专利名称：具有酯酶活性的多肽和重组的酯酶及其用途的制作方法
具有酯酶活性的多肽和重组的酯酶及其用途
本发明涉及具有酯酶活性、特别是具有2-烷基-5-卤代戊-4-烯羧酸酯 酶活性的新颖多肽，并涉及具有酯酶活性的酶活性重组蛋白质，及其用于 拆分2-垸基-5-卤代戊-4-烯羧酸酯对映异构体混合物外消旋化合物的用 途。
富含对映异构体的2-烷基-5-卤代戊-4-烯羧酸及其酯是用于制备药物 (例如用于S-氨基-，羟基-co-芳基链垸羧酰胺)的有价值的中间产物，其 具有肾素抑制特性，并可在药物制备中用作抗高血压剂。 酯酶通常被用于拆分外消旋化合物和不对称化。 然而，可商业获得的适用于制备手性化合物的酯酶非常少。 己知来自猪肝的酯酶提取物仅是制备规模上的。猪肝酯酶(PLE)在很 久以前是从天然来源中分离的，其活性也已知很长时间了(Simonds, J.P. (1919) Amer. J. Physiol. 48， 141; Bamann, E. et al. (1934) Hoppe-Seyler Z. 229, 15; Falconer J.S.肌d Taylor, D.B. (1946) Biochem. J. 40, 831-834)。
为了表征PLE也已经进行了多种研究(Heymann, E. and Junge, W. (1979) Eur. J. Biochem. 95， 509-518; Lehner， R. and Verger, T. (1997) Biochemistry 36,1861-1868)。此外，已可显示(例如在WO 01/09079中)，来自猪肝的 酯酶提取物可选择性地水解甲基5-氯代-2-(l-甲基乙基)-4-戊烯酸盐的(R)对 映异构体。
然而，来自天然来源如猪肝的这类酯酶提取物的用途伴有缺点。 首先，不同批次的品质不同，从而使得难以优化工业过程。其次，在
药物制品制造中使用动物来源是人们不期望的，因为病毒和朊蛋白(prion)
的存在不能总被清除。
因为这些原因，需要在微生物中生产具有标准化的品质的重组猪肝酯
对可能的酯酶基因的克隆见例如FEBS Lett. (1991), 293, 37-41所述。
活性猪肝酯酶的第一次功能性表达首次被描述于WO 02/48322中。
WO 2004/055177描述了通过对来自WO 02/48322的seq. ID No. 1的重 组猪肝酯酶(rPLE)进行定点诱变来制备其它重组酯酶。如从WO 2004/055177的描述中和从相同发明人写作的文章Protein Engineering, 16, 1139-1145, 2003的描述中显而易见的，选择对来自WO 02/48322的rPLE 序列的修饰，从而获得在David et al., (1998) Eur. J. Biochem. 257， 142-148 中公开的重组肠内猪酯酶(PICE)。
对外消旋2-烷基-5-卤代戊-4-烯羧酸酯的拆分在这些文章的任一中均 未描述。
然而，因为对酯酶(其具有针对2-烷基-5-卤代戊-4-烯羧酸酯的期望 的立体选择性活性并可以通过生物技术容易地制备)的需要没有满足，所 以提供相应的新颖重组酯酶是本发明的一个目的。
在分离和克隆EBS Lett. (1991), 293， 37-41和WO 02/48322所述的针对 已知的猪肝酯酶(PLE)的基因(作为从来自猪肝的mRNA开始获得的 cDNA)的尝试中，除了已知的PLE序列以外，还发现了第二个新颖的酯 酶序列。表达这两个序列后(其中制备了相应的蛋白质或酯酶，即已知的 rPLE和新颖的、重组的"备选"酯酶(rAPLE))，意外地发现仅rAPLE能 够选择性拆分外消旋的2-烷基-5-卣代戊-4-烯羧酸酯。
因此可通过具有酯酶活性的新颖多肽和新颖的重组酯酶(rAPLE)来达 成本发明的目的，所述重组酯酶的氨基酸序列与已知PLE序列在总共548 个氨基酸中有21个不同。新颖的rAPLE与已知的猪肠道羧酸酯酶(PICE) 的氨基酸序列也在总共548个氨基酸中有12个不同。然而，PICE被发现 于猪肠道中。
本发明因此涉及具有酯酶活性的多肽，其包含氨基酸序列SEQ. ID. No. 1。
本发明还涉及具有酯酶活性的新颖的重组蛋白质，其包含氨基酸序列 SEQ. ID. No. 1。
本发明的多肽和重组rAPLE具有立体选择性地拆分外消旋的式(I)
<formula>formula see original document page 6</formula>(1)
的2-烷基-5-卤代戊-4-烯羧酸酯的活性，其中R是d-C6的垸基，&是 CrC4的烷基且X是氯、溴或碘。
如上文所述，具有酯酶活性的本发明的多肽和新颖的重组酯酶rAPLE 与FEBS Lett. (1991), 293, 37-41中公开的已知序列的总计548个氨基酸中 有21个不同，并与来自David et al., (1998) Eur. J. Biochem. 257, 142-148中 公开的已知PICE蛋白的总计548个氨基酸中有12个不同。
本发明的新颖rAPLE蛋白质的序列在以下的氨基酸位置上与PLE蛋 白质的已知序列不同
APLE位置PLE
Glu73Asp
He75Val
Gly76Val
Gly77Glu
Leu80Thr
Arg87Gly
lie92Thr
Pro93Leu
Val129Leu
Ser133Pro
Thr134Met
Leu138Val
Ala139Val
Phe234Leu
Ala236Val
Gly 237 Ala
Phe 286 Leu
Ala 287 Thr
Leu 290 Phe
Pro 294 Gin
Thr 302 Pro
另外，本发明的蛋白质和新颖的重组rAPLE可以是SEQ ID No 1所示 经修饰的序列的形式，所述经修饰的序列可得自例如常见修饰，例如序列 N或C端的一个或多个氨基酸(例如来自a因子信号序列的 GluAlaGluAla)的交换、删除或附加，或通过与其它蛋白质融合来进行修 饰。
本发明还进一步包括在本发明的酶的蛋白质序列中具有修饰的突变蛋 白质，所述本发明的酶具有合适的活性，尤其是对2-垸基-5-卤代戊-4-烯 羧酸酯的活性。突变蛋白质可通过例如通过已知的诱变技术(随机诱变、 定点诱变、定向进化、基因改组等)修饰DNA (其编码本发明的酶)获 得，使得所述DNA编码与本发明的酶差异至少一个氨基酸的酶，并随后 在合适的宿主细胞中表达经修饰的DNA。因此，本发明还包括如SEQ ID， No 1所示的经修饰的DNA序列，其通过上述突变、删除、延伸、融合获 得，并编码具有想要的酯酶活性的酶。
酯酶活性，尤其是2-烷基-5-卤代戊-4-烯羧酸酯酶活性在本文中被定 义为拆分式(I)的2-垸基-5-卤代戊-4-烯羧酸酯的外消旋化合物的能力。
本发明的多肽和重组rAPLE可以如下制备
首先，使用合适的试剂盒从猪肝分离mRNA，然后基于mRNA提取 物通过反转录产生cDNA。
接着，以GenBank编号No. X63323 (Matsushima et al.， 1991)的已知猪 肝酯酶基因的序列为基础，制备特异性PCR引物，然后进行扩增及克隆。
这些特异性引物是
引物1: 5'-CA04^7TCATGGCTATCGGGCAGCCAGCCTCGC-3， 引物2: 5'-CCGG^47TCAGCCTCCCCTTCACAGCTCAG-3， 引物中包含编码PLE蛋白质的合适的核苷酸序列并且专属地存在于引 物中的部分以粗体表示。
引物的其它序列部分包含例如下列信息限制性内切核酸酶(斜体)
的切割位点或对表达来说重要的序列元件。在本发明的rAPLE制备中该部 分可变化。
然后可通过现有技术的PCR方法用引物1和2进行扩增。
随后使用PCR产物，通过现有技术方法，来制备表达构建体，所述表 达构建体用于在合适的宿主生物中异源表达所编码的rAPLE蛋白质。优选 地，PCR产物最初必须被克隆进合适的质粒载体中。
然后将以该方式获得的重组质粒转化进合适的宿主例如五sc/^n'c/^ co/z'中。然后对若干得到的克隆的插入物进行测序。
出乎意料的是，其中鉴定了两组具有不同序列的重组克隆， 一组与根 据Matsushima et al.， (1991) FEBS Lett. 293， 37-41的PLE预期序列100%相 同，还有如SEQ. ID. No. 2所示的新颖的核苷酸序列(APLE序列)表达后得 到本发明的氨基酸序列SEQ. ID. No. 1 。
本发明还涉及编码本发明的多肽和重组酯酶rAPLE的核酸或核苷酸序列。
例如，这类核酸具有SEQ. ID. No. 2中所示的核苷酸序列。 本发明还涉及下述核苷酸序列，所述核苷酸序列包含编码本发明多肽
和重组酯酶rAPLE的核苷酸序列，或包含SEQ. ID. No. 2所示的核苷酸序列。
另一种可能性是通过标准化的合成技术(例如使用自动化DNA合成 仪)，来制备对应于本发明核酸序列(其编码本发明的酯酶)的合适的寡 核苷酸。
对编码本发明酯酶的核酸序列进行纯合成制备尤其有利于在生产药物 或其中间代谢物时使用，因为由此所述酶不从动物来源获得。 然后对发现的两种序列(PLE和APLE序列)进行表达。 已知的猪肝酯酶(PLE， Swiss-Prot ID Q29550)包含N端信号序列和C端 ER驻留信号(retension signal)——最后4个氨基酸HAEL。
为了表达已知的PLE和新颖的APLE，构建了下述载体，其中序列被 引入合适的表达系统中。然后将这些表达构建体转化进入合适的宿主细胞 中。
本文上下文中的合适宿主细胞是例如微生物、动物细胞系和植物。 原核和真核微生物均可使用。优选的原核宿主(细菌)为Esc/^n'c/n'a co/z' 禾口 来 自5acz'〃w( 例如 5.孤Z rifo 、及/z'cAemybr附z's 、 jB.a/w7/0/1々wq/hcf-e似)、尸set^/omowos (例如P./7womscera、 _P._pwri￡/fl) 或 5V厂e/ tomycw (例如51./z'W&似、S.tewfi ae)属的菌株。真核微生物是优选 的，真菌是尤其优选的。其例子为 5bcc旨蘭戸s ce溶&ae、 尸z'cAz.a
表达可以是分泌的或细胞内的，以及诱导型的和组成型的。 对于细菌表达而言，可以获得对物种特异信号的选择，a.o.作为可商 业获得的用于蛋白质表达的菌株和载体(例如由如Invitrogen、 Novagen、 New England Biolabs的公司提供的)，所述菌株和载体允许诱导型或组成 型的表达、靶蛋白的细胞内和分泌性定位；另外，可以使用下述技术，所 述技术使得蛋白质能够正确折叠或促进该正确折叠以得到可溶的和活性的 蛋白质。
蛋白质优选以分泌方式表达，在该情况下优选构建下述载体，在所述 载体中PLE禾Q APLE的序列以N末端方式连接到6*. ce/^v&'fle的ce因子信 号序列上。
还可制备其中C端四肽HAEL被额外删除的构建体，所述四肽如例如 Hardwick et al., (1990) EMBO J. 9, 623-630中所述作为ER保留信号作用。 另一优选的表达是带有或不带有ER保留信号的构建体的诱导型表达。
出乎意料的是，具有ER保留信号的构建体也可以被表达并得到 rAPLE，所述rAPLE能够选择性拆分外消旋的2-烷基-5-卤代戊-4-烯羧酸酯。
来自APLE基因核苷酸序列的新颖酯酶rAPLE的氨基酸序列如SEQ ID No. 1所述。
出乎意料的是，已可发现，与己知的rPLE相反，在每种情况下通过 例如在尸.细胞中表达分别编码APLE和PLE的DNA片断获得的 新颖的多肽或rAPLE蛋白质，能够立体选择性地拆分外消旋的2-烷基-5-卤代戊-4-烯羧酸酯。
本发明因此还涉及本发明的具有酯酶活性的多肽和重组酯酶(rAPLE) 用于拆分式(I)
的2-烷基-5-卤代戊-4-烯羧酸酯的外消旋化合物的用途，所述多肽和 重组酯酶与SEQ ID No. 1所示序列具有至少80%的同一性，其中R为Cr C6的垸基，！^是Q-C4的垸基且X是氯、溴或碘。
本发明具有酯酶活性的多肽和重组酯酶(rAPLE)优选与SEQ ID No. 1 所示蛋白质的序列具有至少90%、尤其优选至少98%的同一性。还可使 用本发明的下述具有酯酶活性的多肽或重组酯酶(rAPLE)，其具有通过常 见修饰例如突变、删除、延伸、融合获得的经修饰的SEQ ID. No. 1所示 DNA序列，所述经修饰的DNA序列编码具有想要的酯酶活性的酶。
在这方面，富含对映异构体的式(II)
的2-垸基-5-卤代戊-4-烯羧酸或其酯(其中R为d-CV烷基，A等于 H、 &或R2，其中Ri可以是Ci-C4的烷基，R2是垸基但不等于R"且X 为氯、溴或碘)是这样获得的在存在水或式R20H (其中R2是不等于R^ 的烷基)的醇作为亲核体时，通过用本发明的多肽或本发明的rAPLE转化 式(I)<formula>formula see original document page 11</formula>
的2-烷基-5-卤代戊-4-烯羧酸酯(其中R、 R,和X如上文定义)的对 映异构体混合物，以及
a) 对剩余的下述富含对映异构体的式(II)的2-烷基-5-卤代戊-4-烯羧酸 酯加以分离，所述式中A等于Rp或
b) 如果使用醇作为亲核体，那么对得到的下述富含对映异构体的式(II) 的2-垸基-5-卤代戊-4-烯羧酸酯加以分离，所述式中A等于R2，或
c) 如果使用水作为亲核体，对得到的下述式(II)的2-烷基-5-卣代戊-4-烯羧酸加以分离，所述式中A等于H。
式(II)中的R是d-C6的垸基，例如甲基、乙基、正丙基和异丙基、正 丁基、异丁基和叔丁基、戊基和己基。
CVC4的垸基是优选的，异丙基是尤其优选的。
A为H、 & (其中&是d-C4的垸基，优选是CrC2的烷基，尤其优 选是甲基)或R2 (其中R2为不等于Ri的垸基)。尤其优选地，R2是Cr
C6的綜基o
x为氯、溴或碘，优选氯。
在这方面富含对映异构体的化合物表示显示出>80%的对映体过量
(ee)、优选〉90%、尤其优选>97%的那些。
另外，本发明的酶可以以任何形式使用。例如作为分散剂、作为溶 液、被固定的、作为粗酶、作为已经通过己知的纯化方法的组合得自其来 源的酶、作为具有所需酶活性(天然或通过遗传活性)的完整细胞(其被 适当固定和/或透化)或处于这类细胞的裂解物中。
用于本发明的转化的反应温度通常在0匸和99。C之间，优选10和66 'C之间。反应溶液的pH在4和ll之间，优选6和9之间。
对溶剂的选择取决于使用的亲核体。
如果例如水为亲核体，则可以使用的溶剂是水，水和与水混溶的溶剂(例如与醇例如甲醇、乙醇、异丙醇、正丁醇等，二噁烷，四氢呋喃，丙 酮或二甲基亚砜)的混合物或水和与水不混溶的溶剂(例如芳香化合物例 如甲苯、二甲苯等，链垸例如己垸、庚垸、环己烷等，醚例如二异丙醚、 甲基叔丁基醚等)的两相系统。如果亲核体是醇，则优选地使用的溶剂是 醇R2OH，其中R2是不等于Ri的烷基。然而，还可能使用醇与有机溶剂
(例如四氢呋喃、庚烷、甲苯、己垸、CH3CN、甲基叔丁基醚等)的混合 物。
酶催化的外消旋化合物拆分发生后，想要的终产物被分离。这可以是 剩余的富含对映异构体的式(II)的2-垸基-5-卤代戊-4-烯羧酸酯(其中，A 等于R。，或当水为亲核体时是形成的富含对映异构体的式(II)的2-烷基-5-卤代戊-4-烯羧酸(其中，A等于H)，或当醇为亲核体时是富含对映异 构体的式(II)的2-烷基-5-卤代戊-4-烯羧酸酯(其中，A等于R2)。
分离可例如通过常规方法(例如抽提、结晶、柱色谱、蒸馏等)发生。
本发明的方法以多达98%的理论产率和多达〉99%的e.e.得到相应的式 (I)的酸或酯。
实施例1: mRNA分离和cDNA的产生
将来自新鲜宰杀的猪(其得自地方屠宰场)的0.7 g肝在液氮中冷冻 并用研钵匀化，使用Fast Track mRNA抽提试剂盒2.0 (Invitrogen, Carlsbad, Calif., USA)，根据制造商的说明书(Fast Track 2.0试剂盒手册；version J; 082301; 25-0099)，来分离或抽提被解离的mRNA。抽提提供了 12.9貼 的mRNA总量。
然后使用0.26 该mRNA作为模板，使用用于RT-PCR的 Superscript III First-Strand第一链合成系统，根据制造商的说明书来产生 cDNA。
实施例2:从猪肝扩增和克隆cDNA
制备基于GenBank编号No. X63323 (Matsushima et al.， 1991)的猪肝酯
酶基因序列的特异性引物
引物1: 5，-CAGA^rrCATGGCTATCGGGCAGCCAGCCTCGC-3， (SEQ ID No.3)
引物2: 5，-CCGG^7TCAGCCTCCCCTTCACAGCTCAG-3, (SEQ ID No. 4)
与已知的PLE序列同源的碱基用粗体表示。限制性内切核酸酶的识别 序列用斜体表示。
根据'Phusion High-Fidelity DNA聚合酶，手册(Finnzymes)，在50 pl混 合物中进行扩增，其中使用1 U husion DNA聚合酶(Finnzymes, Espoo, Finland),用500 ng cDNA作为模板，使用20 pmol每种引物1禾n 2、 5 pi 的dNTP混合物(每种2 mM)，所有都在lxPhusion HF缓冲液中，从在98 'C变性30秒开始，随后是用于扩增的30个循环(98°C 10秒、68°C 20 秒、72'C1分钟)和在7(TC孵育8分钟以制备完整的产物。
该PCR产生了大小为1.8 kb (通过琼脂糖凝胶电泳测定)的DNA片段。
然后使用Qiaquick试剂盒(Qiagen, Hilden, Germany),根据内含的手册 纯化该PCR产物。
用限制性核酸内切酶EcoRI切割约0.1 pg经纯化的PCR产物，并通过 EcoRI切割位点，将其克隆进质粒载体pHILZ和pHIL-D2中。
然后将载体转化进根据'Current Protocols in Molecular Biology，制备的 TOP10电感受态细胞中。
使用'Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing'试齐lj盒(Applied Biosystems Inc., Forster City, Calif., USA)，对若干个得到的克隆的插入物进 行测序。
藉此鉴定了两条序列， 一条100%对应于由Matsushima et al.， (1991) FEBS Lett. 293, 37-41公开的预期序列，另一条序列对应于SEQ ID No. 2。
实施例3:引入a因子信号序列和改变C末端
为了能够对本发明的蛋白质rAPLE和已知蛋白质PLE进行分泌型表
达，构建下述载体，在所述载体中PLE和APLE的序列以N末端方式与克 隆载体pPICZ a (Invitrogen)的o;因子起始序列相连。另外，制备其中C端 四肽HAEL被删除的构建体。
PCRI:使用EcoRI alpha 1/alpha PLE2引物对来扩增克隆载体pPICZ a; (Invitrogen)的o;因子信号序列。PCR在50 jul混合物(2 ng模板、0.5 pmol 每种引物、0.2 mM dNTPs、 1 U Phusion DNA聚合酶(Finnzymes)，均在 lxPhusion HF缓冲液中，根据'Phusion High-Fidelity DNA聚合酶，手册 (Finnzymesp中进行。
在95'C变性3分钟，随后在30个循环(95°C 30秒、57°C 30秒、72 "C15秒)中扩增，最终步骤为72'C7分钟。
PCR II : 使用 PLEalphal/EcoRIPLE+ER2 引物对或 PLEalphal/EcoRIPLE2 (删除C端HAEL四肽)引物对，从pHILZ质粒扩 增"LE和APLE序列。
再在50iul混合物(2ng模板、0.5 jLimol每种引物、0.2 mM dNTPs、 1 U Phusion DNA聚合酶(Finnzymes)，均在lxPhusion HF缓冲液中，根据 'Phusion High-Fidelity DNA聚合酶，手册(Finnzymes))中进行这些PCR。
95°C 3分钟变性，然后在30个循环(95°C 30秒、57°C 30秒、72°C 15秒)中扩增，最终步骤为72"C7分钟。
PCR III:使用3 |ul来自PCR I和PCR II的产物，通过无引物PCR将这 两种产物组合起来。
延伸在45 )ul混合物(0.2 mM dNTPs、 1 U的Phusion DNA聚合酶 (Finnzymes)，均在lxPhusion HF缓冲液中)中进行。
在95'C将反应混合物加热3分钟，然后在95°C 30秒和72°C 45秒进 行10个循环。为了扩增这些重叠的延伸产物，加入5 pl引物混合物(3 pi 水、1 jil 5 的EcoRIalphal引物和1 ^ 5 的EcoRIPLE+ER2或 EcoRIPLE2引物)。用20个PCR循环(95°C 30秒、57°C 30秒、72°C 1 分钟)扩增产物，并在72'C单温度停止7分钟。
引物序列
EcoRlalpha1: 5'-TCTTCGAAG/W7TCACGATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGC-3' (SEQ ID No. 5)
alphaPLE2: 5'-GAGGCTGGCTGCCCAGCTTCAGCCTCTCTTTTCTCG-3'
(SEQ ID No. 6)
PLEalpha1: 5'-AGAGAGGCTGAAGCTGGGCA(3CCAGCCTCGCCG-3' (SEQ ID No. 7)
EcoRIPLE+ER2: 5'-ATGGLACCG/A/A7TCTCACAGCTCAGCATGCTTTATCTTG-3' (SEQ ID No. 8)
EcoRIPLE2: 5'-ATGGLA CCGAA 7TCTCACTTTATCTTGGGTGGCTTCTTTG-3' (SEQ ID No. 9)
与模板具有同源性的区域是粗体，限制性内切核酸酶的识别序列是斜体。
实施例4:对用于在乃'C/^ p^to^中异源表达猪肝酯酶的表达构建体 的构建
使用Qiaquick试剂盒(Qiagen, Hilden， Germany),根据内含的手册来纯 化来自实施例3的重叠延伸PCR产物。使用EcoRI限制性内切核酸酶切割 约O.l ng经纯化的PCR产物，并通过EcoRI切割位点将其克隆进质粒载体 pGAPZ A (Invitrogen)中。
借助于对照切割(例如使用Ncol)，检查插入物相对于启动子的正确 方向。
在每种情况下，选择带有方向正确的插入物的克隆，对其测序并保存。
按照下文所述，对相应的质粒命名
含有Matsushima et al., (1991) FEBS Lett. 293, 37-41中公开的已知PLE 序列的质粒被称作pGAPZ A PLE-ER (HAEL四肽被删除)和pGAPZ A PLE+ER (HAEL四肽仍然存在)。
来自新颖的APLE序列的质粒被称作pGAPZ A APLE-ER (HAEL四 肽被删除)和pGAPZ A APLE-ER (HAEL四肽仍然存在)。
实施例5:猪肝酯酶在i^c/ 'a卯stor^中的组成型表达
将质粒pGAPZ A PLE-ER、 pGAPZ A PLE+ER、 pGAPZ A APLE-ER
和pGAPZ A APLE+ER转化进尸.pastor^ X-33。根据来自Invitrogen的 Pichia Expressions试剂盒的方案说明书来进行转化。在含有100 mg/1 zeocin的YPD平板(1%酵母提取物、2%蛋白胨、2% D-葡萄糖、2%琼 脂)上选择转化子。在含有100 mg/1 zeocin的YPD平板上对经52个 zeocin抗性的克隆划线，并将其保存于15%甘油中。
实施例6:对酯酶活性的定量分析
在含有100 mg/1 zeocin的YPD平板上，于3(TC下，对尸.戸5to^转化 子进行48小时的培养。将细胞挑至Whatman 541硬化的无灰70 mm0滤 纸上并晾干。用6mgo;-萘基醋酸盐(Sigma,溶于500 ^丙酮中)、2.5 mg邻 联茴香胺(tetrazotized o-dianisidine) (Fast Blue Salt BN, Sigma，溶于125 pl水 中)和5 ml 0.1 M磷酸氢二钾缓冲液，pH 7的溶液孵育滤纸，以通过显色反 应来观察酯酶活性。
在整合了 4种质粒pGAPZ A PLE-ER、 pGAPZ A PLE+ER、 pGAPZ A APLE-ER和pGAPZ A APLE+ER之一的所有转化子中都检测到了活性。 这证明了具有酯酶活性的功能蛋白质的表达。为了核实，也以相同方式测 试整合了空载体的克隆。在该情况下，在相当长的反应周期内都未看到显 著的酯酶活性。
实施例7:与甲基5-氯代-2-a-甲基乙基V4-戊烯酸酯相关的立体选择 性酯酶活性
在含有100 mg/1 zeocin的YPD平板上，于3CTC下，对实施例6中所 述的尸./ a^on、转化子进行48小时的培养。将细胞挑至Whatman 541硬化 的无灰70 mm0滤纸上并晾干。将滤纸与底物溶液A (100 pl外消旋的甲 基5-氯代-2-(l-甲基乙基)-4-戊烯酸酯、200 ^ 0.1 M磷酸二氢钾缓冲液， pH 8; 150 |il 10 mg/ml酚磺酞；450 |ul DMSO; 650 jil H20)或底物溶液B (与底溶液A相同，但是使用甲基(2S，4E)-5-氯代-2-(l-甲基乙基)-4-戊烯酸 酯代替外消旋化合物) 一起孵育。
由于有针对底物的特异酯酶活性，酯底物水解得到的酸释放导致pH
降低，这随后导致酚磺酞指示剂的颜色变黄。
这显示含有质粒pGAPZ A APLE-ER的转化子如果在底物溶液A上 测试时在孵育3到4小时后给出信号(菌落周围黄色)，而使用底物溶液 B时不能发现显著的转化(
图1)。
使用质粒pGAPZ A PLE-ER或pGAPZ A PLE+ER获得的转化子在相 同的条件下显示不与底物溶液A或B反应。
这显示重组的rAPLE与重组的rPLE具有底物特异性差异，且使用 rAPLE对甲基5-氯代-2-(l-甲基乙基)-4-戊烯酸酯的水解是立体选择性地针 对(R)对映异构体发生的。
实施例8: SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
向10 ^可商业获得的猪肝酯酶或10 pi P. pastoris培养物(在带盖2 L Erlenmeyer摇瓶中的250 ml YPD培养基中，于100 rpm和28。C下培养72 小时)的60倍浓縮(Centricon Ultrafiltrations-Spin Columns,来自 Sartorius)的上清液中加入10 |il 2x SDS样品缓冲液(125 mM Tris-HCl， pH 6.8; 4% SDS， 20%甘油、5%/3-巯基乙醇、0.05%溴酚蓝)，所述培养物含有 质粒pGAPZAAPLE-ER或空的pGAPZA质粒(对照菌株)。
样品已经在95。C加热5分钟后，在12.5%的聚丙烯酰胺凝胶(4%成层 胶)上分离蛋白质，用考马斯亮蓝R250染色用于检测。SDS-PAGE显 示在具有pGAPZ A APLE质粒的酵母菌株中有具有rAPLE的期望大小 ( 60kDa)的蛋白质条带，但是在对照菌株中没有(图2)。
也被分析以用于比较的可商业获得的猪肝酯酶在相同尺寸范围内显示 出两条蛋白质条带(图2中箭头)。
实施例9:用AOXl启动子对猪肝酯酶的诱导表达
用限制性内切核酸酶Xhol切割质粒pGAPZ A PLE-ER、 pGAPZ A PLE+ER、 pGAPZ A APLE-ER和pGAPZ A APLE+ER，并通过XhoI切割 位点将编码APLE和PLE蛋白质的各片段(其具有或不具有ER保留信 号)克隆进pPIC9载体(Invitrogen)中。通过用限制性内切核酸酶Ncol核实
片段相对于A0X1启动子的正确方向。与实施例4中命名的质粒类似，具 有AOXl启动子的载体被称作pPIC9 PLE-ER、 pPIC9 PLE+ER、 pPIC9 APLE-ER和pPIC9 APLE+ER，用Sail对其进行线性化，并将其转化进尸. / a饰r^ KM71中。根据来自Invitrogen的Pichia表达试剂盒的说明书进行 转化以及对His原营养型的选择。根据来自Invitrogen的Pichia表达试剂 盒的说明书，在完全培养基上对选出的转化子和KM71菌株进行过夜培 养，并用1%的甲醇诱导48小时。通过实施例7中所述的定量pH-迁移测 定法分析得到的培养物，在每种情况下对混合物中2 pi的培养物进行测 试。与实施例7中针对组成型表达所述的情况相比，诱导型AOXl控制下 的表达导致高得多的与外消旋的甲基5-氯代-2-(l-甲基乙基)-4-戊烯酸酯相 关的rAPLE酶活性。仅在几分钟后就可检测到酚磺酞颜色改变(红到黄)
(图3)。出乎意料的是，rAPLE活性与C端ER保留信号HAEL的存在 无关，S卩，甚至表达带有ER保留信号的rAPLE的细胞也显示活性。相 反，用于生产rPLE的酵母菌株不具有与外消旋甲基5-氯代-2-(l-甲基乙 基)-4-戊烯酸酯相关的活性。
权利要求
1.具有酯酶活性并显示氨基酸序列SEQ.ID.No.1的多肽。
2. 具有酯酶活性并显示氨基酸序列SEQ. ID. No. 1的重组蛋白质。
3. 多肽或重组蛋白质，其显示与SEQ. ID. No. 1所示氨基酸序列至少 80%的同一性，并具有对式(I)的2-垸基-5-卤代戊-4-烯羧酸酯进行外消旋拆分的活性，其中R是Cr C6的烷基，Ri是d-C4的烷基，且X是氯、溴或碘。
4. 权利要求1-3中任一项所述的多肽或重组蛋白质，其具有酯酶活 性，其显示通过常见修饰而被修饰的氨基酸序列，所述常见修饰选自突 变、缺失、插入、延伸和/或融合。
5. 核苷酸序列，其编码权利要求1所述的多肽或权利要求2所述的重 组蛋白质。
6. 核苷酸序列，其具有SEQIDNo.2所示的序列。
7. 核苷酸序列，其包含权利要求5或6所示的核苷酸序列。
8. 权利要求1、 2、 3或4所述的多肽或重组蛋白质用于对式(1)<formula>formula see original document page 2</formula>的2-烷基-5-卤代戊-4-烯羧酸酯进行外消旋拆分的用途，其中R是Cr C6的烷基，Ri是d-C4的垸基，且X是氯、溴或碘。
9.用于制备富含对映异构体的式(II)<formula>formula see original document page 3</formula>的2-垸基-5-卤代戊-4-烯羧酸或其酯的方法，其中R是d-C6的垸基， A等于H、 &或112，其中R,可以是d-C4的烷基，其中R2是垸基但是不 等于Ri，且X为氯、溴或碘，所述方法包括在存在水或其中R2是不等于 Ri的烷基的式R20H的醇作为亲核体时，通过权利要求l、 2、 3或4所述 的多肽或重组酯酶来转化式(I)的2-垸基-5-卤代戊-4-烯羧酸酯的对映异构体混合物，其中R、 &和 X如上文定义，以及a) 分离剩余的下述富含对映异构体的式(II)的2-烷基-5-卣代戊-4-烯羧 酸酯，所述式中A等于Rp或b) 如果使用醇作为亲核体，分离得到的下述富含对映异构体的式(n)的2-垸基-5-卤代戊-4-烯羧酸酯，所述式中A等于R"或c) 如果使用水作为亲核体，分离得到的下述式(II)的2-烷基-5-卤代戊-4-烯羧酸，所述式中A等于H。
全文摘要
本发明公开了具有酯酶活性的多肽和重组蛋白质(其展示出氨基酸序列SEQ.ID.No.1)及其用途。
文档编号C12N15/52GK101351548SQ200680049665
公开日2009年1月21日 申请日期2006年12月8日 优先权日2005年12月27日
发明者乔纳斯·西基尔科斯, 克里斯托弗·赞兹马尔, 哈拉德·皮希勒, 彼得·波亚尔里尔, 格哈德·斯坦保尔, 沃夫冈·斯卡安可, 赫尔马特·施瓦布, 迈克尔·施塔内克, 马塞尔·乌博尔特斯, 马诺拉·埃尔曼 申请人:Dsm精细化学奥地利Nfg两合公司