专利名称：：测量吸附变应原酶的酶活性的方法
技术领域：
：本发明涉及测量疫苗制剂中的一种或多种变应原酶的酶活性，且从而获得疫苗制剂中的免疫活性的指示和/或变应原酶的量的定量的体外方法。
背景技术：
：蛋白质与表面的相互作用是具有生理意义和技术意义的广泛^H人的现象。重要的例子是在过敏症疫苗中蛋白质变应原向佐剂氢氧化铝的吸附。佐剂是在疫苗接种后通过增强免疫应答起作用的化合物。氢氧化铝的佐剂效应已得到大量研究并且关于机制的众多理论已被提出。用于例如皮下注射的过敏症疫苗可以通过将变应原的水溶液和固相载体例如氢氧化铝凝胶混合以产生混合物进行制备，其中至少一部分变应原吸附到固相上，而部分变应原或无变应原在液相中。固相载体可以充当佐剂，即它增强变应原的免疫应答，尽管增强作用的机制未必充分了解。同样，变应原向固相载体的吸附机制和性质未必充分了解，且可能强烈取决于涉及的变应原的类型。然而，理论上，向氢氧化铝凝胶的吸附部分涉及静电力。对于蛋白质，认为磷酸化蛋白的磷酸基也与氢氧化铝凝胶相互作用，且可能在某种程度上代替凝胶结构中的氢氧化物基团。氢氧化铝的蛋白质吸附能力已用模型蛋白质卵白蛋白(0A)和牛血清白蛋白(BSA)进行彻底研究。近来，已进行关于蛋白质向氢氧化铝的吸附的结构影响的研究。发射荧光测量连同差示扫描量热法指出重大结构改变在0A和BSA向氢氧化铝吸附后发生(Jones等人，EffectsofAdsorptiontoAluminiumSaltAdjuvantsontheStructureandStabilityofModelProteinAntigens,r/e/0w/7a/o/"C力e历/WiT,第280巻，第13406-13414页，2005)。相反另一项研究指出在ELISA实验中氢氧化铝的存在帮助OA维持天然构象(Houen等人，ANon-denaturingEnzymeLinkedImmunosorbentAssayWithProteinPreadsorbedOntoAluminiumHydroxide，/o固a/0//顶迈,/0^/"/#"力0&，第200巻，第99-105页，1997)。OA在转移至微量滴定板孔的塑料表面前吸附到氢氧化铝上，维持其结合针对天然形式的OA产生的单克隆抗体的能力。与此相反，未与氢氧化铝一起预温育的OA与针对热变性的白蛋白产生的单克隆抗体结合。然而，这些技术未给出关于蛋白质混合物中存在的单个蛋白质的任何信息。氩氧化铝对变应原的结构和稳定性的影响从几个角度看来是重要的。构象表位在吸附期间可能丧失并且免疫原性可能由于经过长时间段的5&藏而改变。吸附的程度随所讨论的具体变应原的性质而变。在以生物材料提取物形式的变应原的情况下，例如草花粉变应原的提取物，该提取物包含许多不同离子和分子，其潜在地干扰变应原与固相载体的结合。房尘竭(HDM)屋尘蹒("er顶afo;Aago/i/esj^er<9/2j^s//ws)是吸入变应原的主要来源。蛋白质变应原Derp1和Derp2视为Derp变应原中的2种最强力的变应原。Derp1的结构和酶活性已得到充分表征。几项体外研究暗示Derp1的半胱氨酸蛋白酶活性增强变应原的效力，例如通过切割肺上皮中的紧密连接蛋白质和切割人B细胞上的CD23(低亲和力IgE受体)(Jacquet等人，BiochemicalandImmunologicalCharacterizationofaRecombinantPrecursorformoftheHouseDustMiteAllergenDerp1producedbyiroso/7A//acells,C7//7/ca/a;2WA77er/迈e/^a7J//er^7,第30巻，第784-793页，2000)。基于氩氧化铝佐剂的HDM疫苗包含纯化的HDM提取物作为活性药物成分(API)。变应原活性和诱导变态反应的潜力可以例如通过下述进4亍测试在致敏动物中的皮内注射，和测量各种症状的变化(Kildsgaard等人，Assessmentoftheinvivoallergenicpotencyofnewallergyvaccinesbyintradermaltestinginsensitisedmice,ClinicalImmunologyandAllergyinMedicine,Proceedingsofthe21stEAACI对照gress2002，Naples,Italy)。然而，此类体内方法是费力费时的，并且它们使得测试动物的使用成为必需，这是不希望的。迄今基于用于制备即用型固相载体疫苗的变应原溶液的免疫活性的测量在体外评估疫苗的免疫活性已成为常见实践。WO2005/022157公开了评估以分子抗原和载体的混合物形式的疫苗制剂的免疫活性的体外方法，其中混合物包含液相和固相，至少一部分抗原连到固相上，该方法包括下述步骤i)对疫苗实施选自下述的免疫活性测量a)使用免疫测定法的抗体结合能力，利用与抗体固相结合的抗原特异性抗体，b)激活效应细胞的能力和c)诱导过敏反应的潜力；和ii)使用测量结果以评估疫苗的免疫活性。变应原向含氧金属盐佐剂吸附的性质是非常复杂的且在很大程度上未知的，并且也预期在不同的变应原和不同的含氧金属盐中改变。本发明的目的是提供评估和定量基于含氧金属盐佐剂的过敏症疫苗制剂例如即用型疫苗的免疫活性的新型体外方法。发明概述根据本发明的一个方面，提供了测量以一种或多种变应原酶和含氧金属盐佐剂的混合物形式的疫苗制剂的免疫活性的方法，其中混合物包含液相和固相，且其中至少一部分变应原酶吸附到固相上，所述方法包括下述步骤在酶活性测定法中测量混合物的酶活性，和使用获得的测量结果作为疫苗制剂的免疫活性的指示。根据本发明的一个进一步的方面，提供了用于定量以一种或多种变应原酶和含氧金属盐佐剂的混合物形式的疫苗制剂中的变应原酶的量的方法，其中混合物包含液相和固相，且其中至少一部分变应原酶吸附到固相上，所述方法包括下述步骤在酶活性测定法中测量混合物的酶活性，和使用获得的测量结果用于定量变应原酶的量。附图简述图1显示Derp1的纯化流程图。图2a显示合成底物Z-FR-AMC的荧光以及荧光信号和底物浓度之间的关联。图2b显示AMC标准曲线a)高至500uMAMC的AMC标准曲线，和b)a的线性范围。图3显示最佳酶和底物浓度的研究，其中a)显示作为底物浓度函数的活性，和b)显示作为酶浓度函数的活性。图4显示100jug/mL木瓜蛋白酶土1.14mg/mL氢氧化铝和单独的1.14mg/mL氬氧4匕铝的A28。。图5显示1.14mg/mL氢氧化铝的沉淀时间过程。图6显示氢氧化铝对AMC的影响。将对照样品的A^与上清液样品的A，比较。图7显示在氢氧化铝的存在和不存在下AMC的时间研究。图8显示底物Boc-QAR-AMC和Z-FR-AMC的吸光度镨。图9显示氢氧化铝对底物Z-FR-AMC的影响，其测量为a)"5终末点测量和b)木瓜蛋白酶活性测量。图10显示氢氧化铝对底物Boc-QAR-AMC的影响，其测量为a)A325终末点测量和b)木瓜蛋白酶活性测量。图11显示氬氧化铝对木瓜蛋白酶活性的影响，使用恒定浓度的半胱氨酸蛋白酶特异性抑制剂E64。图12显示来自使用木瓜蛋白酶和氢氧化铝的吸附实验的样品的概况。图13显示来自使用Derp1和氢氧化铝的吸附实验的样品的概况。图14显示在氢氧化铝的存在和不存在下不同样品的Derpl活性。图15显示在氢氧化铝的存在下Derp1的米-曼二氏(Michaelis-Menten)曲线。图16显示IgE结合的抑制。不连续线从氢氧化铝上洗脱的Derp1(洗脱液)，连续线在不存在氢氧化铝的情况下的对照Derp1(对照1)。定义如本文所使用的，表述"体外方法"意指可以在活生物体外进行的方法。如本文所使用的，表述"免疫活性"意指免疫系统的任何变应原特异性应答，包括免疫球蛋白介导的免疫应答。如本文所使用的，表述疫苗制剂的"固相"和"液相"意指由于含氧金属盐佐剂在液体溶剂如水中的悬浮液分离为固相和液相的过程而产生的相，所述分离过程是例如离心、提取或简单沉淀。如本文所使用的，表述"吸附，，意指任何非共价附着、偶联、粘附或键合，包括经由静电力的吸附。发明详述本发明涉及测量变应原酶的酶活性，且从而获得疫苗制剂中的免疫活性的指示和/或变应原酶的量的定量的体外方法。在一个方面，本发明因而提供了测量以一种或多种变应原酶和含氧金属盐佐剂的混合物形式的疫苗制剂的免疫活性的方法，其中混合物包含液相和固相，且其中至少一部分变应原酶吸附到固相上，所述方法包括下迷步骤在酶活性测定法中测量混合物的酶活性，和使用获得的测量结果作为疫苗制剂的免疫活性的指示。在本发明的一个方面，术语"至少一部分"指至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%或至少90%的变应原酶吸附到固相上。在本发明的一个方面，免疫活性是疫苗制剂引起由变应原特异性免疫球蛋白介导的免疫应答的能力，所述免疫球蛋白包括任何种类、亚类或其组合，包括IgA、IgAl、IgA2、IgD、IgE、IgG、IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgM，特别是IgG和/或IgE。尽管氢氧化铝是疫苗中最常用的佐剂，但当吸附到其表面时对变应原产生何种影响从未得到充分表征。对向氢氧化铝的吸附如何影响一般而言酶活性与酶的结构直接相关。如果结构被改变，例如通过暴露于热或酸条件，那么活性可能受影响。一群同质蛋白质可以由下述简化两态平衡描述其中^是天然形式的蛋白质，"是变性形式，A和A分别是来自解折叠和重折叠动力学的速率常数。在天然和变性形式之间，可以存在许多中间过渡态。根据这个简单模型，变性的定义可以描述为蛋白质的三维结构中的任何暂时或永久改变。因此，当改变周围环境的生理化学性质时，取决于改变多久，可以发生代表蛋白质可用的位形空间的自由能景观(landscape)的改变。向固相的任何表面的静电吸引可以导致蛋白质的吸附。蛋白质向表面的吸附可以诱导蛋白质中的构象变化，从而改变蛋白质的总体能量最低。在酶的情况下，这可以导致其酶活性的改变。因此酶活性的变化可以是由吸附到固相上引起的结构改变的敏感衡量指标。由于氢氧化铝的佐剂效应，蛋白质-氢氧化铝系统已得到充分研究。文献显示酸性pl蛋白质与氢氧化铝结合，但结合对酶活性的影响就本发明人所知从未进行研究。本发明基于可以进行对包含一种或多种变应原酶和含氧金属盐佐剂的疫苗制剂中的酶活性的测量这一发现。本发明进一步基于疫苗制剂的酶活性的所述测量可以用作疫苗制剂的免疫活性的指示这一认识，因为酶活性的变化可以与疫苗制剂中存在的酶分子的构象的变化相关联，所述酶分子的构象的变化又与疫苗制剂的免疫活性相关联。执行这种测量的能力使得能够评估变应原向含氧金属盐佐剂的吸附的影响，通过测量向固相栽体吸附前后的酶活性且从而获得吸附后免疫活性的测量，因为如上所述，预期酶活性的变化将对免疫活性有影响。根据本发明的方法还可以用于定量疫苗制剂中的一种或多种变应原酶的量。本发明的一个进一步的方面因此提供了用于定量以一种或多种变应原酶和含氧金属盐佐剂的混合物形式的疫苗制剂中的变应原酶的量的方法，其中混合物包含液相和固相，且其中至少一部分变应原酶吸附到固相上，所述方法包括下述步骤在酶活性测定法中测量混合物的酶活性，和使用获得的测量结果用于定量变应原酶的量。在本发明的一个方面，变应原酶的定量通过将测量的酶活性与充分表征的标准相比较来进行。在本发明的一个进一步的方面，酶变应原的定量通过活性位点滴定来进行。活性位点滴定需要使用不可逆地或至少以非常高的亲和力与酶结合的那种特定酶活性的抑制剂。疫苗制剂实施本发明的方法的疫苗制剂可以是以包含一种或多种变应原酶和含氧金属盐佐剂的混合物形式的即用型制剂，其中混合物包含液相和至少一部分变应原酶吸附到其上的固相，或用于制备即用型制剂的任何此类疫苗制剂。疫苗制剂可以进一步包含无酶活性的一种或多种变应原。即用型制剂可以用于肠胃外施用或用于粘膜施用。肠胃外施用包括静脉内、肌内、关节内、皮下、皮内、皮肤表面/经皮和腹膜内施用。用于经由注射施用的疫苗可以这样配制，以便适合于通过针注射或用于无针注射。粘膜施用包括口、鼻、阴道、舌下、眼、直肠、尿道(urinal)、乳房内(intramammal)、肺、耳鼻喉(otolar)(即经由耳)或口含施用。疫苗可以是喷雾剂、气雾剂、混合物、混悬剂、分散系、乳剂、凝胶、糊剂、糖浆剂、乳骨、软青、埋植剂(耳、眼、皮肤、鼻、直肠和阴道)、乳房内制剂、阴道栓剂、栓剂或子宫栓剂的形式。变应原酶在本文背景中，术语"变应原酶"是在其反复暴露于个体后诱导变应性即IgE介导的反应，且具有酶活性即能够催化或加速化学反应的任何蛋白质。如同所有催化剂，酶通过降低反应的活化能，从而允许反应更快得多地进行来起作用。酶可以数千倍地加速反应。如同任何催化剂，酶保持未被完成的反应改变，且因此可以继续起作用。因为如同所有催化剂，酶不影响产物和反应物之间的相对能量，所以它们不影响反应的平衡。然而，与大多数其他催化剂比较，酶的优点是其立体、区域和化学选择性和特异性。天然存在的变应原的例子包括花粉变应原(树、草药、杂草和草花粉变应原)，昆虫变应原(吸入、唾液和毒液变应原，例如螨变应原、蟑螂和蠓变应原、膜翅目昆虫毒液变应原)，动物毛发和皮屑变应原(来自例如狗、猫、马、大鼠、小鼠等)，和食物变应原。来自树、草和草药的重要花粉变应原是源于下述分类学目的这些变应原山毛榉目、木犀目、松目和悬铃木科，包括尤其是桦树(桦木属)、桤木(赤杨属)、榛(榛属)、角树(鹅耳枥属)和橄榄(木犀榄属)、雪松(柳杉属和刺柏属)、悬铃树(悬铃木属)，禾本目包括尤其是黑麦草属、梯牧草属、早熟禾属、狗牙根属、鸭茅属、绒毛草属、鵾草属、黑麦属和高粱属的草，菊目和荨麻目包括尤其是豚草属、蒿属和墙草属的草药。其他重要的吸入变应原是来自表皮螨属和欧尘螨的房尘螨(HDM),储螨如害嗜鳞螨、食甜螨和食酪螨的那些变应原，来自蟑螂、蠓和蚤如小蠊属、大蠊属、摇蚊属和辨头蚤属的那些变应原，以及来自哺乳动物如猫、狗和马的那些变应原，毒液变应原包括源于螫刺或叮咬昆虫的这些变应原，如来自下述分类学目的那些变应原膜翅目包括蜂(总科蜜蜂科)、黄蜂(总科胡蜂科)和蚁(总科蚁科)。来自真菌的重要吸入变应原尤其是源于链格孢属和枝孢霉属的这些变应原。在本发明的一个方面，一种或多种变应原酶选自树花粉变应原、草花粉变应原、草药花粉变应原、螨变应原、毒液变应原、动物毛发和皮屑变应原以及食物变应原。在本发明的一个进一步的方面，一种或多种变应原酶是一种或多种房尘螨变应原。变应原酶的非穷尽列表显示于表l中。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>complextableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>变应原的主要来源之一是HDM。在2000年，在除南极洲外的所有洲已鉴定总共13种不同的HDM物种。HDM属于节肢动物门(Jr^ropo^2)，与例如蜘蛛和蝎一样。3个物种构成90%的HDM动物群，即屋尘螨、粉尘螨和宇尘螨(丑t/rc^/j^Aus迈ay"e/)。对于屋尘螨，介导变应性应答的变应原在排泄物中发现且来自屋尘螨的千燥的身体残余物。鉴定了来自屋尘螨的14组不同的变应原(表2)。尽管并非全都得到完全表征，但大多数的大小和功能已确定，并且免疫测定法已测定体外IgE反应性。如从表2看来，几种HDM变应原是变应原酶，如Derp1、Derp3、Derp6和Derp9。表2.屋尘螨变应原组-分子量和功能。<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>主要变应原的正式定义是在临床敏感组中超过50%的患者中与人IgE血清结合的任何抗原。HDM变应原Derp1和Derp2都是主要变应原并且视为HDM变应原中最强力的。许多体外实验指出Derp1的蛋白水解活性可以在针对HDM的变态反应发生中起重要作用。认为Derp1通过切割封闭破坏上皮细胞之间的紧密连接，且通过降解oc-抗胰蛋白酶增加支气管粘膜的通透性。这可以促进对于上皮下的抗原呈递细胞的接近增加，所述增加的接近可以导致增加的变应性应答。此外，Derp1切割B和T细胞表面上的CD23(调节IgE生产的低亲和力IgE受体)和CD25(IL-2受体)。这指导T细胞应答朝向Th2应答以及最终增加的IgE水平和更严重的变应性应答。称为蛋白酶或同义的肽酶的蛋白水解酶介导蛋白质的破坏。这通过其中切割有限数目的肽键的限制性蛋白水解，或通过其中蛋白质降解成其氨基酸组成成分的无限制性蛋白水解来完成。蛋白水解酶如大多数所有其他酶一样，通过酶学委员会(EC)编号系统使用指示功能和底物特异性的编号进行分类。根据EC编号系统，蛋白水解酶分成2个亚-亚类，即肽链外切酶和肽链内切酶。后者也称为蛋白酶。肽链外切酶例如氨基和羧基肽酶从蛋白质的N或C末端切下单个氨基酸，而肽链内切酶切割蛋白质内的键。对于肽链内切酶，切割的因此，一种肽链内切酶可能具有对于切割邻近大疏水性残基的肽键的优先选择，而其他优选长的带电残基或甚至2个或更多化学上或结构上相关的残基。蛋白酶活性位点周围的实际结构指定特异性或优先选择。底物的切割位点周围的残基表示为-P「P广P广P/-P2，-P3，-，P广P/段是切割位点。类似地，对准底物的蛋白酶的残基表示为-s厂s广s广s-S2，-S3，-。4类不同的肽链内切酶已得到描述。这些是丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酰蛋白酶和金属蛋白酶。在每种情况下，蛋白酶产生攻击蛋白质底物的肽羰基的亲核体。半胱氨酸蛋白酶是对经由半胱氨酸残基的肽键有活性的水解酶，属于EC编号系统中的亚-亚类3.4.22。40种半胱氨酸蛋白酶目前在该系统中得到分类，涵盖酶如胱天蛋白酶-l、分离酶(separase)、某些组织蛋白酶和木瓜蛋白酶(Carp1)。许多其他半胱氨酸蛋白酶已得到鉴定和表征，但尚未在EC编号系统中得到分类除了EC编号系统外，蛋白酶基于系统发生关系也分成小集团和家族。即，它们的分子结构和序列同源性。目前^i^V^数据库包含关于1816种不同蛋白酶的详细信息。在这个系统中，蛋白酶通过指示催化类型的字母(S、C、T、A、G、M或U，分别用于丝氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、金属或未知蛋白酶)随后为任意数目加以注解。半胱氨酸蛋白酶分成5个小集团。通过这个系统，Carp1属于小集团CA,家族C1，且给予名称C.01.001,与EC编号系统中的3.4.22.2形成对比。负责半胱氨酸蛋白酶活性的催化残基是非常保守的半胱氨酸(Cys)、组氨酸(His)和天冬酰胺(Asn)构成所谓的催化三联体。这3个残基产生来自Cys的亲核硫醇盐阴离子。硫醇盐-咪唑鎿离子对由His和Cys产生，这攻击底物的肽羰基。Asn帮助His的咪唑鎗离子定向在有利于催化机制的各种步骤的位置中。催化以顺次方式发生。首先酶通过硫醇盐阴离子被蛋白质底物暂时酰化。其次，切割蛋白质底物的一部分，随后为脱酰作用和水的添加。最后，半胱氨酸蛋白酶的活性位点残基重构成其最初形式。除了催化残基外，许多其他残基也起重要作用。谷氨酰胺(Gln)构成称为氧阴离子洞的一部分。这种结构在催化过程中帮助稳定底物的中间过渡态。许多疏水性残基维持Asn周围的非极性环境，使其与外部溶剂隔离。这些是2个色氨酸(Trp)、2个缬氨酸(Val)和1个苯丙氨酸(Phe)，都为保守残基。由半胱氨酸蛋白酶进行的催化强烈依赖还原环境，因为反应性半胱氨酸易于氧化。由于这个原因，对半胱氨酸蛋白酶的酶测定法可以用还原剂例如二硫苏糖醇(DTT)、游离半胱氨酸、或p-巯基乙醇来进行。来自植物番木瓜的半胱氨酸蛋白酶Carpl是研究最多和充分了解的半胱氨酸蛋白酶。Carp1是C1半胱氨酸蛋白酶家族的成员，其通常作为无活性的原形式分泌和生产。Carp1由具有3个二疏桥的212个氨基酸的单条多肽链组成。多肽链进行折叠以形成由在其间划定裂缝界限的2个相互作用的结构域构成的球状蛋白质。活性位点残基Cys25和Hisl59位于这个裂缝中相对的结构域上。含有Cys25的结构域主要为oc螺旋结构基序，而含有Hisl59的结构域主要为P折叠结构基序。第3个催化残基Asnl75在序列和三级结构中与Hisl59极为接近。除与底物的羰基配位的Cys25外，Asnl75和Glnl9通过氢键键合帮助保持底物在位进行催化，且构成所述氧阴离子洞的核。Carp1蛋白水解活性的最适pH是6.G-7.0。Derp1(源于其排泄物的主要HDM变应原)也是Cl半胱氨酸蛋白酶家族的成员。尽管在EC编号系统中未给予位置，但它在#^0/^肽酶数据库中已分类，编号C.01.073。Derpl在HDM的胃肠道中作为酶原排泄，且通过蛋白水解去除前肽被活化，形成由222个氨基酸组成的具有3个二硫桥的成熟酶。开放读码框除编码80个氨基酸的前肽外还编码18个氨基酸的信号肽。Derp1在结构上非常类似于Carp1，并且它们显示出80%的结构同源性，尽管序列同源性为26%。DerPl蛋白水解活性的最适pH为7.0-8.0。在本发明的一个方面，变应原酶是选自Derp1、Derp3、Derp6和Derp9中的一种或多种。在本发明的另一个方面，变应原酶中的至少一种是半胱氨酸蛋白酶如Derp1。在本发明的另外一个方面，变应原酶中的至少一种是丝氨酸蛋白酶，如选自Derp3、Derp6或Derp9中的一种或多种。在本发明的另外一个方面，疫苗制剂包含源于相同变应原来源或源于不同变应原来源的至少两种不同种的变应原，例如来自不同螨的螨组1和组3变应原。掺入疫苗制剂内的变应原酶可以是提取物、纯化变应原、经修饰的变应原、重组变应原或重组变应原的突变体的形式。变应原提取物除了变应原外还可包含许多其他离子和分子。变应原提取物可以天然地包含相同变应原的一个或多个同种型，而重组变应原一般仅表示变应原的一个同种型。疫苗制剂可以进一步包含无酶活性的一种或多种变应原和/或无变应原活性的一种或多种酶。在本发明的一个方面，所述一种或多种变应原酶是提取物的形式。在本发明的另一个方面，测量提取物的主要变应原的酶活性。在本发明的另外一个进一步的方面，可以测量整个提取物中的一种或多种变应原酶的酶活性。在本发明的另一个方面，变应原是重组变应原。在本发明的一个进一步的方面，变应原是天然存在的低IgE结合突变体或重组低IgE结合突变体。在本发明的一个进一步的方面，低IgE结合变应原是根据W099/47680、W002/40676或W003/096869的变应原。酶抑制剂酶活性可能受其他分子如抑制剂的影响，所述抑制剂是减少或取消酶活性的分子。大量天然和合成的蛋白酶抑制剂已得到描述。抑制剂通过不同机制灭活酶，例如对催化残基的直接共价修饰或屏蔽底物进入的活性位点。第一类机制通常由小分子代表，所述小分子具有针对催化残基的反应基团，从而不可逆地阻断活性。此类抑制剂的例子是特异性半胱氨酸蛋白酶抑制剂E-64,所述E-64通过反应性环氧化物基团与催化性的半胱氨酸共价结合。后一类抑制剂通常为大分子结构，其通过多重非共价相互作用与酶结合。此类抑制剂的例子是对丝氨酸蛋白酶特异的大豆胰蛋白酶抑制剂(SBTI)。SBTI是190个氨基酸的天然存在的蛋白质，其通过与酶表面的氢键键合、静电和疏水性相互作用而覆盖活性部位裂隙从而覆盖催化残基。在本发明的一个方面，疫苗制剂包含几种变应原酶。为了仅测量变应原酶之一的活性，可能必须使用相关抑制剂，取决于希望抑制的酶活性的类型。在本发明的一个进一步的方面，使用抑制剂以抑制疫苗制剂中的一种或多种变应原酶。对关注的变应原酶的特异性抑制剂的使用对于获得酶活性的更佳表征和鉴定，以及对于制剂中存在的活性酶的量的定量(通过例如活性位点滴定)是有用的。在本发明的一个方面，使用的半胱氨酸蛋白酶抑制剂选自E64(L-反式-环氧琥珀酰-L-亮氨酰氨基(4-胍基)丁烷)和其他环氧化物。在本发明的一个进一步的方面，抑制剂是E64。底物为了能够在酶活性测定法中测量吸附到固相上的变应原酶的酶活性，应鉴定底物和(例如需要时)对于所关注的变应原酶的特异性抑制剂。在本发明的一个方面，酶活性测定法中的底物对所关注的酶特异，这意味着相同变应原来源中没有其他的酶能够使这种底物转变成产物。例如，底物Z-Leu-Leu-Glu-MCA对半胱氨酸蛋白酶如Derpl特异，并且它不被已知存在于那种变应原来源(HDM提取物)中的其他蛋白酶切割，所述其他蛋白酶例如丝氨酸蛋白酶Derp3、Derp6或Derp9。在本发明的一个方面，对变应原酶特异的底物用于测量该变应原酶的酶活性。在本发明的一个进一步的方面，使用的底物是Z-LeuLeuGlu-MCA。含氧金属盐佐剂佐剂是在疫苗接种后通过增强免疫应答起作用的化合物。依照本发明使用的含氧金属盐可以是当配制到递送系统内时提供所需效应的任何含氧金属盐。此类含氧物质的例子是氢氧化铝、磷酸铝、疏酸铝、硫酸铝钾、磷酸钓、Maalox(氢氧化铝和氬氧化镁的混合物)、氢氧化铍、氢氧化锌、碳酸锌、氯化锌和硫酸钡。合适的含氧金属盐的例子是其中阳离子选自Al、K、Ca、Mg、Zn、Ba、Na、Li、B、Be、Fe、Si、Co、Cu、Ni、Ag、Au和Cr的那些。含氧化合物的阴离子可以是有机或无机阴离子，或有机和无机阴离子的组合。合适的含氧金属盐的例子是例如其中阴离子选自硫酸盐、氢氧化物、磷酸盐、硝酸盐、碘酸盐、溴酸盐、碳酸盐、氩氧化物、乙酸盐、柠檬酸盐、草酸盐和酒石酸盐及其混合形式的那些。含氧金属盐进一步包含配位络合物。配位络合物的定义在例如TheHandbookofChemistryandPhysics56版，B节，第7章(1975-76)中给出。在本文背景中，表述"混合形式"意欲包括各种阴离子的组合以及与例如氯化物和石危化物的组合。尽管递送系统包含含氧金属盐，但预期氧可以由另一种VIA族原子如S、Se或Te替代。含氧金属盐可以通过多种物理化学参数进行表征，如吸附、溶解性和溶出性质、测量为等电点pl(对于可解离的化合物当物质的净电荷为零时测量为pH)的离子电荷、解离常数、络合物配位、电子构型、化合价、成键轨道和反键轨道、储存库性质、粘附性质、表面特征、粒子特征和佐剂性。认为生物活性物质吸附(或偶联)到含氧金属盐上，并且这种吸附促进疫苗的功效。几种因素可能是重要的或影响活性物质和含氧金属盐之间的吸附(参见例如，P.M.Callahan等人，PharmaceuticalResearch第8巻，No.7,851-858(1991)，andVaccineDesign.TheSubimitandAdjuvantApproach)。这些因素包括pH，进行吸附反应的时间长短、混合条件、疫苗中的各种组分的浓度、容器、温度、贮藏、緩冲液和赋形剂。已进一步发现活性物质的吸附可以受金属盐的净/总电荷和活性物质的电荷的影响，这两者都是pH依赖性的。认为重要的进一步的特征是含氧金属盐的溶解性。含氧金属盐可以进一步具有储存库效应。储存库效应意指活性物质将从疫苗中逐渐释放。活性物质因此将与一种或多种含氧金属盐一起保留且从其中逐渐释放。认为这具有许多有利效应，例如延长的刺激、有利的药物释放、和保护生物相互作用物质不受环境条件影响。进一步认为含氧金属盐可以具有某些截留性质，从而保留待递送的活性物质。含氧金属盐的另一个特征是通过在微环境中维持对于活性物质理想的pH来保护活性物质，从而防止酸降解，或通过保护活性物质不受酶降解，从而允许物质被递送。此外，某些含氧金属盐具有緩沖能力。这可以导致疫苗制剂内的体内微环境，这防止活性物质遭受降解环境。这例如在其中分别存在酸和酶降解危险的胃或肠中可以是优点。某些含氧金属盐如氢氧化铝具有悬浮于溶剂(一般为水)中的凝胶的形式。当搅动时，凝胶即固相将在悬浮液的整个体积内均匀分布，从而封入存在的所有水即液相。当静置时或当实施分离过程如离心时，一部分的水将与凝胶分离。分离的水量将依赖使用的分离过程以及使用的含氧金属盐的类型和浓度。在本发明的一个方面，含氧金属盐选自氢氧化铝、磷酸铝和磷酸钙。在本发明的一个方面，含氧金属盐是氢氧化铝。氢氧化铝的分子式是Al(OH)"然而，这低估了该化合物的真实复杂性。其分子结构组成是八面体。铝在双锥的对称面的中心，氢氧离子在连接交叉点处，而水分子在所有其他中。单个八面体组合产生八面体的大分子结构。随着更多的八面体组合，铝与氧的比逐渐接近l:3，因为更多来自水的氢被替代。氬氧化铝的物理外观是凝胶悬浮液，随着铝的含量增加而流动性减少。由于其高密度，当贮藏时凝胶聚集且因此而沉淀，在其上留下水相。氢氧化铝聚集物的一般粒子大小在2-3pM的范围中。氢氧化铝具有9.1的零电荷点(PZC)。PZC等同于蛋白质中的pl，所述pl是当分子的总净电荷为零时的pH值。Carpl的pl是8.75，而对于Derp1是4.6-6.6(依赖不同的Derp1同种型)。此外，已显示氢氧化铝佐剂周围的微环境具有与总体溶液不同的pH。这是由于形成围绕佐剂颗粒周围的双层的阴离子包括羟基的吸引。蛋白质向氢氧化铝吸附的基础主要由其电荷差异介导。在恒定PH下PZC与pl的实质差异是必需的，以便建立吸附所需的静电相互作用。这得到能斯脱势或由下式给出的氢氧化铝的表面电位支持^面冶在=J"夕迈F.-具有低于PZC的pl的蛋白质将能够与氢氧化铝结合。PZC和pH之间的差异越大，氢氧化铝佐剂的电位就越高，并且氢氧化铝和蛋白质之间的静电相互作用越强，条件是蛋白质的pl低于氲氧化铝的PZC。其他相互作用包括疏水性、范德华和氢键键合，但如果分子之间不存在显著电荷差异，那么它们自身不足以驱动吸附。因此，理论上，Carp1应不向氩氧化铝吸附，或至少低程度地向氢氧化铝吸附，而由于与氢氧化铝相比电荷的大差异，Derpl应当吸附。酶活性测定法酶活性测定法的目的是获得酶催化反应的进展曲线。初速度评估为产物形成的初始速率或底物浓度的初始减少。取决于酶反应，这可以以不同方式来获得，最普遍的是吸光度、荧光或pH变化。酶的进展曲线是作为时间函数的产物浓度。在本文背景中，术语"酶活性测定法，，涉及任何合适的测定法，取决于待测量的变应原酶。通过选择的方法，应当能够跟踪和定量底物的消耗和/或产物的产生，通过相容且不被固相载体的存在改变的方法，例如通过光谱法如吸光度、荧光、FTIR(傅里叶变换红外光镨法)，通过免疫法如ELISA等。在决定测定法前，对于本领域技术人员的标准实践是验证固相的存在不以影响测量结果的方式干扰酶的催化作用，干扰测定条件(例如，通过结合底物和/或产物，改变pH条件等)，或干扰测量方法本身，如例如本文实施例中例示的。在本发明的一个方面，测定法是其中随着时间测量产物形成的荧光测定法。底物可以由与焚光基团连接的合成肽制成，所述荧光基团由肽猝灭，并且当与肽附着时具有相对低的荧光强度，例如半胱氨酸蛋白酶底物Boc-Gln-Ala-Arg-MCA、Z-Leu-Uu-Glu-MCA或Z-Phe-Arg-MCA,其中MAC是荧光基团。当酶切割荧光基团和肽序列之间的键时，荧光急剧增加。肽可以设计为满足酶的特异性需求。在本发明的一个方面，当变应原酶是半胱氨酸蛋白酶时，为了使蛋白酶是酶促活性的，活性半胱氨酸残基必需处于其还原形式。在本发明的这个方面，变应原酶与还原剂一起温育以激活变应原酶。还原剂以足够浓度存在以便使活性位点半胱氨酸残基完全还原，但并非如此过量的浓度而使酶的二硫桥还原，这是重要的。在本发明的一个方面，测量疫苗制剂的液相和固相的混合物的酶活性。在本发明的一个进一步的方面，对疫苗制剂实施分离过程以分开液相和固相，以便使得能够分别测量固相和液相的酶活性。分离可以通过任何合适的方法来进行。在本发明的一个方面，分离过程通过离心、提取或简单沉淀来进行。取决于使用的具体酶测定法和固相样品的性质，可能必需使用例如緩沖溶液，以^t在测量一种或多种变应原酶的酶活性前获得合适的样品。在本发明的一个方面，仅对疫苗制剂实施液相和固相的混合物中的变应原酶的酶活性的测量(测量l)。在本发明的一个进一步的方面，仅对疫苗制剂实施在液相与固相分离后液相中的变应原酶的酶活性的测量(测量2)。在本发明的一个进一步的方面，仅对疫苗制剂实施在液相与固相分离后固相中的变应原酶的酶活性的测量(测量3)。在本发明的另外一个进一步的方面，对疫苗制剂实施液相和固相的混合物的酶活性的测量(测量1),和液相中的变应原酶的酶活性的测量(测量2)。在本发明的另外一个进一步的方面，对疫苗制剂实施液相中的变应原酶的酶活性的测量(测量2)，和固相中的变应原酶的酶活性的测量(测量3)。变应原酶在液相和固相之间的分布是一个参数，这对于每种变应原酶是特征性的，且因此它可以用于表征疫苗制剂的状态和免疫活性。因此，涉及疫苗制剂的不同相的各种组合和/或完整疫苗制剂的酶活性信息。p、在本发明的另一个方面，测量用于制备佐剂化疫苗制剂的变应原酶溶液的酶活性，并将对于所述溶液的测量结果与对于佐剂化疫苗制剂获得的测量结果比较，以便评估佐剂化疫苗制剂的制备对免疫活性的影响。在本发明的另外一个方面，在制备后即刻以及一个或多个贮存期后对疫苗制剂实施酶活性测量，并且疫苗制剂的免疫活性的指示基于前后测量结果的比较。在本发明的另一个进一步的方面，疫苗制剂的免疫活性的指示基于对于佐剂化疫苗制剂获得的测量结果和相同类型的佐剂化疫苗制剂或另一种类型的疫苗制剂的先前相应测量结果的比较。材料与方法^凝應炎浙宽^肩^将冻干的变应原溶解于含水緩冲液中且稀释至所需浓度。在搅拌的同时向变应原溶液中添加"铝胶(Alhydrogel)"(1.3%)，并且随后添加无菌水。使所得到的溶液静置至第二天，且随后在搅拌的同时緩慢添加緩沖液，以产生最终的变应原氬氧化铝凝胶。乂箭i瘦^豕目的这种方法通过测量在包含针对研究中的蛋白质的抗体的琼脂糖凝胶中电泳后蛋白质-抗体复合物的扩散，用于定量给定蛋白质。理论这种方法基于在电泳期间蛋白质-抗体复合物在琼脂糖凝胶中的迁移率。抗体在聚合作用期间掺入琼脂糖凝胶内，并且随后将样品蛋白质施加于孔中。蛋白质根据其电泳迁移率移动，在凝胶中遇到抗体且形成复合物。随着抗原遇到越来越多的抗体，这些复合物的大小增加，从而限制通过凝胶孔的迁移直至不发生进一步的迁移。复合物通过使凝胶染色来显现。由复合物界定的面积与施加于孔的蛋白质的量成比例。定量相对于以稀释系列施用于相同凝胶上的内部标准制剂来进行。设备加热的恒温器控制的水浴56-60匸电泳仪(2个緩沖液容器，2个电极，冷却表面和室)电源供应，Imm漏Power320，KeboUbA/S热鼓风机，TeamInternationalHL2材料与试剂玻璃板7x10cm纸芯(paperwick):滤纸，标准尺寸21x10cm，Watman用于电极室和琼脂糖凝胶的緩冲液0.1M5，5-二乙基巴比妥酸，Veronal,0.40MTris，Sigma,2mM乳酸4丐，Pu，包含抗体的琼脂糖凝胶1%U/v)琼脂糖，HAS型，Litex抗体Rb-a-Derpl，ALK-Abe116A/S染色液6mM考马斯亮蓝R—250，Pierce，10%乙酸，Bie&Berntsen在43.2%乙醇中脱色液10%乙酸，Bie&Berntsen在43.2%乙醇中实验操作将玻璃板置于水平面上且用乙醇净化。将llmL琼脂糖吸取到在56。C水浴中的试管内，加入15iaL抗体，并且通过倒转使溶液轻轻混合。将琼脂糖小心倒在玻璃板上，避免形成气泡。凝胶化后，距离板的下沿1.5cm打出一系列孔。将板置于电泳仪的冷却表面上。建立5层滤纸的连接桥，并且将跨越凝胶的电压调整至2V/cm。将10pL样品施用于孔中。将另一块玻璃板置于连接桥滤纸上，以避免在凝胶上的水冷凝，并且电泳持续过夜。电泳进行后，将玻璃板置于滤纸上，并且使孔充满蒸馏水。随后用湿滤纸覆盖凝胶并且压在几层干滤纸、厚玻璃板和3-4kg负荷下。10分钟后，重复该操作。随后将板置于含有0.1MNaCl的容器中15-30分钟，随后如上所述加压。这之后使板在热气流中干燥并且使板在考马斯染色液中染色5分钟。将板浸入蒸馏水中数秒以便去除过量染色液。最后使板在连续的浴中脱色2分钟直至达到所需脱色。板用热空气干燥并且凝胶的数字化通过Gel-ProAnalyzer3.1软件来完成o;77趟化目的目的是来自屋尘螨提取物的Derpl的纯化理论Derp1的纯化涉及几个步骤。2类亲和层析步骤的应用导致纯化的Derp1。第一种层析法在SBTI琼脂糖柱上进行。这个步骤的目的是去除提取物中存在的污染性丝氨酸蛋白酶，产生更稳定的提取物。纯化中的第二个步骤在4C1B8琼脂糖柱上进行。4C1B8是对Derp1特异的小鼠单克隆抗体(来自MartinChapman)。Derp1通过应用pH梯度来洗脱。纯化的流程图显示于图1中。进行在SBTI柱上的附加纯化，以便完全去除在先前步骤中与Derp1—起共纯化的痕量Derp3丝氨酸蛋白酶。收集包含Derp1的部分并通过超滤进行浓缩。设备AKTAexplorerFPLC系统，AmershamBiosciencesSorvalRC3BPlus离心机，DuPont材料与试剂亲和纯化柱SBTI-琼脂糖Derpl柱(SBTI琼脂糖)，柱体积(CV)lmLCNBr-琼脂糖4C1B8mAbDerp1柱(4C1B8琼脂糖)，CV5mL来自屋尘螨的房尘螨提取物用于层析纯化的緩冲液All:磷酸盐緩沖盐K(PBS)，Bie&BerntsenA2:PBS，0.5MNaCl，MerckBl:0.1M甘氨酸pH11，Sigma,0.5MNaCl，Merck蛋白质浓缩Ami对照Ultra-1515mL离心过滤器装置，Millipore。緩冲液更换PDIO脱盐柱,AmershamBiosciences实验操作样品制备将120mgDerp提取物溶解于10mL緩冲液All中。样品用0.22iam低蛋白质结合过滤器进行过滤。为了减少Derp1的可能蛋白水解，所有操作于5-C进行。使用的所有緩冲剂同样冷却至5°C。SBTI琼脂糖柱亲和层析SBTI琼脂糖柱用緩沖液All进行平衡，并且将5mL制备的样品注入到柱上。取出各部分的50pL样品用于进一步研究且分别冷冻。将包含Derp1的流出物的部分合并用于进一步的纯化。4C1B8琼脂糖柱亲和层析柱用緩冲液All进行平衡，并且将5mL样品(SBTI-琼脂糖纯化的合并物)注入到柱上。用緩冲液A2洗脱非特异性结合的材料。其后，用至緩冲液B1的梯度洗脱Derp1。将800mM磷酸盐緩冲液(pH7)吸取到预定用于收集Derp1的收集管(200jiL/mL部分)中，以便中和碱性洗脱物。取出各部分的50jiL样品且分别冷冻用于进一步研究。将流出峰的部分合并且冷冻。将包含Derp1的部分合并，并且在早先描述的相同条件下在SBTI琼脂糖上实施第二次层析。纯化后过程使用Ami对照Altra-1515mL离心过滤器通过超滤将来自第二次SBTI柱纯化的约140mL合并物浓缩。过滤器用PBS緩沖液进行洗涤，并且将合并的Derp1在3，500rpm下离心15分钟，使体积减少至5mL。使緩冲液变成50mMTrispH7，使用设计为分离高(MW>5000)与低分子量(MW<1000)物质的装填SephadexG-25的PD-10脱盐柱。目的这种方法用于评估总蛋白浓度。理论芳香氨基酸色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸吸收紫外光。然而，只有色氨酸和酪氨酸在280nm处吸收，且色氨酸吸收5倍于酪氨酸的光。这是由于色氨酸的吲哚环中的7T—7T'跃迁，而苯丙氨酸和酪氨酸包含苯基。蛋白质的吸光度与蛋白质中的色氨酸和酪氨酸量、光程长度和蛋白质浓度线性相关。这种关联称为朗伯-比尔(Lambert-Beer，s)定律且由下式给出j=f./.C其中A是吸光度，e是蛋白质的摩尔吸光系数(由蛋白质中的色氨酸和酪氨酸量决定)，1是光程长度，而c是蛋白质浓度。因此根据吸光度测量，如果已知摩尔吸光系数，那么可以估计蛋白质浓度。设备.Lambda800UV/VIS光镨4义，PerkinElmer100-QS,石英比色杯，径长lcm，Hellma吸材料与试剂50mMBis-TrispH6.5,Sigma50mMTrispH7.0，Sigma50mM磷酸盐緩沖液pH7.0，Merck2%Helmanex溶液，Hellma实验操作在使用前30分钟将分光光度计打开用于预热期。分光光度计的波长设定为280nm，并使仪器对包含真正样品的基质的空白样品进行调零。石英比色杯首先用2%Helmanex溶液进行洗涤，且随后用MQ水洗涤4次，这之后用高压空气进行干燥。风干后，用透镜清洁纸擦^C比色杯的外侧。在每次样品测量之间进行这个操作。在清洁比色杯后，将200pL样品转移至比色杯且测量吸光度。錄活^的^定f炎^辦定法J设备MolecularDevicesSpectraMAXGeminiXSCorning96-孔非结合黑色聚苯乙烯板HeraeusSepatech离心机混合器，Janke&Kurikel材料与试剂纯化的Derp1纯^1的木瓜蛋白酶(Carp1)，SigmalOmMBoc-QAR-AMC,Bachem10mMZ-FR-AMC,Bachem在酵中的0.70mME-64，Merck1MDTT，SigmalOOmMEDTA,Bie&Berntsen50mMTris緩沖液pH7.0，Sigma50mMBis-Tris緩冲液pH6.5，Sigma50mM磷酸盐緩沖液，Merck6.686mg/mL氩氧化铝，BrenntagBiosector实验操作在实验阶段开始时制备1MDTT和lOOmMEDTA的母液，冷冻于-20。C，且在整个方案期间自始至终使用。每天由母液制备包含还原剂DTT和EDTA的新緩冲液。关于测定条件的描述，参见表4。DTT由空气中的氧持续氧化且因此每天必须制备新緩冲液。为了从高流通量测量中获益，使用96孔微量滴定板，并且每个孔具有200ML测定体积。微量滴定板是不透明的，以避免孔之间的发射荧光的交叉污染。在新近制备的包含DTT和EDTA的緩冲液将底物稀释至终浓度，且转移至微量滴定板。酶在相同緩沖液进行稀释，且对于其活化，在木瓜蛋白酶的情况下温育10分钟，而在Derpl的情况下温育20分钟。混合、转移和温育在室温下进行。温育后，将酶溶液转移至微量滴定板，且开始测量。测量进行10分钟，对于每个孔总共36次测量，且每次测量之间自动混合。表4.酶测定法条件。<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>对于每一实验，测定体积并非等分。因此关于酶、底物、緩冲液和抑制剂的具体体积在各实验之间不同，取决于实验目的(表5)。表5.酶测定法体积。变量_^_动力学_活性位点滴定酶50(liL50jaL50)jL底物100juLIOOjhLIOOmL抑制剂--50uL緩冲液50mL50juL-总体积200juL200mL200|liL测量酶活性后，使用软件SoftMaxPROLifeSciencesEdition,MolecularDevices,2001估计进展曲线的最大斜率。评估实^^的初速度后，将它们转移至Prism且进行分析。/^"潜合疳定法对于溶液中的变应原和对于吸附且其后从氢氧化铝凝胶佐剂上洗脱的变应原的IgE抑制测定法。清的IgE的能力。在这个背景中，这种测定法用于评估变应原与氢氧化铝的结合对其结合IgE的能力且因此对其变应原活性的影响。方法IgE抑制实验在ADVIAcentaur仪器上进行。抑制剂(在溶液中的抗原或抗原凝胶佐剂疫苗)的系列稀释物(用TECAN(P-05-07F294)进行)与固定量的生物素化的抗原混合，且与固相吸附的IgE—起进一步温育。与固相结合的生物素化的变应原的量评估为在与用吖啶鑰酯标记的链霉抗生物素一起温育后发出的光。原始数据在Excel中进行处理，且转移至GraphPadPrismv.4.0用于最终分^斤(曲线拟合、绘图和统计学比较)。使数据拟合4参数对数函数<formula>formulaseeoriginaldocumentpage33</formula>并且如果各拟合的HillSlope(HS)没有显著不同，拟合曲线视为平行，。实验操作由于氢氧化铝的性质，无法在氢氧化铝的存在下评估IgE结合。因此在Derp1洗脱后评估Derp1向氢氧化铝吸附对Derp1的影响。^f吏165ng/inLDerp1的500yL才羊品与1006.868fflg/mL氢氧化铝一起于4。C温育1小时。吸附后，使溶液在"，000rpm下离心5分钟。将沉淀重悬浮于300|iL50mM磷酸盐緩沖液中且温育2小时，以便从氢氧化铝上洗脱吸附的Derp1。不含氢氧化铝的300jjL165jLig/mLDerp1对照以相同方式进行处理。制备Derp提取物样品用于与合并的血清IgE—起温育。实施例1底物和酶的优化1.1底物焚光尽管AMC的荧光在与肽结合时被猝灭，但一些荧光仍可以被测量。底物荧光对测定法的影响通过在不同浓度下进行底物的荧光测量来评估。使用0jaM-200juM的底物浓度并测量终末点荧光(图2a)。描述底物浓度和熒光之间的关联的线性回归具有下述斜率",=39.07±1.02-(上式中的Substrate指底物)这指出每次切割1UM底物，荧光就减少39.07RFU。因为linM底物产生ljdMAMC，所以来自产生的AMC的荧光的增加是4106RFU，意味着当底物水解产生AMC时，荧光的净增加是U德竺—，竺眉竺//MaM//M在图2b中呈现的标准曲线后，将所有荧光测量结果转化成产生的AMC的浓度。1.2酶和底物的浓度进行用于酶活性测定法的最佳酶和底物浓度的初步研究。所有实验以测定浓度用lmMDTT和5mMEDTA来进行。根据文献，木瓜蛋白酶应以nM范围存在而底物以jaM范围存在，取决于底物(Schulz等人；ASensitiveFluorescentAssayforMeasuringtheCysteineProteaseActivityofDerp1,aMajorAllergenFromtheHouseDustMite"er迈ato/7力ago/des/^eron/ss/^ws,/0wr;3a/C7//7/'cs7户"/o7o^r;yJ/o/eci/7ar尸"/o7o^r，第51巻，第222-224页，1998，；John等人；FunctionalEffectsoftheInhibitionoftheCysteineProteaseActivityoftheMajorHouseDustMiteAllergenDerp1byaNovelPeptide-basedInhibitor,C/2./7/c"ai2"J7er!'迈e/3"/J//e/^7，第30巻，笫784-793页，2000;Szabelski等人；InfluenceofMe2S0andIncubationTimeonPapainActivityStudiedUsingFluorogenicSubstrates,爿"aA/oc力該/ca尸0/0/3/cs，第48:4巻,第995-1002页，2001)。为了优化确切条件，使用J,J实验设计(图"。对于lnM酶浓度，以RFU/s测量的信号约等于关于该测定法的L0Q(L0Q-2.44RFU/s)。这使得使用lnM酶的测量非常不可靠。对于2.5nM木瓜蛋白酶溶液，测量结果为至少2.3倍L0Q，而对于10nM木瓜蛋白酶溶液是10.6倍。这些结果支持活性测量结果和木瓜蛋白酶浓度之间的线性关联(参见图3(b))。10nM木瓜蛋白酶浓度与200juM底物(这产生最高活性)的进展曲线显示RFU不超过15000单位直至4分钟。这对于RFU是合理的范围，因为初速度在最初2分钟内测量，并且RFU和AMC浓度之间的关联仍是线性的。与此同时，底物浓度和测量的酶活性之间的关联不是线性的，指出在这种实验中使用的底物浓度大于"根据这些结果，选择低于2t)0iuM的底物浓度和10nM的木瓜蛋白酶浓度，因为测量的活性比LOQ大至少一个数量级。实施例2关于氢氧化铝吸附的预实验2.1在氢氧化铝的存在下的蛋白质定量为了确定是否能够在包含氢氧化铝的样品中通过吸收光谱法测定蛋白质浓度，进行在氢氧化铝的存在和不存在下木瓜蛋白酶的吸收测包含氢氧化铝的样品的吸光度显示高水平的光散射，鉴于溶液的浊度，这是预期到的(图4)。因为样品的稀释导致低于定量限的蛋白质浓度，所以这种方法对于在给定条件下的蛋白质估计无效。因此对在包含氢氧化铝的样品中的蛋白质浓度间接地进行测定，通过从对照制剂(在不存在氢氧化铝的情况下)中的蛋白质量扣除不与氢氧化铝结合(在液相中)的蛋白质量。2.2氢氧化铝的沉淀为了研究氢氧化铝是否在酶测定法的时间跨度期间沉淀，沉淀测量为随着时间的A4。。。重力沉淀曲线图显示在40分钟时开始沉淀(图5)。因为酶测定法在IO分钟内完成，所以沉淀在该测定法中不发生。实施例3测定法组分为了证明测定法组分是否吸附到氢氧化铝从而影响酶测定法的结果，进行下述结合实验(表6)。测量AMCZ-FR-AMCBOC-QAR-AMCE-64*终末点XXX活性XXX表6.用于评估氳氧化铝对测定法组分的影响的方法概括。*E-64不显示200rnn和9Q0nm之间任何显著的光吸收。描述与氢氧化铝的可能相互作用的所有酶测定法用终浓度5nM的木瓜蛋白酶来进行。EDTA以lmM添加，而DTT以5mM终浓度添加。氢氧化铝浓度为1.14mg/mL。因为1.14mg/mL氢氧化铝的吸收测量显示高水平的光散射，所以终末点测量仅对不含氢氧化铝的样品进行。对于涉及氢氧化铝对测定法组分的影响的所有实验，向氢氧化铝的吸附进行15分钟、3Q分钟和6Q分钟。3.1AMC评估测定法产物AMC是否随着时间吸附到氢氧化铝。在不含氢氧化铝的对照中以及在上清液样品或液相(图6)中对于时间进行AMC的一式三份的A"。测量。上清液得自其中2jaMAMC在1.14mg/mL氢氧化铝中混合在一起，且随后固相部分通过在13，OOOrpm下离心5分钟与液相分开的吸附实验。结果的双因素ANOVA显示这2种因素即吸光度和时间(分别为p值-O.40和p值-O.066)对结果没有显著影响。因素之间的相互作用项(p值-O.70)显示无显著影响。因此AMC在给定条件下不显著吸附到氢氧化铝持续长达1小时的时间段。为了确定氢氧化铝的存在是否猝灭AMC的荧光，进行其中随着时间测量含或不含氬氧化铝的1pMAMC的荧光的实验。这指出在测定时间期间不发生猝灭(图7)。这种AMC浓度等同于由木瓜蛋白酶和Derp1产生的酶测定法AMC浓度。3.2底物检查使用的底物Z-FR-AMC和Boc-QAR-AMC是否吸附到氢氧化铝。为了这个目的，使底物与1，14mg/mL氢氧化铝混合。液相(上清液)通过离心与固相分离。以下述2种方式将上清液中的底物浓度与随着时间不含氢氧化铝的制剂(对照)中的底物浓度比较a)比较2种制剂中在325nm处的吸收(对于2种底物，最大吸收都在325nm处发生(图8))。测定一式三份地进行，使用40jaM的底物浓度(图9a和10a)。b)测量当与不存在氢氧化铝的对照、在氢氧化铝的存在下的底物(混合物)和在混合物的上清液中混合时木瓜蛋白酶的酶活性。测定一式三份地进行，使用30jiM的底物浓度(图9b和10b)。Z-FR-AMC的吸光度结果的双因素AN0VA指出吸光度因素(p值=0.88)没有显著影响(图9a)。另一方面时间因素(p值〈0.0001)对结果有显著影响。然而，对条形图的检查显示在60分钟的时间点时较大的变化。当仅对于15分钟和30分钟数据点进行分析时，时间因素实际上变得无显著意义(p值-O.95)。这是合理的分析且证实测定方案的有效性。对于活性测定法，氩氧化铝因素的统计分析作为单因素ANOVA来进行(图9b)。关于排除时间因素的原因是对于每个时间点使用独立的酶制剂，从而使时间和酶浓度混杂。单因素ANOVA显示在所有活性结果的平均值之间不存在显著差异(p-O.11)。这进一步支持指出Z-FR-AMC不吸附到氢氧化铝的吸光度测量结果。对Boc-QAR-AMC吸光度结果的双因素ANOVA指出吸光度因素(p值=0.72)、时间因素(p值=0.24)或相互作用因素对结果都没有任何显著影响(图10a)。对于活性测定法，通过仅涉及活性反应的单因素ANOVA以与对于Z-FR-AMC相同的方式进行统计研究(图10b)。单因素ANOVA显示在所有活性结果的平均值之间不存在显著差异(p=0.98)。这支持指示Boc-QAR-AMC不吸附到氢氧化铝的吸光度测量结果。3.3E—64为了确定半胱氨酸蛋白酶抑制剂E-64是否吸附到氢氧化铝，对不含氢氧化铝的12.5nME-64对照、E-64和氩氧化铝的混合物、和通过离心与固相分离后混合物的上清液进行酶测定法。这种E-64浓度不完全抑制酶活性。因此可以通过酶活性评估E-64与氢氧化铝的结合。执行单因素ANOVA，指出平均值之间无显著差异(p值-O.79)，因此不发生吸附(图11)。由于分开制备酶，时间点与酶浓度混杂。3.4氢氧化铝对酶测定法组分的影响的概括总结关于氢氧化铝对酶测定法组分的影响的实验，在终末点测量或酶活性测量中发现氬氧化铝不影响任何测定法组分AMC、Z-FR-AMC、Boc-(JAR-AMC和E-64。实施例44.1木瓜蛋白酶向氢氧化铝的吸附在氢氧化铝的存在或不存在下验证酶测定法后，进行实验设计以研究木瓜蛋白酶的动力学参数和氢氧化铝对其的可能影响。因为木瓜蛋白酶预期仅以较少的程度吸附到氢氧化铝(pl在氢氧化铝的PZC左右)，所以选择它作为阴性对照。当大部分酶分子不与佐剂结合时，它将反映在测定介质中氢氧化铝的存在对动力学结果的可能影响。样品制备的概括在图12中给出。制备含有100pg/mL木瓜蛋白酶和1.14mg/mL氢氧化铝的3mL溶液。将这种溶液于4X:放置1小时，以允许木瓜蛋白酶吸附到氢氧化铝。吸附后，取出500laL用于进一步分析，并且使混合物的其余部分在4000rpm下离心10分钟。其余样品根据图12中的流程图进行分析。此外，制备在不存在氢氧化铝的情况下在Bis-Tris緩冲液中包含木瓜蛋白酶的对照(对照)。对照如同氢氧化铝混合物于4n温育1小时，且随后进行分析。样品通过下述方法进行分析蛋白质(酶)浓度的测定(Aw和活性位点滴定)酶活性测量4.2木瓜蛋白酶浓度的测定不同样品的蛋白质浓度以2种方式进行评估4.2.1A2S。通过朗伯-比尔定律使用对于木瓜蛋白酶2.46mg/mL的摩尔吸光系数，将这些测结果转化成蛋白质浓度。因为在技术上在氢氧化铝的存在下无法由A则确定蛋白质浓度，所以在混合物1和混合物2中的木瓜蛋白酶浓度间接地进行估计。混合物1中的蛋白质浓度与对照中的相同，并且混合物2中的蛋白质浓度是对照和上清1之间的差异。对结果的AN0VA显示在对照和上清1之间无差异(p值-O.615)，指出木瓜蛋白酶不显著吸附到氢氧化铝。对照中木瓜蛋白酶的估计浓度和吸附到氢氧化铝的量显示于表7中。蛋白质测量不能说明所有100jug/mL，后者是对照中的估计浓度。蛋白质的损失可能是由于母液中的最初木瓜蛋白酶浓度的错误估计。这个浓度由制造商进行测量且因此不在与其余样品相同的仪器上。<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>表7.动力学参数Vmax、Km和ircW(Vmax/蛋白浓度)以及木瓜蛋白酶的蛋白质浓度的测定。*通过A280测定的蛋白质浓度。6通过活性位点滴定测定的蛋白质浓度。*获得的蛋白质浓度是间接测定的(参见正文)。对照表示在不存在氢氧化铝的情况下的木瓜蛋白酶制剂。吸附的指吸附到氢氧化铝的木瓜蛋白酶制剂(混合物2)。4.2.2活性位点滴定活性位点滴定用于评估不同样品中的活性酶的量。这与由A训估计的蛋白质浓度形成对比，后者表示样品的总蛋白质含量。使用的测定条件在下表8中标明。这些结果显示约7%(混合物3)的活性木瓜蛋白酶吸附到氢氧化铝，而91%(上清1+上清2)在溶液中。这与在样品中的酶活性的评估中获得的结果一致，参见4.3.l节。394.3酶活性进行2类酶测定法(i)使用固定底物浓度的活性测量以评估酶活性和(ii)米-曼二氏动力学以估计动力学参数V^和KM。所有活性测定法用Bis-Tris緩冲液，pH6.5，5raMDTT，lmMEDTA和Z-FR-AMC作为底物来进行。进行的不同酶测定法的概括在表8中给出。<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>表8.用于木瓜蛋白酶吸附实验的酶测定法的说明。活性测量是酶和底物的单个组合以便评估样品中的活性水平。使用不同底物浓度的酶活性的米-曼二氏动力学测量用于估计Vmax和KM。所有测量是一式三份的。*与DTT和E-64两者一起温育。4.3.1酶活性的评估活性测量用于定量分析吸附到氢氧化铝的木瓜蛋白酶的量，和在溶液中自由分布的量。混合物1中96%的活性在溶液中发现(上清1+上清2)，而8%的木瓜蛋白酶活性吸附到氢氧化铝(混合物3)。对照的活性比混合物1的活性低17%。这可能是由于在实验的时间跨度期间对照中蛋白质活性的损失。这种损失被氢氧化铝的存在所阻止。为了进一步评估这种观察结果，进行其中在不存在氢氧化铝的情况下随着时间追踪木瓜蛋白酶活性的新实验。使木瓜蛋白酶与50mMBis-Tris緩冲液混合至在500uL总体积中10jag/mL的终浓度。使混合物于4'C进行温育且在0、30和60分钟时取出样品。将样品稀释且在包含DTT的緩沖液中温育IO分钟，并且随后在底物添加后测量活性。用单因素ANOVA分析的结果显示在3个时间点之间存在显著差异(p值=0.015)，并且经由纽-科二氏(Newman-Keuls)比较检验发现60分钟不同于其他2个时间点，且低7%。这些结果暗示在木瓜蛋白酶和氢氧化铝之间的60分钟温育期间，在对照样品中的木瓜蛋白酶已损失其7%的活性。另外的损失发生，直至酶测定法起始。4.3.2米-曼二氏动力学参数米-曼二氏参数Km和Vmax在不同样品中进行评估。由不同样品估计的^,值显示于上表7中。巴特莱氏(Bartlett，s)检验指出在^的样本方差之间无显著差异(p值=0.758)，而单因素ANOVA用于比较平均值。单因素ANOVA检验显示在^估计值之间无显著差异(p值-O.999),指出当木瓜蛋白酶在氢氧化铝的存在和不存在下时，对于底物的亲和力没有改变。在溶液(上清1+上清2)中的^,是在混^^物1中的97%,而在混合物3中的^,对应于7%。^,对于限定酶是特异的，并且线性依赖测定法中的酶浓度。通过酶浓度的标准化产生参数h,，后者仅依赖酶活性的特征。上表7显示关于不同样品的U古计值，由得自活性位点滴定和A加的酶浓度值计算。对照中得自蛋白质浓度的Aw测定的A"值大约是用活性位点滴定获得的浓度的一半，指出样品中一半的蛋白质是无活性的。当酶浓度通过活性位点滴定进行计算时，对照、混合物1、上清1、混合物2和混合物3的t,值是可比较的，暗示氢氧化铝的存在不影响木瓜蛋白酶的动力学性质。当酶浓度由A，计算时，对照、混合物l、上清1和上清2的i^值也是可比较的。然而，混合物2中的蛋白质浓度的间接测定使得t(值更不精确。在氢氧化铝的存在和不存在下评估的动力学参数没有显著不同的事实指出氢氧化铝的存在不影响酶促反应。总之，这些结果显示当大部分酶(93%)不与佐剂结合时，在氢氧化铝的存在下可以测量酶的酶性质。实施例55.1Derp1向氩氧化铝的吸附根据蛋白质向氢氧化铝吸附的理论，预期Derpl吸附(pl低于氢氧化铝的PZC)。检查这种吸附对Derp1活性和结构的影响样品制备的概括在图13中给出。制备含有100ug/mLDerp1和1.14mg/mL氩氧化铝的3mL溶液。将这种溶液于4匸放置1小时，以允许Derp1向氬氧化铝吸附。吸附后，取出500pL用于进一步分析，并且使混合物的其余部分在4000rpm下离心IO分钟。洗脱步骤于4'C进行1小时，其中将混合物2的沉淀重悬浮于磷酸盐緩沖液中。此外，制备在不存在氢氧化铝的情况下在Tris緩冲液中包含Derp1的2种对照(对照1和对照2)。对照1在实验开始时进行分析，而对照2在2小时实验结束时进行分析。样品用下述方法进行分析蛋白质浓度的测定(A，^和RIE)酶活性测量IgE结合5.2Derp1浓度的测定不同样品中的Derp1浓度的测定通过Aw和RIE进行评估。5.2，1A280为了定量蛋白质含量，对不含氢氧化铝的样品(对照l、对照2、上清和洗脱液)测量在280mn处的吸光度。如表8a中所示，通过朗伯-比尔定律使用对于Derp11.72mg/mL的摩尔吸光系数，将吸光度测量结果转化成蛋白质浓度。<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>表8a.动力学参数Vmax、Km和(Vmax/蛋白浓度)以及Derp1的蛋白质浓度的测定。3通过A280测定的蛋白质浓度。c通过RiE测定的蛋白质浓度。*获得的蛋白质浓度是间接测定的(参见正文)。对照表示在不存在氩氧化铝的情况下的Derpl制剂。吸附的指吸附到氢氧化铝的Derpl制剂(混合物2)。混合物1和混合物2中的蛋白质浓度间接地进行估计。混合物1中的蛋白质浓度视为与对照1中的相同，而混合物2中的蛋白质浓度是对照1和上清之间的差异。t检验显示在对照1和对照2中的蛋白质浓度之间无显著差异(p值-O.092)。对照1中32%的蛋白质含量发现在上清中，指出约70%的吸附程度。对于吸附的蛋白质，使用磷酸盐緩冲液从氢氧化铝上洗脱出56%。5.2.2RIE应用于定量蛋白质含量的另一种方法是RIE。样品对照1、对照2、上清和洗脱液与3个Derp1标准(125ng、250ng和500ng)—起进行评估。对照中Derpl的估计Derp1浓度，吸附到氢氧化铝的量以及洗脱的量显示于表8a中。估计的值由所述3个标准的线性回归标准曲线(浓度作为沉淀物面积的函数)产生。对照1中44%的蛋白质含量在上清中发现，间接指出约56%的吸附程度。从吸附的蛋白质中，使用磷酸盐緩沖液从氢氧化铝上洗脱出98%。对照1和对照2的浓度在标准曲线的预测区域外，并且因此Derpl浓度可能是被低估的。这可以解释Derpl从氢氧化铝的高洗脱程度，因为吸附的Derp1浓度是作为对照1和上清之间的差异估计的。5.3酶活性进行不同类型的酶测定法(i)使用固定底物浓度的活性测量以评估酶活性，和(ii)米-曼二氏动力学以评估动力学参数V^和KM。所有活性测定法用Tris緩冲液，pH7.0,5raMDTT，lmMEDTA和Boc-QAR-AMC作为底物来进行。进行的不同酶测定法的概括在表9中给出。<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>表9.用于Derp1吸附实验的酶测定法的说明。活性测量是酶和底物的单个组合以便评估样品中的活性水平。使用不同底物浓度的酶活性的米-曼二氏动力学测量用于评估Vmax和KM。所有测量是一式三份的。*与DTT和E-64两者一起温育。5.3.1酶活性的评估在氢氧化铝的不存在和存在下Derpl的活性测量用于定量吸附到氢氧化铝的Derp1的量，和在溶液中自由分布的量。活性测量的结果概括于图14中。上清中非吸附的Derp1的活性相当于混合物1中"％的活性。66%的Derp1活性吸附到氢氧化铝，这种活性的67%在用磷酸盐緩冲液从混合物2中洗脱后解吸。为了监测Derpl在实验期间的稳定性，在实验开始时测量对照1的活性，而在结束时测量对照2的活性。对对照1、对照2和混合物1进行的单因素ANOVA显示在平均值之间无显著差异(p值-O.76)。这指出时间或氢氧化铝的存在都不影响这些条件下的Derp1活性。5.3.2米-曼二氏动力学参数米-曼二氏参数&和^,在不同样品中进行评估。图15显示在氢氧化铝的存在下Derp1的典型米-曼二氏曲线。^和r，值显示于表8a中。巴特莱氏检验指出在/w的方差之间无显著差异(p值-O.11)，而单因素ANOVA显示在样品的平均值之间无显著差异(p值=0.62)。这指出在氢氧化铝的存在下时，Derp1对于Boc-QAR-AMC的亲和力没有改变。对照2的L比对照1中的低14%(t检验，p值-O.0024)，指出Derpl在实验时间段期间已损失活性。纽-科二氏多重比较检验显示在对照1和混合物1的之间无显著差异(p>0.05)，暗示氢氧化铝对Derpl活性无影响。此外，看起来氢氧化铝阻止了从对照1到对照2观察的时间中的活性损失。上清和混合物2中的^分别是混合物1中的L,的30%和62%。混合物2中68%的活性在洗脱液中发现。如表8a中所示，Derp1的i^值由获得的「，值和得自不同方法(A柳和RIE)的蛋白质浓度进行估计，当蛋白质浓度通过Aw和RIE估计时，来自不同样品的t,值是可比较的。总之，对于Derp1获得的^和L,值在不存在氢氧化铝的情况下和当大部分Derp1分子(60-70%)吸附到氢氧化铝时无显著不同。这些数据支持可以测量吸附到氢氧化铝的酶的酶活性，使得评估酶向氢氧化铝的吸附对酶的活性/结构的影响成为可能。5.4IgE结合评估氢氧化铝对在不存在氢氧化铝的情况下的Derp1(对照1)以及结合的和从氢氧化铝洗脱的Derp1(洗脱液)结合来自HDM过敏患者的血清的IgE的能力的影响。所评估的对照1和洗脱液中，使用浓度渐增的Derp1，对来自生物素标记的标准Derp1的信号的抑制遵照S形下行曲线(图16)。比较对照l与洗脱液的曲线，显而易见的是基底水平是相同的，因此在任一情况下完全抑制是可能的。这指出对照1中的所有IgE表位在洗脱液中仍存在。比较对照l和洗脱液的Hill斜率的单样本t检验显示平均值无显著不同(p-0.83)，这指出IgE对于Derpl上的表位的亲和力在与氢氧化铝结合后被保存。权利要求1.测量以一种或多种变应原酶和含氧金属盐佐剂的混合物形式的疫苗制剂的免疫活性的方法，其中所述混合物包含液相和固相，且其中至少一部分所述变应原酶吸附到固相上，所述方法包括下述步骤在酶活性测定法中测量所述混合物的酶活性，和使用获得的测量结果作为所述疫苗制剂的免疫活性的指示。2.用于定量以一种或多种变应原酶和含氧金属盐佐剂的混合物形式的疫苗制剂中的变应原酶的量的方法，其中所述混合物包含液相和固相，且其中至少一部分所述变应原酶吸附到固相上，所述方法包括下述步骤在酶活性测定法中测量所述混合物的酶活性，和使用获得的测量结果用于定量变应原酶的量。3.根据权利要求l-2中任一项的方法，其中对变应原酶特异的底物用于测量变应原酶的酶活性。4.根据权利要求3的方法，其中抑制剂用于抑制所述疫苗制剂中的变应原酶中的一种或多种。5.根据权利要求1-2中任一项的方法，其中所述一种或多种变应原酶选自树花粉变应原、草花粉变应原、草药花粉变应原、螨变应原、毒液变应原、动物毛发和皮屑变应原以及食物变应原。6.根据权利要求l-2和5中任一项的方法，其中所述一种或多种变应原酶是提取物的形式。7.根据权利要求6的方法，其中测量所述提取物的主要变应原的酶活性。8.根据权利要求l-7中任一项的方法，其中所述变应原酶是房尘螨变应原。9.根据权利要求1-8中任一项的方法，其中所述变应原酶中的至少一种是半胱氨酸蛋白酶。10.根据权利要求1-8中任一项的方法，其中所述变应原酶中的至少一种是丝氨酸蛋白酶。11.根据权利要求1-10中任一项的方法，其中所述一种或多种变应原酶是选自Derp1、Derp3、Derp6和Derp9中的一种或多种。12.根据权利要求ll的方法，其中所述变应原酶是Derp1。13.根据权利要求1-9和11-12中任一项的方法，其中使用的所述底物是Z-UuUuGlu-MCA。14.根据权利要求1-9和10-13中任一项的方法，其中使用的所述抑制剂选自E64(L-反式-环氧琥珀酰-L-亮氨酰氨基(4-胍基)丁烷)和其他环氧化物。15.根据权利要求14的方法，其中使用的所述抑制剂是E64。16.根据权利要求11中任一项的方法，其中所述一种或多种变应原酶是选自Derp3、Derp6和Derp9中的一种或多种。17.根据权利要求1-16中任一项的方法，其中所述疫苗制剂包含无酶活性的一种或多种另外的变应原。18.根据权利要求1-2中任一项的方法，其中所述含氧金属盐选自氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝、硫酸铝钾、磷酸钙、Maalox(氢氧化铝和氢氧化镁的混合物)、氢氧化铍、氢氧化锌、碳酸锌、氯化锌和硫酸钡。19.根据权利要求18的方法，其中所述含氧金属盐是氢氧化铝。20.根据权利要求1-2中任一项的方法，其中所述酶活性测定法是吸光度测定法、荧光测定法、FTIR或免疫法。21.根据权利要求20的方法，其中所述酶活性测定法是ELISA。22.根据权利要求20的方法，其中所述酶活性测定法是荧光测定法。23.根据权利要求1-22中任一项的方法，其中仅对所述疫苗制剂实施液相和固相的混合物中的变应原酶的酶活性的测量O测量l)。24.根据权利要求1-22中任一项的方法，其中仅对所迷疫苗制剂实施在液相与固相分离后液相中的变应原酶的酶活性的测量(测量2)。25.根据权利要求1-22中任一项的方法，其中仅对所述疫苗制剂实施在液相与固相分离后固相中的变应原酶的酶活性的测量(测量3)。26.根据权利要求1-22中任一项的方法，其中对所述疫苗制剂实施液相和固相的混合物的酶活性的测量(测量1),和液相中的变应原酶的酶活性的测量(测量2)。27.根据权利要求1-22中任一项的方法，其中对所述疫苗制剂实施液相中的变应原酶的酶活性的测量(测量2)，和固相中的变应原酶的酶活性的测量(测量3)。28.根据权利要求1-27中任一项的方法，其中测量用于制备所述佐剂化疫苗制剂的变应原酶溶液的酶活性，并将对于所述溶液的测量结果与对于所述佐剂化疫苗制剂获得的测量结果相比较，以评估所述佐剂化疫苗制剂的制备对免疫活性的影响。29.根据权利要求1-27中任一项的方法，其中在制备后即刻以及一个或多个贮存期后对所述疫苗制剂实施所述酶活性测量，并且所述疫苗制剂的免疫活性的指示基于前后测量结果的比较。30.根据权利要求1-27中任一项的方法，其中所述疫苗制剂的免疫活性的指示基于对于所述佐剂化疫苗制剂获得的测量结果和相同类型的佐剂化疫苗制剂或另一种类型的疫苗制剂的先前相应测量结果的比较。31.根据权利要求24-27中任一项的方法，其中所述分离过程通过离心、提取或简单沉淀来进行。32.根据权利要求32的方法，其中所述分离过程通过离心来进行。33.根据权利要求1-12中任一项的方法，其中所述免疫活性是引起IgG介导的免疫应答的能力。34.根据权利要求l-12中任一项的方法，其中所述免疫活性是引起IgE介导的免疫应答的能力。全文摘要本发明涉及测量以一种或多种变应原酶和含氧金属盐佐剂的混合物形式的疫苗制剂的免疫活性的方法，其中混合物包含液相和固相，且其中至少一部分变应原酶吸附到固相上，所述方法包括下述步骤在酶活性测定法中测量混合物的酶活性，和使用获得的测量结果作为疫苗制剂的免疫活性的指示，或使用获得的测量结果用于定量变应原酶的量。文档编号C12Q1/00GK101351561SQ200680050165公开日2009年1月21日申请日期2006年11月23日优先权日2005年11月24日发明者H-H·伊普森,M·J·马尔特森,M·M·F·戈麦斯,R·L·克罗格申请人:阿尔克-阿贝洛有限公司