。在发 酵系统中的两个最常测量到的变量是溶解氧(DO)浓度以及发酵培养基的 pH。这些是细胞生理学的关键性指标。
对这些其中一些问题已经研究出相应的解决方法。 例如，Korz等在 1994年描述了一种补料-分批培养技术，其釆用预先确定的恒定补料速率， 在该速率下可防止乙酸积聚。(Korz等，1995年)，Chen等在1997年 描述了一种通过改变营养补料的供给速率以及搅拌速率而对发酵进行控 制(Chen等，1997年)。其它的方法包括随时间增加氧的供给或通过直 接控制pH。 可参考Reisenberg和Guthke在1999的综述。然而，需要 复杂或特定的算法的补料-分批发酵通常难以得到实现、验证并用于生产 中。

发明内容
本发明的发明者们已研发出新的根据溶解氧的程度对发酵系统中的细 胞补料进行控制的方法和步骤。
相应地，本发明提供一种在诱导期对发酵系统中的细胞补料进行控制
的方法，所述方法包4舌
(a) 测定发酵系统中的溶解氧(DO)以及pH水平；
(b) (i)当pH值低于pH-stat (pH-恒定)调定点时提高DO-stat (DO-恒 定)调定点或(ii)当pH值高于pH-stat调定点时降低DO-stat调定点;以及
(c) 当DO水平高于DO-stat调定点时向细胞提供营养补料。 在一种具体的实施方式中，本发明提供一种对包含生长期和诱导期的
发酵系统中的细胞补料进行控制的方法，所述方法包括
(1) 将细胞和培养基添加到发酵系统中；
(2) 测定在生长期内发酵系统中的溶解氧(DO)以及pH水平；
(3) 当DO水平达到预定值时增加系统的气流和搅拌速率至最大值；
(4) 当DO和/或pH水平升高时向系统内加入第 一批营养补料；
(5) 当DO降低时停止加入第一批营养补料，其中DO-stat调定点是通 过将生长期内测得的最低DO值加上一个预设值后确定。
(6) 测定诱导期内发酵系统中的溶解氧(DO)以及pH水平；
(7) (i)当pH值低于pH-stat调定点时提高DO-stat调定点或(ii)当pH值 高于pH-stat调定点时降低DO-stat调定点；以及
(8) 当DO水平高于DO-stat调定点时向细胞提供第二批营养补料。 本发明的一种实施方式为控制发酵的方法，其包括如下步骤
(a) 测定发酵培养基的pH ，其中当pH等于或小于pH恒定调定点 时，提高溶解氧(DO)-恒定调定点；以及
(b) 测定发酵培养基的DO,其中当DO等于或大于DO-stat调定点 时，向发酵培养基中加入营养补料。
其中重复步骤(a)~ (b)直至发酵完成。
本发明的另一种实施方式为实施发酵的过程，其包括如下步骤
通过改变DO-stat调定点将发酵培养基的pH维持在设定值附近，其 中DO-stat调定点的改变毛良比于测定的pH和pH-stat调定点之间的差值； 并且
通过改变营养补料的供给逸率将发酵培养基的DO维持在设定值附 近，且其中营养补料速率的改变是正比于当前DO-stat调定点和上一次 DO-stat调定点之间的差值。
从下面详细的描述中可以看出本发明的其它特性以及优点。然而，应 当理解的是，由于本领域技术人员将能够根据这里的详细描述在本发明精 神和范围内做出各种变化和改变，因此本发明给出的详细描述和具体实施 例仅是出于示例的目的。


现对本发明相关的附图进行描述，其中
图la示出了在1200L的补料分批操作中，46小时发酵以后的pH以及 %DO水平。
图lb是图la的扩展部分，示出了在。/。DO控制补料间隔中的变化。 图2是自动化处理的算法。
具体实施例方式
本发明提供用于可控发酵的改进的方法和步骤，目的是最大化培养基中的 细胞产率。
(A)定义
这里使用的"发酵"表示培养细胞。通常存在两种类型的发酵固 体/半固体态以及水溶性发酵。因此，发酵培养基可为固体或半固体，或 液体。在本发明的一种实施方式中，使用的是水溶性发酵。
这里的"发酵体系"包括在补料-分批、连续或细胞循环的连续培养中 的培养细胞。在本发明的一种实施方式中，发酵为有氧发酵。在本发明 的进一步实施方式中，发酵体系为补料-分批的。
这里使用的术语"补料-分批发酵"表示一种发酵体系，其中物质，如 营养溶液被添加到培养体系中，除了为监控进程取出样品外，通常不会取 出4壬{可物质。
这里使用的"发酵阶段"包括细胞培养的生长期和诱导期。通常，发
酵产品的商业化生产包括两个发酵的阶段。(1)生长和(2)诱导。在生 长期，在促进细胞的生长的条件下对细胞进行培养。而在请导期，在促 进生产由细胞产生的目标产物的条件下对细胞进行培养。
这里使用的"细胞"包括，但不仅限于，细菌、酵母以及真核细胞。细 胞可通过自然方式或通过基因工程或重组DNA技术来产生目标产物。目 标产物包括但不局限于蛋白质、碳水化合物、类脂物以及有机化合物。例 如，目标产物可以为细胞产生的可溶性蛋白质。
这里使用的术语"营养物"或"营养补料"包括，但不局限于，碳源 (如葡萄糖、甘油、其它的碳水化合物以及其它含有这些糖类中的一种或 多种的其它营养溶液)、氮源、前体以及维他命和矿物质。
这里使用的术语"pH-stat"表示通过发酵培养基的pH的测量来控制发 酵或细胞生长的一种方法。通常，测定发酵培养基的pH值并维持其在一 个预先设定的调定点。这里使用的术语"pH-stat调定点"表示为pH值， 其在一特定的发酵系统定义为的一个最优的pH值。
这里使用的术语"DO-stat"表示通过发酵培养基的DO浓度的测量来 控制细胞生长的发酵的一种方法。这里使用的术语"DO-stat调定点"表 示一特定的浓度值。DO-stat调定点通常是在生长期对其进行计算，并定 义为生长期内的最低DO值加上一个预设值(如5-20%),同时维持培养基 的pH在pH-stat调定点附近。 (B)方法
技术领域：
本发明提供一种在诱导期对发酵系统中的细胞补料进行控制的方法， 所述方法包括
(a) 测定发酵系统中的溶解氧(DO)以及pH水平；
(b) (i)当pH值低于pH-stat调定点时提高DO-stat调定点或(ii)当pH值 高于pH-stat调定点时降低DO-stat调定点；以及
(c)当DO水平高于DO-stat调定点时对细胞提供营养补料。 溶解氧以及pH水平可使用本领域已知的技术进行测定，如使用商用探 测器。通常在常规的时间间隔内测定这些值，如每小时一次。每次当 pH水平发生改变时可重复步骤(b)。
使用的营养补料可为任何补料包含碳源如葡萄糖、甘油等以及任何上 面所述氮源。在一种实施方式中，营养补料含有甘油、酵母提取物以及 胰胨。在诱导期，营养补料中也可含有诱导物，其通过细胞而诱导目标 蛋白的基因表达。诱导的方法取决于控制目标蛋白表达的促进剂。例如， 存在温度、pH以及药物可诱导促进剂如金属硫蛋白促进剂、热休克可诱导 促进剂或四环霉素可诱导促进剂。在一种实施方式中，促进剂为L-树胶 醛醣。
pH-stat调定点是针对每个发酵系统确定的定义值，其取决于许多因素 包括，但不局限于，反应溶器的大小、所培养细胞的类型和浓度、要制备 的蛋白质的类型、使用的培养基以及营养补料的类型。当培养的细菌为 如大肠杆菌时，pH-stat调定点通常为7.0-7.5,优选地为7.1-7.3。 表2中 给出了发酵中常用细胞的pH-stat调定点的范围。
pH的水平可使用pH控制试剂进行调节，如碱可增加pH以及酸可降 低pH。在本发明的一种实施方式中，pH控制试剂被用于调节发酵培养基 的pH。 在本发明的另一种实施方式中，未使用pH控制剂来调节发酵培 养基的pH。
相反，通过调节控制着补料的DO-stat调定点来保持pH。
DO-stat调定点是针对每一个发酵系统确定的定义值。DO-stat调定点 通常是将在生长期内测定最低的DO值加上一个预设值后计算得到，同时 维持培养基的pH值在pH恒定调定点附近。预设值是根据每个发酵系统 来确定。本领域的技术人员可确定最合适的预设值,并将该预设值与最低 的％DO值相加从而确定DO-stat调定点。如果与最低的％DO值相加 的预设值太高，那么在诱导期内可能不会触发添加补料。如果预设值太 低，那么在诱导期可能频繁触发添加补料。在一种实施方式中，预设值 从约5%~约20%,优选地从5% ~ 15%。 在具体的实施方式中，预设值 为10% ,这表示DO-stat调定点是将生长期内测得的最低DO水平加上
10%后得到的。
在具体的实施方式中，当pH降低〉0.02pH单位时，DO-stat调定点 在诱导期内增加约2%，或者当pH增加》0.02 pH单位时，DO-stat调定 点在诱导期内降低约2%。当pH水平每次发生改变时可重复该步骤。
DO-stat调定点通常在发酵系统的生长期内确定。在一种实施方式中， DO-stat调定点是通过以下方法确定的，该方法包括
(1) 将细胞和培养基添加到发酵系统中；
(2) 测定在生长期内发酵系统中的溶解氧(DO)以及pH水平；
(3) 当DO升高和/或pH水平升高时向系统内加入营养补料；以及
(4) 当DO降低时停止加入营养补料，其中DO-stat调定点是将生长期 内的最低DO值加上一个预设值后得到。
发酵培养基的DO浓度通常在发酵过程的初期就已最大化。本领域技 术人员可很容易地确定最大的DO浓度。该最大DO浓度的变化可取决于 多种因素，这些因素包括但不局限于发酵罐的大小以及形状、细胞的类型、 细胞初始浓度、生产的产品类型、发酵培养基的类型以及营养补料的类型。 在一种实施方式中，诱导期初始阶段的DO浓度与生长期结束阶段的DO 浓度是相同的。
DO水平在生长期初始阶段是最高的，随后浓度很快下降。 一旦DO 浓度达到预先确定的值，则可通过逐步增加搅拌速率(rpm)和气流至最 高值来将DO浓度维持在该预设值。这样， 一旦进入系统的气流达到最大 值，则不会改变该系统的气流并在发酵过程的剩余时间内均保持在该最大 值。用于触发增加气流和增加搅拌速率的DO预设值将根据每个系统而确 定，并且受到与如上所述相同的用于确定系统初始阶段最大的DO浓度(例 如发酵罐的大小及形状、细胞的类型、细胞初始浓度、生产的产品类型、 发酵培养基的类型以及营养补料的类型)的因素的影响。搅拌速率以及 流速的最大值是根椐发酵条件和发酵罐的大小而预先确定的。例如，在 120L的发酵罐中，搅拌速率和流速的最大设置值分别约为200 rpm和 60L/min。对于1200L的发酵罐，最大的搅拌速率和流速可分别为125 rpm 和564L/min。本领域技术人员可很容易地确定这些参数。例如，搅拌速 率(rpm)可使用公式叶尖速度(cm/min) = :c x Di x RPM/60Di来确定，其 中Di为叶轮直径。流速可使用公式空气体积/培养基体积(VVM)=流速 (L/min)/培养基体积(L)。
表1描述了在生长期如何提高搅拌速率(rpm)以及流速。 一旦达到最 大的搅拌速率(ipm)和流速值，则DO值将降低，这表明培养基中的碳源已 被用尽。随后DO以及pH的上升表明碳源已用尽且加入了营养补料。 在优选的实施方式中，当DO的增加> 10%和/或pH的增加^ 0.1单位 时加入营养补料。在加入营养补料后，则可确定DO-stat调定点。如前 所述，DO-stat调定点是将生长期内测得的最低DO值加上一个预设值而得 到。
在整个生长期，例如可使用OD6(X)来监控整个培养物的生长，从而确定
生长期的结束时间。例如，对于实施例中所描述的系统而言，通常是在 OD6oo为20下进行监控的。
在具体的实施方式中，本发明提供一种在生长期和诱导期对发酵系统 中的细胞培养进4亍控制的方法，所述方法包括
(1) 将细胞和培养基添加到发酵系统中；
(2) 测定在生长期内发酵系统中的'溶解氧(DO)以及pH水平；
(3) 当DO达到预定值时增加系统的气流和搅拌速率至最大值；
(4) 当DO水平升高和/或pH水平升高时向系统内加入第一批营养补
料；
(5) 当DO降^氐时停止加入第一批营养补料，其中DO-stat调定点是通 过将生长期内的最低DO值加上一个预设值后得到；
(6) 测定诱导期内发酵系统中的溶解氧(DO)以及pH水平；
(7) (i)当pH值低于pH预设值时提高DO-stat调定点或(ii)当pH值高 于pH预设值时降低DO-stat调定点；以及
(8) 当DO水平高于DO-stat调定点时对细胞提供第二批营养补料。 为确保补料不会因DO-stat调定点附近的快速波动所引发或终止，DO
控制器中含有DO-stat调定点的死带控制，其作为一种安全预防措施而限 制级联。
术语"死带控制，，-陂定义为一特定范围，在该范围内输入的变化将
不会引发反应。其通常表示为整个范围的一个百分比。DO-stat控制器中 内设有死带增量。这是一个在输入。/。DO调定点和控制器之间的引发或终 止补料的特定增量(如0.5% )。在自动系统中的死带间隔设置由用户来定 义，并可通过观察手动系统的。/oDO波动范围而选择该设置作为系统标准。 在手动系统中，设置的死带被预编程到控制器中。
本领域技术人员将能够认识到，发酵系统在生长期和诱导期内的所 有条件都可针对每种应用而最优化。具体应用的最优条件取决于许多因 素，这些因素包括但不局限于，发酵罐的大小以及形状、细胞的类型、细 胞初始浓度、生产的产品类型、发酵培养基的类型以及营养补料的类型。 表1中列出了小型(120L)和大型(1200L)发酵罐中使用的一些标准参 数。补料速率可以是可变化的(如针对小型发酵罐)或固定的(针对大 型发酵罐)。培养基和营养补料可通过商业购买或用户制备获得。包括 发酵罐和用于测量DO和pH的探测器在内的设备也可通过商业购买获得 或如需要用户可对设备作一定的改进。
发酵反应完成后，可使用如实施例1和2中描述的现有技术从发酵系 统中采集表达蛋白。 (C)自动化控制
测定pH或DO浓度或调节DO-stat调定点或营养补料的供给速率的步 骤可手动完成或通过计算机及或其它机器完成。例如，pH和/或DO浓度 可通过计算机进行监控，或DO-stat调定点或营养补料的供给速率可通过 计算机进行调节。因此，本发明的方法和步骤可全部或部分自动化。
相应地，本发明提供一种用于控制发酵系统中的细胞补料的自动化方 法，该发酵系统包括发酵罐、pH探测器、溶解氧(DO)探测器、补料泵 以及控制DO-stat调定点以及补料泵的可编程控制器，其中该方法包括
(1) 使用pH探测器测定发酵罐中的pH，并且i )如果pH升高超过pH-stat 调定点时，则降低DO-stat调定点或ii)如果pH降低低于pH-stat调定点 时，则升高DO-stat调定点；以及
(2) 使用DO探测器测定发酵罐中的DO水平，并且当DO水平高于
DO-stat调定点时从补料泵中添加营养补料。
可使用上述的方法确定每个系统的DO-stat调定点和pH-stat调定点。 在具体的实施方式，当pH降低> 0.02pH单位时，增加DO-stat调定
点约2%或者当pH增加> 0.02 pH单位，降低DO-stat调定点约2%。 当
pH水平每次发生改变时可重复该步骤。
在自动化的方法中，将pH探测器和DO探测器的输出读数连接到计算
机。当系统仅要求两个正比反馈控制循环时，本发明中的方法特别适合
自动化。
一个控制循环通过使用输出来调节DO-stat调定点以维持pH水
平。另一个控制循环通过调节基于DO-stat调定点的营养补料的补料速率
来控制DO。
已开发出了一种算法，其可不断地监控发酵罐中pH以及溶解氧的 值，并且如图2所示实现了这两个正比-积分反馈控制循环。第一个循环是 由用于控制pH的正比或正比-积分控制器构成，其根据下面的算法来确定 是否需要升高或降低DO控制器的调定点；如果pH偏离系统指定的值达 到0.2,则％00调定点以相应比例但以反比方向变化2。第二个循环是由 确定系统内的Q/oDO是否高于或低于调定点的％DO控制器组成。如果 %DO的增加超过调定点，则软件向泵返回一个信号从而开始添加补料。持 续进行补料直到系统内的yoDO降低到调定点以下，在该调定点系统发出 信号以终止添加补料。补料的加入将提高了细胞的新陈代谢并相应地降 低pH，其可能会触发第一个循环中的。/。DO调定点的改变。相应地，停 止补料将降低细胞的新陈代谢，从而将导致pH的增加，当该变化在第一 个循环中被pH感应器探测到时，系统会发送信号降低o/oDO调定点，其随 后在第二个循环中引发补料。这样，通过控制补料的量来调节新陈代谢, 并在不需要添加酸或碱的情况下实现了对细胞的生长维持严格的pH控制。
在本发明的一种实施方式中，该控制循环会持续到发酵结束。可在一 指定点停止发酵或持续进行发酵直到培养基中的细胞死亡来完成发酵，其 中指定点包括指定的时间点、pH水平、DO水平、细胞浓度、目标产品的 浓度。
在一具体的实施方式中，发酵罐通过商用OPC硬件接口连接到一运行 基于Labview 控制的Cascade软件的个人电脑上。来自于pH和DO控 制器的信号经过硬件接口并通过软件进行解译。然后该软件根据pH来确 定是否需要对DO-stat调定点进行调节，根据需要作出任何调节，然后评 估是否需要开始进行补料。随后向计算机控制的也连接到该系统中的补 料泵中发送一信号。本发明还提供一种用于控制发酵罐中细胞补料的自动 化系统，所述系统包括
(a) —个含有细胞和培养基的发酵罐；
(b) —个向发酵罐提供营养补料的补料泵；
(c) 一个测定发酵罐中pH的pH探测器，且其中pH测量值被接到一个 控制DO-stat调定点的可编程控制器上；以及
d) —个测定发酵罐中DO的DO探测器，且其中DO的测定值被接 到一个控制补料泵的可编程控制器上。
下面使用非限制性的实施例对本发明进行描述 实施例
实施例1: 120 L体积的发酵罐
使用大肠杆菌作为该目标蛋白的表达系统。目标蛋白的发酵包括生 长期以及补料-分批诱导期。 初淋"及接辨"藉姿
1. 获得一瓶大肠杆菌细胞。
2. 获得含有500 mL的2xYT种子培养基的2L烧瓶。
3. 在开始任何工作前使用70%的试剂酒精对生物工作台内的所有组件进 行清洁。在生物安全无菌条件下使用5mL的吸液管及注液器将2.5 mL 的0.5%四环素溶液添加到种子培养基中。
4. 使用70%的试剂酒精对WCB瓶子的外部进行清洁并将其转移至生物 安全拒中。
5. 允许细胞在室温下解冻10分钟~ 20分钟。
6. 使用2mL的吸液管及注液器，并用瓶中1.5mL的细胞悬浮液对培养基 进行接种。轻轻摇晃烧瓶5次使细胞和培养基进行混合。
7. 将接种的烧瓶转移至培养振动器中并设定200rpm土20rpm以及25。C 土 1。C。
8. 使得接种体生长10 hr ± 1 hr。 生长9小时后取出样品用于测定光密 度值。
9. 关闭振动器并且取出初种体烧瓶。使用70%的试剂酒精进行清洁。
10. 将初级接种体烧瓶放入到生物工作台中。
11. 釆用5 mL的血清吸液管在无菌条件下从初种体烧瓶中取出5 mL样品 并;^文入15 mL的离心管中。将烧瓶放回到振动器并重新启动振动器。
12. 使用微吸液管吸取0.5 mL的样品(步骤7.11),并使用5 mL的吸液管 及注液器将其用4.5 mL的无菌2xYT培养基在15 ml的无菌离心管中 进行稀释。在使用无菌2xYT培养基作为空白的分光光度计上测定 OD600。
13. 测定pH值。
14. 在指定的生长时间内重复步骤9 ~ 13直至培养基达到下述规范，OD600 =2.0 - 2.5。 准备好进行二次接种的烧瓶。
15. 获得3个2L的Erlenmeyer烧瓶，每一个烧瓶含有500 mL的2xYT种 子培养基(CPR0306)。在生物安全柜中开始任何工作前使用70%的试 剂酒精对烧瓶进行清洁。在生物安全拒中于无菌条件下使用5mL的吸 液管及注液器将2.5 mL的0.5%四环素溶液添加到每个烧瓶中。
16. 对每个烧瓶使用5mL的培养基(1%)进行接种。
17. 将接种的烧瓶转入培养振动器中并设定200 rpm ± 20 rpm以及25。C ± 。C。
18. 允许4妄种体在烧瓶中生长7 ~ 8小时，并且在8小时的生长时间后检查 OD。 在OD > 1.6时对培养物进行革兰氏染色。监控生长过程直到 OD达到2.0-2.5。
19. 关闭振动器并且取出一个二次接种烧瓶，使用70%的试剂酒精进行清 洁。将接种烧瓶》文入到生物安全拒中。
20. 釆用5 mL的血清吸液管在无菌条件下从一个接种体烧瓶中取出5 mL 样品并》文入15 mL的离心管中。将烧瓶放回到振动器并重新启动振动 器。
21. 使用微吸液管吸取0.5 mL的样品(步骤7.11),并使用5 mL的吸液管 及注液器将其用4.5 mL的无菌2xYT培养基在15 ml的无菌离心管中 进行稀释。在使用无菌2xYT培养基作为空白的分光光度计上测定 OD600o
22. 测定pH值。
23. 对培养基进行革兰氏染色。将2.5mL的培养基加入到15mL的离心管 中并提交给QC进行检测。如果革兰氏染色为阴性则进行容器接种。
"处工芈容f好C^附邵发發攀遂并
1. 确保120L发酵罐已清洁并用于培养基制备。在无菌条件下从发酵罐中 取出约30 -50 mL的TB培养基。
2. 校准DO探测器至100%。
3. —旦种子烧瓶的OD6oo处于2.0-2.5的范围内，即对生物工作台内的装 有1200mL ± 25mL的2L无菌接种体组装瓶进行测定。将接种线通 过一个注射端口在无菌条件下连接到容器的磁头板(headplate)上并且 通过Chemap蠕动泵将接种体转移到容器中。
监控生长建立DO调定点
培养基 TB培养基每一升pH为7.0 ± O.l的反渗透(RO) 水中加入12 g的胰蛋白胨、24 g的酵母提取物(YE)、 2.31g的磷酸二氢 钾、12.5g的磷酸氬二钾、5g的甘油。在121° C消毒30分钟。
甘油补料(补料1): 将250g的甘油加入到最终容量为500mL的 RO水中。 在121° C消毒30分钟。
设备在经校验的150L的Chemap发酵罐(120 L的工作容量)中 进行发酵过程，该发酵罐由数字pH显示仪以及用于调节温度和搅拌速率 (rpm)的自动化控制器构成。相关的独立自动化溶解氧(DO)控制器 维持着对补料物的控制。
一旦完成杀菌过程后，设置混合的初始值为146rpm以
及空气流速的初始值为24 L/min。在整个过程中维持温度在25° C ± 1 ° C。(表1)发酵罐在接种前的12-16小时已准备好，以确保溶解氧和pH 探测器在发酵操作温度下处于稳定状态。
过程中测试和验收标准 在过程中测试发酵培养基的无菌性是为 了确保开始的生产培养基是无菌的。
监控空气流速(L/min)和混合速度速率(rpm)的緩'漫升高阶萃史是为了 确保稳定的细菌生长以及培养基的新陈代谢状态。
为了确保培养基的新陈代谢状态的稳定性以及由此得到的稳定的生 产过程，在维持pH为7.2±0.1的条件下监控发酵培养基中的OD600，使其 在17 ± 2小时内的验收标准为15 - 18。
1. 从发酵罐中取出30mL的样品，5分钟后测定0D和pH值。
2. 监控发酵罐中的溶解氧(DO%)。 对于该系统，在生长期内选择的DO 调定点为41%。 从起始"&置24 L/min和146 rpm开始，分别逐步增加 气流以及搅拌器的RPM直至达到该系统确立的最大设置60 L/min以及 200rpm，以维持最小的DO。/o在41% ± 2%。
3. 至少每隔3小时从容器中取出30mL的培养基用以监控pH和OD值。
4. 在气流和RPM达到最大值后，密切监控培养基的生长以观察DO。/。和 pH的变化。显著的DO升高(>10%)以及pH的升高(>7.1)表明提供的 培养基已消耗干净。DO%控制器在获得这些DO和pH值后被激活 从而向培养基中添加"补料l" (50%的甘油水溶液)以维持培养基的生 长。
5. 在第一次开始补料后，注意DO。/。降低到最低点。
6. 在开始补料1并维持培养基的pH在7.10-7.2后，将生长期内得到的 最小DO值加上10%从而计算得到剩余生长期以及初始诱导期的DO调 定点。
7. 对于剩余的生长期来讲，该初始DO。/。调定点确定了补料l的添加。 诱导蛋白质的制备维持稳定的pH水平
培养基TB培养基每一升pH为7.0 ± O.l的反渗透(RO) 水中加入12 g的胰蛋白胨、24 g的酵母提取物(YE)、 2.31g的磷酸二氢
钾、12.5g的磷酸氢二钾、5g的甘油、0.133mL的聚乙二醇P2000(防沫剂)。 在121° C消毒30分钟。
诱导补料(补料2 ): 在121° C对2400 g的甘油消毒30分钟。将 800g的L-树胶醛醣'溶解在1800mL的RO水中并添加到冷却的甘油溶液中。 制备两批相同的组合物。
设备在经校验为HOL的Chemap发酵罐(120 L的工作容量)中 进行发酵过程，该发酵罐含有一个数字pH显示仪以及用于调节温度和搅 拌速度(rpm)的自动化控制器。相关的独立自动化溶解氧(DO )控制 器维持着对补料的控制。
维持混合速率在200rpm以及气流在60 L/min。维持整 个过程的温度在25。 C ± 1° C。
pH维持在7.2 ± 0.1 (表1)。
过程中测试以及验收标准 在过程中测试发酵培养基的无菌性是 为了确保开始的生产培养基是无菌的。
1. 每隔1小时从容器中取出30mL的发酵液用以监控pH和OD值。一 旦制备的培养基中OD,达到20 ± 1，将发酵罐补料切换到"补料2"
(含有0.17% L-树胶醛醣的50%的甘油水性溶液)以在超过46小时的 时间内进行诱导蛋白表达。
2. 监控培养基的pH。在整个诱导后期维持pH范围在7.2 ± 0.1。当观 察到pH值降低0.02单位时，提高DO%调定点2个单位。在整个补 料阶段调节DO调定点以维持培养基的pH值在正确的范围内。
3. 当培养基的DO超过DO调定点时触发补料添加，并持续添加补料2直 到培养基的DO降低到调定点以下。
4. 按照表l中指定的针对该尺寸发酵罐的数据调节泵的供给速率。在整 个诱导补料后期调节泵的速率以助于控制培养基的pH值。
5. 在0， 18,36,42和46小时的诱导期后取得样品(60 ± 10 mL的发酵液) 并提交给质量控制(QC)中心进行产品测试。
6. 培养基可生长46hrs土15mins。 耒襄
1. 将采集管从发酵罐的采集阀门连接到给离心机供料的泵的进口。将管 子从泵的出口连接到离心机的进口 。
2. 将管子从离心机的出口连接到热交换系统的底部，然后从热交换机的顶 部连接到微过滤系统的釆集罐的顶部。
3. 将固体采集罐连接到离心机的固体排放口。
4. 在釆集时改变温度调节点到4° C。
5. 启动离心机并等候4分钟以达到最高转速。
6. 打开发酵罐的采集阀并以25 Hz的频率启动泵，卸料时间为IO分钟并 设置出口压力f殳定为75 psi。
7. 在离心机的输出线路中调节调整阀门使得离心机内的压力为75psi。
8. 5分钟间隔后从离心机的出口线路得到20ml离心分离的培养基的上层 清液并读取OD600。
9. 将培养基的上层清液收集到一清洁的罐中。
10. 当培养液通过离心机泵出后，手动排出培养液并关闭离心机。
11. 断开管路并将剩余的上层清液倒入到采集罐中。
12. 以20Hz的频率启动樣￡过滤泵。
13. 通过调节泵的速率维持系统进口速率在35 ± 5psi。
14. 将微过滤的上层清液收集到一清洁的罐中。
15. 当上层清液的量降低到2L时停止微过滤系统。
16. 对微过滤的上层清液进行称重。现在准备对蛋白质进行提纯。
实施例2: 1200 L体积发酵罐
使用大肠杆菌作为该目标蛋白的表达系统。目标蛋白的发酵包括生 长期以及补料-分批^^导期。
^7#糸"及凝#潜#^好##
1. 获得一瓶大肠杆菌细胞。
2. 获得含有500 mL的2xYT种子培养基的2L烧瓶。
3. 在开始任何工作前使用70%的试剂酒精对生物工作台上的所有组件进 行清洁。在生物无菌条件下使用5mL的吸液管及注液器将2.5 mL的 0.5 %四环素溶液添加到种子培养基中。
4. 使用70%的试剂酒精对WCB瓶子的外部进行清洁并将其存放至生物 安全柜中。
5. 允许细胞在室温下解冻10分钟~ 20分钟。
6. 使用2 mL的吸液管及注液器，并用瓶中1.5 mL的细胞悬浮液对培养基 进行接种。轻轻摇晃烧瓶5次将细胞和培养基进行混合。
7. 将含有接种物的烧瓶转入培养振动器中并设定200 rpm ± 20 rpm以及 25。C± 1。C。
8. 使得接种体生长10 hr ± 1 hr。 生长9小时后取出样品用于测定光密 度值。
9. 关闭振动器并且取出初种体烧瓶。使用70%的试剂酒精进行清洁。
10. 将初种体烧瓶放入到生物工作台中。
11. 采用5 mL的血清吸液管在无菌条件下从初种体烧^f瓦中取出5 mL样品 并放入15 mL的离心管中。将烧瓶放回到振动器并重新启动振动器。
12. 使用微吸液管吸取0.5 mL的样品(步骤7.11),并使用5 mL的吸液管 及注液器将其用4.5 mL的无菌2xYT培养基在15 ml的无菌离心管中 进行稀释。在使用无菌2xYT培养基作为空白的分光光度计上测定 OD600。
13. 测定pH值。
14. 在指定的生长时间内重复步骤9-13直至培养基达到下述规范，OD600 =2.0 - 2.5。 准备在种子发酵罐中进行接种。
15. 将75 ml的0.5%四环素以及150 ml的接种培养基转移到27L的含有15 L的2xYT种子培养基的Braun发酵罐中。
16. 使培养基在300 ± 20 rpm, 12L/min气流以及25°C ± 1°C的条件下进行 生长。
17. 允许接种体生长7~8小时，并且在8小时的生长时间后检查0D。 监 控生长过程直到OD达到2.0 - 2.5。
18. 在无菌条件下取出30mL样品。
19. 使用微吸液管吸取0.5 mL的样品(步骤7.11)，并使用5 mL的吸液管 及注液器将其用4.5 mL的无菌2xYT培养基在15 ml的无菌离心管中 进行稀释。在使用无菌2xYT培养基作为空白的分光光度计上测定 OD600。
20. 测定pH值。
21. 对培养基进行革兰氏染色。将2.5mL的发酵液加入到15mL的离心管 中并提交给QC进行检测。如果革兰氏染色为阴性则进行容器接种。
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1. 确保1200L发酵罐已清洁并用于培养基制备。在无菌条件下从发酵罐 中取出约30 -50 mL的TB培养基。
2. 校准DO探测器至100%。
3 —旦种子烧瓶中的ODeoo达到2.0-2.5，则将接种物转移到生产容器中。 在无菌条件下将传送管路连接到1200 L发酵罐的接种管路以及27L发 酵罐的采集管路上。 4.将27L发酵罐加压到8-10 psi并从27 L发酵罐中转移12L到含有1200 L
的TB培养基且pH为7.0 ± 0.1的1200 L发酵罐中。 监控生长确定DO调定点
培养基TB培养基每一升的反渗透(RO)水中加入12 g的胰 蛋白胨、24 g的酵母提取物(YE)、 2.31g的磷酸二氢钾、12.5g的磷酸氢 二钾、5g的甘油，pH7.0 ± 0.1。
在121° C消毒30分钟。
甘油补料(补料1): 将250g的甘油加入到最终容量为500mL的 RO水中。在121° C消毒30分钟。
设备在经校验为1500L的ABEC发酵罐(1200 L的工作容量) 中进行发酵过程，该发酵罐含有一个数字pH显示仪以及用于调节温度和 搅拌速率(rpm)的自动化控制器。相关的独立自动化溶解氧(DO)控 制器维持着对补料的控制。
一旦完成杀菌过程后，设置混合的初始值为53 rpm以及 空气流速的初始值为240 L/min。在整个过程中维持温度在25° C ± 1°
C。(表l)发酵罐在接种前的12-16小时已准备好，以确保溶解氧和pH探 测器在发酵操作温度下处于稳定状态。
过程中测试以及验收标准在过程中测试发酵培养基的无菌性是 为了确保开始的生产培养基是无菌的。
监控空气流速(L/min)和混合速度(rpm)的慢升高阶段是为了确保稳 定的细菌生长以及培养基的新陈代谢状态。
为了确保培养基新陈代谢状态的稳定性以及由此得到的稳定的生产 过程，在维持pH为7.2 ± 0.1的条件下监控发酵培养基中的OD600，其在 17±2小时内的验收标准为15-18。
1. 从发酵罐中取出30mL的样品，在5分钟后测定OD和pH值。
2. 监控发酵罐中的溶解氧(DO%)。 对于该系统，生长期内选择的DO 调定点为41%。 从起始设置240 L/min和53 rpm开始，分别逐步增加 气流以及搅拌器的RPM直至达到该系统确立的最大设置564 L/min以 及123rpm，以维持最小的DO。/o在41% ± 2%。
3. 至少每隔3小时从容器中取出30mL的培养液用以监控pH和OD值。
4. 在气流和RPM达到最大值后，密切监控培养基的生长以观察DO。/。和 pH的变化。DO升高^10。/。)以及pH的升高(>7.1)表明提供的培养基已 消耗干净。DO%控制器获得这些DO和pH值后被激活从而以43 g/min的速度向培养基中添加"补料r (50%的甘油水溶液)以维持培 养基的生长。
5. 在第一次开始补料后，注意到DO。/o降低至最低点。
6. 在开始补料l并维持培养基的pH在7.10-7.2后，将生长期内得到的 最小DO值加上10%从而计算得到剩余生长期以及初始诱导期的DO调 定点。
7. 对于剩余的生长期来讲，该初始DO。/。调定点确定了补料l的添加。 诱导蛋白质的制备维持稳定的pH水平
培养基TB培养基每一升pH为7.0 ± O.l的反渗透(RO) 水中加入12 g的胰蛋白胨、24 g的酵母提取物(YE)、 2.31g的磷酸二氢 钾、12.5g的磷酸氬二钾、5g的甘油、0.133mL的聚乙二醇P2000(防沫剂)。 在121° C消毒30分钟。
诱导补料(补料2 ): 在121° C对2400 g的甘油消毒30分钟。将 800g的L-树胶醛醣溶解在1800mL的RO水中并添加到冷却的甘油溶液中。 制备两批相同的组合物。
设备在校验为1500L的ABEC发酵罐(1200 L的工作容量)中 进行发酵过程，该发酵罐含有一个数字pH显示仪以及用于调节温度和搅 拌速度(rpm)的自动化控制器。相关的独立自动化溶解氧(DO)控制 器维持着对补料的控制。
维持混合速率在123rpm以及气流在564 L/min。维持整 个过程的温度在25。 C ± 1° C。 维持pH在7.2 ± 0.1 。 泵补料的速 率在43 g/min (表1 )。
过程中测试以及验收标准 在过程中测试发酵培养基的无菌性是 为了确保开始的生产培养基是无菌的。
1. 每隔1小时从容器中取出30mL的发酵液用以监控pH和OD值。一 旦制备的培养基中OD600达到20 ± 1，将发酵罐补料切换到"补料2"
(含有0.17% L-树胶醛醣的50%的甘油水性溶液)以在超过46小时的 时间内进行诱导蛋白表达。
2. 监控培养基的pH。 在整个诱导后期维持pH范围在7.15 ± 0.1。当 观察到pH值升高/降低0.02单位时，降^/提高DO%调定点2个单位。 为了维持培养基的pH值在正确的范围内，在整个补料阶段调节DO调 定点(图1 )。
3. 当培养基的DO超过DO调定点时触发补料添加，并持续添加补料2直 到培养基的DO降低到调定点以下(图1 )。
4. 对该尺寸的发酵罐维持泵补料的速率在43g/min。
5. 在0， 18,36,42和46小时的诱导期时间点取出样品(60 ± 10 mL的培 养液)并提交给质量控制(QC)中心进行产品测试。
6. 培养基可生长46hrs土15mins。 ^襄
1. 将采集管从发酵罐的采集阀门连接到给离心机供料的泵的进口。 将管 子从泵的出口连接到离心机的进口 。
2. 将管子从离心机的出口连接到热交换系统的底部，然后从热交换机的顶 部连接到微过滤系统的釆集罐的顶部。
3. 将固体采集罐连接到离心机的固体排放口。
4. 在采集时改变温度调节点到4 ° C。
5. 启动离心机并让其在最高转速工作4分钟。
6. 打开发酵罐的釆集阀并以25 Hz的频率启动泵，卸料时间为10分钟并 设置出口压力为75 psi。
7. 在离心机的输出线路中调节调整阀门使得离心机内的压力为75psi。
8. 在5分钟后可从离心机的出口得到20ml离心分离的培养基的上层清液 并读取OD600。
9. 将培养基的上层清液收集到一清洁的罐中。
10. 当培养基通过离心机泵出后，手动分离培养基并关闭离心机。
11. 断开管路并将剩余的上层清液倒入到采集罐中。
12. 以20 Hz的频率启动微过滤泵。
17. 通过调节泵的速率维持系统进口速率在35 ± 5psi。
18. 将微过滤的上层清液收集到一清洁的罐中。
19. 当上层清液的量降低到2L时停止微过滤系统。
20. 对微过滤的上层清液进行称重。现在准备对蛋白质进行提纯。
实施例3: 自动化
在实施例1和2中手动调节发酵过程中的溶解氧调定点。具体地， 当细胞生长导致pH发生改变则手动控制溶解氧调定点，其遵循下述算法 如果pH值偏离系统指定的值，对o/oDO调定点做相应比例但反方向的改变， pH变化0.2=%00调定点变化2%。该系统的筒易性有利于实现自动化。
该系统的示意图见图2，其含有一pH电极、 一溶解氧电极、 一运行 OPC服务器软件(硬件通讯软件)的个人电脑、 一运行LabviewTM Cascade
补料控制软件的个人电脑以及一个补料泵。
Cascade控制软件设计用于对％ DO调定点的调节实现自动化。该 软件的优点在于具有可视化的数据流并且可在执行时(如发酵过程中)进 行编译。这就形成了灵活的以及可定制的自动化解决方案。开发出的 一种算法可持续监控发酵罐中的pH和溶解氧值并实现两个正比-积分反馈 控制循环。第一个循环由pH控制的正比或正比-积分控制器构成，其根 据下述算法确定是否升高或降低DO控制器的调定点；如果pH偏离系统 指定值0.2，则。/。DO调定点按比例但向相反方向改变2。 第二个循环由 0/oDO控制器构成，其确定y。DO是否处于、高于或低于系统的调定点。如 果o/oDO增加超过调定点，则软件返回一个信号至泵从而开始添加补料。持 续进行补料直到系统内的o/oDO降低到调定点以下，在该调定点处系统发 出信号以终止添加补料。补料的添加提高了细胞的新陈代谢并相应地降 低了 pH,其可能会触发第一个循环中的。/。DO调定点的改变。相应地， 停止补料降低了细胞的新陈代谢会导致pH的增加，当该变化在第一个循 环中被pH感应器探测到时，系统会发送信号降低。/oDO调定点，其又在第 二个循环中引发补料。这样，通过控制补料的量来调节新陈代谢,并在不 需要添加酸或碱的情况下实现了对细胞的生长维持严格的pH控制。
Lab View 和National Instruments Industrial Automation OPC月良务器软 件包被用来创建控制器软件。 可使用来自于National Instruments (for I/O with PLCs)或National Instruments FieldPoint I/O bricks (4-20 mA 1/0)的商 用Lookout OPC服务器来实现控制器和发酵罐之间的交互。这使得相同 的软件能够尺度独立并简化技术转让。参见图2
尽管本发明已通过当前认为的优选的实施例进行了描述，但应知晓本 发明并不局限于这些公开的实施例。相反，本发明意在包括各种在本发 明精神和后附的权利要求范围之内的各种变形和替代的组合。
这里提及的所有的公开的内容、专利和专利申请均经引用而全部并 入本文，正如每个独立公开的内容、专利和专利申请经引用而全部并入本 文。
表l: 标准系统设立的Wt
有机体 枯草杆菌
蛋白质 透明质酸
pH
7.0 ± 0.4
温度 参考文献 37° C Widner等，2005
1200 L
1. 53 70 80 105
123 (最高)
气流
pH
温度
补料速率(诱导后期)1.2.4.
240 324 396 480
564 (最高)
120L和1200L补料-分批发酵的标准参数 ^!t 120 L
1. 73
2. 97
搅拌器RPM 3. 122
4. 146
5. 170
6. 200(最高)
1. 24
2. 32
3. 40
4. 48
5. 56
6. 60(最高)
7.15 士 0.1 7.15 士 0.1
25° C 25° C
0小时33 ±1 43 ± 1
3小时25士 1 16小时15 ± 1 23小时11 ± 1 32小时5 ± 1
注意在生长期的。/。DO低于4P/。时逐步增加搅拌器RPM以及气流速率' 可根据公式对不同尺寸的发酵罐进行计算得到这些参数。 VVM=气流(L/min)/体积(L) VVM气流体积/培养基体积 搅拌器速率的叶尖速度(cm/min) = 7rxDixRPM/60 Di是叶轮的直径 备种有机体的发酵培养条件
麦角固醇
嗜酸细胞活化趋化 因子 (eotaxin)
巴斯德毕赤酵母多种蛋白质的综合
5 ± 0.1
3.5
7.5 无指定
3-7
30° C± 1 75。 C 35。 c 37° C后15。 C
23-30° C
Shang等，2005 Krahae等，1996 Krahae等，1996 Suzuki等，2006
Cos等，2006
母素菌菌
酵霉球杆
酒菌海肠
酿噬古大
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权利要求
1.一种在诱导期对发酵系统中的细胞补料进行控制的方法，所述方法包括(a)测定发酵系统中的溶解氧(DO)以及pH水平；(b)(i)当pH值低于pH-stat调定点时提高DO-stat调定点或(ii)当pH值高于pH-stat调定点时降低DO-stat调定点；以及(c)当DO水平高于DO-stat调定点时对细胞提供营养补料。
2. 权利要求1的方法，其中DO-stat调定点通过如下方法确定，该方 法包括(1) 将细胞和培养基添加到发酵系统中；(2) 测定在生长期内溶解氧(DO)以及pH水平；(3) 当DO水平升高和/或pH水平升高时向系统内加入营养^卜料； 以及(4) 当DO水平降低时停止加入营养补料，其中DO-stat调定点是 将一个预设值与生长期内测得的最低DO值相加后确定。
3. 4又利要求2的方法，其中当DO水平升高> 10%和/或pH水平升 高> O.l单位时，在步骤(3)中加入营养补料。
4. 权利要求2或3的方法，其中当DO水平达到预设值时，在步骤3 ) 之前增加发酵系统中的搅拌器速率以及气流水平。
5. 权利要求4的方法，其中增加搅拌器速率以及气流至最大值并在剩 余的发酵过程中保持在该最大值。
6. 权利要求2-5中任一项的方法，其中DO-stat调定点是将5%-20% 与生长期内测得的最低DO水平相加得到。
7. 权利要求2-5中任一项的方法，其中DO-stat调定点是将5。/。- 15% 与生长期内的最《氐DO水平相加得到。
8. 权利要求2~5中任一项的方法，其中DO-stat调定点是将10%与生 长期内的最低DO水平相加得到。
9. 权利要求1 ~5中任一项的方法，其中pH-stat调定点为7.0 ~ 7.5。
10. 权利要求6的方法，其中pH-stat调定点为7.1~7.3。
11. 权利要求1~7中任一项的方法，其中细胞为大肠杆菌。
12. 权利要求1 ~8中任一项的方法，其中在步骤(b)中，当pH降 低> 0.02 pH单位时，增加DO-stat调定点约2%或当pH增加> 0.02 pH 单位时，降低DO-stat调定点约2%。
13. 权利要求1~9中任一项的方法，其中发酵方式为补料-分批发
14. 权利要求1~10中任一项的方法，其中营养补料含有葡萄糖、 甘油、其它的碳水化合物以及其它含有这些糖类中的一种或其组合的营养 溶液。
15. —种用于控制发酵系统中的细胞补料的自动化方法，该发酵系 统包括发酵罐、pH探测器、溶解氧(DO)探测器、补料泵以及控制DO-stat 调定点以及补料泵的可编程控制器，其中该方法包括(1) 使用pH探测器测定发酵罐中的pH，并且i)如果pH升高超 过pH-stat调定点时，则降低DO-stat调定点或ii)如果pH降 低低于pH-stat调定点时，则升高DO-stat调定点；以及(2) 使用DO探测器测定发酵罐中的DO水平，并且当DO水平高 于DO-stat调定点时使用补料泵添加营养补料。
16. 权利要求12中的自动化方法，其中在步骤(l)中，当pH降低 > 0.02 pH单位时增加DO-stat调定点约2%，或者当pH增加〉0.02 pH 单位时降低DO-stat调定点约2%。
17. 实现权利要求1-12中任一项方法的自动化系统，所述的系统 包括(a) —个含有细胞和培养基的发酵罐；(b) —个向发酵罐提供营养补料的补料泵；(c) 一个用于测定发酵罐中pH的pH探测器，其中pH的测定值被连#~到一个控制DO-stat调定点的可编程控制器上；以及(d) —个用于测定发酵罐中DO的DO探测器，其中DO的测定值被连接到 一个控制补料泵的可编程控制器上。
18. 权利要求13的自动化系统，其中pH探测器和DO探测器被连 接至一控制DO-stat调定点和补料泵的计算机。
全文摘要
本发明涉及可控发酵的方法和步骤。两个正比反馈控制循环通过级联的方式实现。一个控制循环通过调节溶解氧恒定调定点来维持pH。另一个控制循环使用最新调节的溶解氧调定点来调节营养补料供给速率从而维持溶解氧水平。
文档编号C12M1/36GK101351543SQ200680050244
公开日2009年1月21日 申请日期2006年11月7日 优先权日2005年11月7日
发明者丹尼斯·博斯克, 达瑞尔·玛努塞恩 申请人:维文蒂阿生物技术股份有限公司