专利名称：编码基因sdhA,sdhB和sdhC的新核苷酸序列的制作方法
技术领域：
本发明提供了来自棒状细菌的编码基因sdhC,sdhA和sdhB的核苷酸序列，和通过弱化sdhC和/或sdhA和/或sdhB基因发酵生产L-氨基酸特别是L-赖氨酸的方法。
L-氨基酸特别是L-赖氨酸用于人用药物和制药工业，食品工业，特别是动物营养。
已知L-氨基酸可通过棒状细菌菌株，尤其谷氨酸棒杆菌的发酵而生产。由于其极其重要性，已持续进行改良生产方法的尝试。生产方法的改良可涉及发酵措施，如搅拌和供氧，或营养培养基的组成如发酵期间的糖浓度，或产物形式的加工方法，例如通过离子交换层析，或微生物本身的固有生产性质。
为改良这些微生物的生产性质，可使用诱变，选择及突变体选择等方法，以此方法可获得对抗代谢物有抗性或重要的调节代谢物营养缺陷的并产生L-氨基酸的菌株。
一段时间以来，重组DNA技术的方法也用于棒杆菌生产L-氨基酸的菌株的改良。
本发明人目的在于为改良氨基酸尤其是L-赖氨酸的发酵生产而提供新措施。
L-氨基酸、尤其是赖氨酸用于人用药物及制药工业，食品工业，特别是动物营养，因此提供生产L-氨基酸特别是L-赖氨酸的新改良方法总是令人感兴趣的。
本发明提供了一种分离的多核苷酸，其含有选自如下一组的多核苷酸序列a)与编码含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多肽的多核苷酸至少70％相同的多核苷酸，
b)与编码含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的多肽的多核苷酸至少70％相同的多核苷酸，c)与编码含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的多肽的多核苷酸至少70％相同的多核苷酸，d)编码含有与SEQ ID NO:3的氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，e)编码含有与SEQ ID NO:5的氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，f)编码含有与SEQ ID NO:7的氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，g)与a),b),c),d),e)或f)的多核苷酸互补的多核苷酸，以及h)含有a),b),c),d),e)或f)的多核苷酸序列的至少15个连续核苷酸的多核苷酸。
本发明还提供了一种多核苷酸，其优选是能在棒状细菌中复制的DNA，并且特别是编码含有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的多肽。
本发明还提供了是RNA的多核苷酸。
本发明还提供了上述多核苷酸，其中其优选包括一能复制的DNA，含有(ⅰ)SEQ ID NO:1的核苷酸序列，或(ⅱ)在遗传密码简并范围内相应于(ⅰ)序列的至少一个序列，或(ⅲ)与互补于(ⅰ)或(ⅱ)序列的序列杂交的至少一个序列，和任选地，(ⅳ)(ⅰ)中有功能的中性有义突变。
本发明还提供了含有一个所述的多核苷酸的载体，以及作为宿主细胞的含有该载体的棒状细菌。
本发明还提供了基本上由一种多核苷酸序列组成的多核苷酸，其可通过用含有相应于SEQ ID NO:1所述多核苷酸或其片段的序列的探针杂交合适的基因文库，并分离所述的DNA序列来筛选获得，所述的文库包括具有相应于SEQ ID NO:1的所述多核苷酸序列的完整基因。
本发明的多核苷酸序列适用作RNA、cDNA和DNA的杂交探针，以分离编码琥珀酸脱氢酶或其亚基A、B或C的全长cDNA，以及分离与琥珀酸脱氢酶或其亚基A、B或C的基因具有高度序列相似性的cDNA或基因。
本发明的多核苷酸序列还适用作通过聚合酶链反应(PCR)制备编码琥珀酸脱氢酶的基因的DNA的引物。
作为探针或引物的这种寡核苷酸含有至少30个、优选至少20个、特别优选至少15个连续核苷酸。具有至少40或50个核苷酸的寡核苷酸也是合适的。
“分离的”是指从其天然环境中分离出来。
“多核苷酸”一般地涉及多聚核糖核苷酸和多聚脱氧核糖核苷酸，其可以是非修饰的RNA或DNA，或修饰的RNA或DNA。
“多肽”应理解为包括经肽键结合的两个或多个氨基酸的肽或蛋白质。
本发明的多肽包括SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5和SEQ IDNO:7的多肽，特别是具有琥珀酸脱氢酶生物学活性的多肽，以及与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:7的多肽至少70％相同的多肽，优选地与SEQ ID NO::3、SEQ ID NO::5和SEQID NO:7的多肽至少80％、特别是90-95％相同并具有所述活性的多肽。
本发明另外还提供了用尤其已生产L-氨基酸特别是L-赖氨酸的棒状细菌发酵生产L-氨基酸特别是L-赖氨酸的方法，在该棒状细菌中编码sdhC基因和/或sdhA和/或sdhB基因的核苷酸序列是弱化的，尤其是低水平表达的。
文中术语“弱化”是指微生物中由相应DNA编码的一或多种酶(蛋白质)的胞内活性的降低或抑制，例如通过用弱启动子或编码具有低活性的相应酶的基因或等位基因或失活相应基因或酶(蛋白)，及任选地组合使用这些方法。
本发明的微生物可从葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉、纤维素或从甘油和乙醇中生产L-氨基酸特别是L-赖氨酸。此微生物可以是棒状细菌尤其是棒杆菌属的代表菌。在棒杆菌属中尤其应提及的是谷氨酸棒杆菌，本领域技术人员已知其生产L-氨基酸的能力。
适当的棒杆菌菌属，尤其谷氨酸棒杆菌菌株，是例如已知的野生型菌株谷氨酸棒杆菌 ATCC13032醋谷棒杆菌 ATCC15806嗜乙酰乙酸棒杆菌 ATCC13870Corynebacterium melassecola ATCC17965嗜热产氨棒杆菌FERM BP-1539黄色短杆菌ATCC14067乳发酵短杆菌ATCC13869和扩展短杆菌ATCC14020和从中获得的生产L-氨基酸的突变体或菌株如谷氨酸棒杆菌 FERM-P1709黄色短杆菌 FERM-P1708乳发酵短杆菌 FERM-P1712谷氨酸棒杆菌 FERM-P6463
谷氨酸棒杆菌 FERM-P6464谷氨酸棒杆菌 DSM5714。
本发明人成功地从谷氨酸棒杆菌分离了编码琥珀酸脱氢酶(EC1.3.99.1)的新基因sdhC,sdhA和sdhB。
为从谷氨酸棒杆菌中分离sdhC和/或sdhA和/或sdhB基因，首先在大肠杆菌中构建这一微生物的基因文库。构建基因文库的方法在已知的教科书和手册中有描述。可提及的例子为Winnacker的教科书，基因和克隆，遗传工程方法入门(Verlag Chemie,Weinheim，德国，1990)，或由Sambrook等所著手册分子克隆实验手册(Cold SpringHarbor Laboratory Press,1989)。一非常熟知的基因文库是已由Kohara等(细胞50,495-508(1987))在λ载体中建立的E.coli K-12菌株W3110的基因文库。Bathe等(分子及普通遗传学，252:255-265,1996)阐述了借助于粘粒载体SuperCos I(Wahl等，1987,Proceedingof the National Academy of Sciences USA,84:2160-2164)，在E.coli K-12菌株NM554(Raleigh等，1988，核酸研究16:1563-1575)中建立的谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的基因文库。Bormann等(分子微生物学6(3),317-326)描述了用粘粒pHC79(Hohn和Collins，基因11,291-298(1980))制备谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因文库。O′Donohue(谷氨酸棒杆菌中四种常见芳香氨基酸生物合成基因的克隆和分子学分析，博士论文，国立爱尔兰大学，Galway,1997)描述了用Short等(核酸研究，16:7583)描述的λZap表达系统克隆谷氨酸棒杆菌基因。
为在大肠杆菌中制备谷氨酸棒杆菌的基因文库，也可使用质粒如pBR322(Bolivar，生命科学25,807-818(1979))或pUC9(Viera等，1982，基因19:259-268)。合适的宿主尤其是限制和重组缺陷的大肠杆菌菌株，一个例子是菌株DH5α(Jeffrey H.Miller细菌遗传学简明教程，大肠杆菌和相关细菌的实验室手册，冷泉港实验室出版社，1992)借助于粘粒或其他λ载体克隆的长DNA片段随后可亚克隆并用适于DNA测序的通用载体中。
DNA测序方法如Sanger等(美国科学院院报74:5463-5467,1977)所述。
然后得到的DNA序列可用已知的算法或序列分析程序分析，例如Staden程序(核酸研究14,217-232(1986)),Butler的GCG程序(生化分析方法39,74-97(1998)),Pearson&Lipman的FASTA算法(美国科学院院报85,2444-2448(1988))或Altschul等的BLAST算法(自然遗传学6,119-129(1994))，并与公众可及数据库中提供的序列比较。公众可及核苷酸数据库例如为欧洲分子生物学实验室数据库(EMBL，德国海德堡)或国家生物技术信息数据库(NCBI,Bethesda,MD,USA)。
本发明提供了以此方式获得的编码sdhC,sdhA和sdhB基因的谷氨酸棒杆菌的新DNA序列，示作SEQ ID NO:1。用前述方法从此DNA序列中也已衍生出相应蛋白质的氨基酸序列。所得sdhC,sdhA和sdhB基因产物的氨基酸序列以SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:7表示。
通过遗传密码的简并性产生自SEQ ID NO:1的编码DNA序列也是本发明的一部分。另外，蛋白质中的保守氨基酸置换，如用丙氨酸置换蛋白质中甘氨酸，或用谷氨酸置换蛋白质中天冬氨酸，本领域已知是“有义突变”，其不引起蛋白质任何功能的改变，即是中性的。另外已知蛋白质N和/或C-末端的改变基本不影响其功能，或者甚至可以稳定其功能，本领域技术人员可在以下文献中发现对此的论述，参见Ben-Bassat等(细菌学杂志169:751-757(1987))O’Regan等(基因77:237-251.(1989)),Sahin-Toth等(蛋白质科学3:240-247(1994)),Hochuli等(生物/技术6:1321-1325(1988))，及已知关于遗传和分子生物学的教材。以相应方式产生自SEQ ID NO:1的氨基酸序列以及编码这些氨基酸序列的DNA序列也是本发明的一部分。
同样，与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:1的部分杂交的DNA序列也是本发明的组成部分。最后，用产生自SEQ ID NO:1的引物经聚合酶链反应(PCR)制备的DNA序列也是本发明的组成部分。
通过杂交鉴别DNA序列的指导可参见宝灵格曼海姆有限公司的手册“用于滤膜杂交的DIG系统用户指南”(曼海姆，德国，1993)以及Liebl等(系统细菌学国际杂志(1991)41:255-260)。用聚合酶链反应(PCR)扩增DNA序列的指导参见Gait的手册寡核苷酸合成实用方法(IRL出版社，英国牛津，1984)及Newton和Graham:PCR(Spektrum Akademischer Verlag,Heidelberg，德国，1994)。
本发明人发现，在sdhC和/或sdhA和/或sdhB基因弱化后，棒状细菌以改良方式生产L-氨基酸尤其是L-赖氨酸。
弱化可通过降低或抑制sdhC和/或sdhA和/或sdhB基因的表达或酶蛋白的催化性质而实现。两种措施可任选地组合。
降低基因表达可通过合适控制培养或遗传修饰(突变)基因表达的信号结构而实现。基因表达的信号结构是例如，阻遏基因、活化基因、操纵基因、启动子、弱化子、核糖体结合位点、起始密码和终止子。本领域熟练技术人员从以下文献中可发现对此的详述，例如专利申请WO96/15246,Boyd&Murphy(细菌学杂志170:5949(1988)),Voskuil&Chambliss(核酸研究26:3548(1998)),Jensen和Hammer(生物技术及生物工程58,191-195(1998)),Patek等(微生物学142:1297(1996))，及已知关于遗传及分子生物学的教材，如Knippers的教科书(分子遗传学，第6版，Georg Thieme Verlag,Stuttgart，德国，1995)或Winnacker(基因和克隆，VCH Verlagsgesellschaft,Weinheim，德国，1990)。
导致酶蛋白的催化特性的变化或降低的突变是现有技术已知的；可提及的例子为Qiu and Goodman的论文(生物化学杂志272:8611-8617(1997)),Sugimoto等(生物科学生物技术和生物化学61:1760-1762(1997))和Mockel(谷氨酸棒杆菌的苏氨酸脱水酶酶的别构调节方法及结构，于利希研究中心报告，Jul-2906,ISSN09442952,于利希，德国，1994)。综述可在遗传学和分子生物学已知教科书中找到，例如，Hagemann的教科书(“Allgemeine Genetik”,Gustav FischerVerlag,Stuttgart,1986)。
可以考虑的突变是转换、颠换、插入和缺失。根据氨基酸交换对酶活性的影响，突变已知为错义突变或无义突变。基因中插入或缺失至少一个碱基对导致移码突变，结果是插入不正确的氨基酸或翻译过早终止。缺失两或多个密码子典型地导致酶活性的完全丧失。产生这种突变的指导属于现有技术并可在已知的遗传学和分子生物学教科书中找到，例如Knippers的教科书(分子遗传学，第6版，Georg ThiemeVerlag,Stuttgart，德国，1995),Winnacker的教科书(基因和克隆，VCH Verlagsgesellschaft,Weinheim，德国，1990)或Hagemann的教科书(Allgemeine Genetik,Gustav Fischer Verlag,Stuttgart,1986)。
突变谷氨酸棒杆菌的基因的一个常用方法是Schwarzer&Puhler所述的基因破坏和基因置换方法(生物/技术9,84-87(1991))。
在基因破坏方法中，将感兴趣基因的编码区的中心部分克隆进可在宿主(典型地是大肠杆菌)中复制而在谷氨酸棒杆菌中不能复制的质粒载体中。可考虑的载体例如是pSUP301(Simon等，生物/技术1,784-791(1983)),pK18mob或pK19mob(Schafer等，基因145,69-73(1994)),pK18mobsacB或pK19mobsacB(Jager等，细菌学杂志174:5462-65(1992)),pGEM-T(Promega公司，Madison,WI,USA),pCR2.1-TOPO(Shuman(1994)，生物化学杂志269:32678-84；US-A5,487,993),pCR(Blunt(Invitrogen,Groningen，荷兰；Bernard等，分子生物学杂志，234:534-541(1993))或pEM1(Schrumpf等，1991，细菌学杂志173:4510-4516)。含有基因的编码区的中心部分的质粒载体然后可经接合或转化转移进希望的谷氨酸棒杆菌菌株。接合方法例如如Schafer等(应用及环境微生物学60,756-759(1994))所述。转化方法例如如Thierbach等(应用微生物学及细菌学29,356-362(1988)),Dunican和Shivnan(生物/技术7,1067-1070(1989))和Tauch等(FEMS微生物学通信123,343-347(1994))所述。经“交换”而同源重组后，该基因编码区被载体序列打断，获得两个不完整的等位基因，每个缺失3′或5′末端。这一方法例如在由Fitzpatrick等所述的抑制谷氨酸棒杆菌的recA基因中所述(应用微生物学和生物工程42,575-580(1994))。sdhC和/或sdhA和/或sdhB基因可以此方式抑制。
在基因置换方法中，在感兴趣的基因中体外产生一突变，如缺失、插入或碱基置换。得到的等位基因随后克隆进在谷氨酸棒杆菌中不能复制的载体中，该载体然后经转化或接合转移进谷氨酸棒杆菌所需宿主中。经第一次“交换”而同源重组实现整合后，及实现切割的合适的第二次“交换”后，在靶基因或靶序列中掺入突变或等位基因。这一方法例如已由Peters-Wendisch用于经缺失抑制谷氨酸棒杆菌的pyc基因中(微生物学144,915-927(1998))。以此方式可在sdhC和/或sdhA和/或sdhB基因中掺入缺失、插入或碱基置换。
本发明因此提供了一种发酵生产L-氨基酸、尤其是L-赖氨酸的方法，其中使用用一质粒载体转化的菌株，该质粒载体携带编码琥珀酸脱氢酶的基因的核苷酸序列，或者使用携带一sdhC和/或sdhA和/或sdhB基因的缺失、插入或碱基置换的菌株。
发酵生产L-氨基酸、尤其是L-赖氨酸的方法包括下述步骤a)发酵产生L-氨基酸的棒状细菌，该细菌中选自编码琥珀酸脱氢酶及其亚基A、B和C的基因的至少一个基因是弱化的，
b)在培养基或细菌细胞中积累L-氨基酸，和c)分离L-氨基酸。
另外，除了弱化sdhC和/或sdhA和/或sdhB基因外，特定生物合成途径、糖酵解、回补代谢、柠檬酸循环或氨基酸输出的一或多种酶的扩增、特别是过表达，对L-氨基酸特别是L-赖氨酸的生产可以是有益的。
因此，为生产L-赖氨酸，例如可同时过表达选自如下一组的基因·编码二氢-2,6-吡啶二羧酸合酶的dapA基因(EP-B-0197335)，或·编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶的gap基因(Eikmanns(1992)，细菌学杂志174,6076-6086)，或·编码丙酮酸羧化酶的pyc基因(Eikmanns(1992)，细菌学杂志174,6076-6086)，或·编码苹果酸醌氧化还原酶的mqo基因(Molenaar等，欧洲生化杂志254,395-403(1998))，或·编码赖氨酸输出蛋白的lysE基因(DE-A-195 48 222)。
对于氨基酸特别是L-赖氨酸的生产，还有利的是同时弱化·编码烯醇丙酮酸磷酸羧激酶的pck基因(DE19950409.1,DSM13047)和/或·编码葡萄糖-6-磷酸异构酶的pgi基因(US09/396,478,DSM12969)。
除了弱化sdhC和/或sdhA和/或sdhB基因外，抑制非所需的二级反应对L-氨基酸特别是L-赖氨酸的生产也是有益的(Nakayama:“生产氨基酸的微生物的育种”，微生物产物的过量产生，Krumphanzl,Sikyta,Vanek(编辑)，学术出版社，伦敦，英国，1982)。
本发明还提供了含有权利要求1的多核苷酸的微生物，根据本发明产生的微生物可连续培养或用分批方法，补料分批方法或重复补料分批法分批培养以生产L-氨基酸特别是L-赖氨酸。已知的培养法由Chmiel所著教材(Bioprozesstechnik 1.Einfuhrung in dieBioverfahrenstechnik(Gustav Fischer Verlag,Stuttgart,1991)，或由Storhas所著教材(Bioreaktoren und periphere Einrichtungen(ViewegVerlag,Brunswick/Wiesbaden,1994))中提供。
所用培养基必须以适当方式符合各菌株的需求，关于各种微生物培养基的阐述见于，美国细菌学会的“细菌学通用方法手册”(华盛顿D.C.,USA,1981)。可使用的碳源包括糖及碳水化合物，例如葡萄糖，蔗糖，乳糖，果糖，麦芽糖，糖蜜，淀粉和纤维素，油和脂肪如豆油，葵花油，落花生油和椰子油，脂肪酸如棕榈酸，硬脂酸和亚油酸，醇如甘油和乙醇，及有机酸如乙酸，这些物质可单独或混合使用，可使用的氮源包括含氮的有机化合物如胨，酵母提取物，肉膏，麦芽提取物，玉米浸液、大豆粉和尿素，或无机化合物如硫酸铵，氯化铵，磷酸铵，碳酸铵和硝酸铵。氮源可单独或混合使用，可使用的磷源包括磷酸，磷酸二氢钾或磷酸氢二钾，或相应钠盐培养基另外还必须含有为生长所需的金属盐如硫酸镁或硫酸铁。最后，除了上述物质之外，可使用生长必需物质如氨基酸和维生素，此外，可将适当前体加入培养基中上述物质可以单批形式或在培养期间以适当方式加入培养物中。
可以适当方式加入碱性化合物如NaOH,KOH，氨或氨水，或酸性化合物如磷酸或硫酸，以调节培养物的PH值，抗泡沫剂例如脂肪酸聚乙二醇酯可用于控制泡沫产生。适当的选择性作用物质例如抗生素，可加入培养基中以保持质粒的稳定性。氧气或含氧混合气，例如空气，可充入培养物中以保持有氧条件。培养温度通常在20℃～45℃，优选25℃～40℃，持续培养直至赖氨基酸形成最大量。此目的通常在10～160小时范围达到。
L-氨基酸的测定方法是现有技术已知的，分析可通过阴离子交换层析，随后经如Speckman等(分析化学，30,(1958),1190)所述茚三酮衍生化作用进行，或通过反相HPLC，如Lindroth等(分析化学(1979)51:1167-1174)进行。
本发明借助于以下提供的实施例得以更详述阐述。
实施例1制备谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因组粘粒基因文库。
如Tauch等(1995，质粒33:168-179)所述分离谷氨酸棒杆菌ATCC13032的染色体DNA，并用限制性内切酶Sau3AⅠ(AmershamPharmacia,Freiburg，德国，产品描述Sau3AⅠ，编码号27-0913-02)部分酶切。用虾碱性磷酸酶(Roche Molecular Biochemicals，德国曼海姆，产品描述SAP，编码1758250)将DNA片段去磷酸化。得自Stratagene公司(La Jolla,USA，产品描述SuperCosl粘粒载体试剂盒，编码251301)的粘粒载体SuperCosl(Wahl等(1987)美国科学院院报84:2160-2164)的DNA用限制性内切酶XbaⅠ(Amersham Pharmacia,Freiburg，德国，产品描述XbaⅠ，编码27-0948-02)酶切并类似地用虾碱性磷酸酶去磷酸化。粘粒DNA然后用限制性内切酶BamHⅠ(Amersham Pharmacia,Freiburg，德国，产品描述BamHⅠ，编码27-0868-04)酶切。以此方式处理的粘粒DNA与处理的ATCC13032DNA片段混合并用T4 DNA连接酶(Amersham Pharmacia,Freiburg,德国，产品描述T4-DNA-连接酶，编码27-0870-04)处理。连接混合物然后用GigapackⅡ XL包装提取物(Stratagene,La Jolla,USA,产品描述GigapackⅡ XL包装提取物，编码200217)包装进噬菌体中。为感染大肠杆菌菌株NM554(Raleigh等，1988，核酸研究16:1563-1575)，将细胞置于10mM MgSO4并与噬菌体悬液混合。如Sambrook等(1989，分子克隆实验手册，冷泉港)所述进行粘粒文库的感染和滴定，细胞在含100微克/毫升氨苄青霉素的LB琼脂(Lennox,1955，病毒学，1:190)上铺板。在37℃保温过夜后，选择重组克隆。
实施例2 sdhC,sdhA和sdhB基因的分离和测序用Qiaprep Spin微量制备试剂盒(产品号27106,Qiagen,Hilden，德国)根据厂商指导分离单个菌落的粘粒DNA，并用限制性内切酶Sau3AⅠ(Amersham Pharmacia,Freiburg，德国，产品描述Sau3AⅠ，编码27-0913-02)部分酶切。用虾碱性磷酸酶(Roche MolecularBiochemicals，德国曼海姆，产品描述SAP，编码1758250)将DNA片段去磷酸化。凝胶电泳分离后，用QiaExⅡ凝胶提取试剂盒(产品号20021,Qiagen,Hilden，德国)分离大小范围为1500-2000bp的粘粒片段。得自Invitrogen公司(Groningen，荷兰，产品描述Zero背景克隆试剂盒，产品号K2500-01)的测序载体pZero-1的DNA用限制性内切酶BamHⅠ(Amersham Pharmacia,Freiburg，德国，产品描述BamHⅠ，产品号27-0868-04)酶切。如Sambrook等(1989,分子克隆实验手册，冷泉港)所述进行粘粒片段在测序载体pZero-1中的连接，DNA混合物与T4连接酶(Pharmacia Biotech,Freiburg，德国)保温过夜。然后将连接混合物电穿孔(Tauch等，1994,FEMS微生物学通信，123:343-7)进大肠杆菌菌株DH5αMCR(Grant,1990，美国科学院院报87:4645-4649)并在含有50微克/毫升zeocin的LB琼脂(Lennox,1955，病毒学，1:190)上铺板。重组克隆的质粒制备用Biorobot 9600(产品号900200,Qiagen,Hilden，德国)进行。测序用Zimmermann等(1990，核酸研究18:1067)改良的Sanger等(1977,美国科学院院报74:5463-5467)的双脱氧链终止法进行。使用得自PE应用生物系统公司(产品号403044,Weiterstadt，德国)的“RR罗丹明终止循环测序试剂盒”。在带有购自PE应用生物系统公司(Weiterstadt，德国)的“ABI Prism377”测序仪的“Rotiphoresis NF”丙烯酰胺/双丙烯酰胺凝胶(29:1)(产品号A124.1,Roth,Karlsruhe,德国)中进行凝胶电泳分离和序列分析。
得到的原始数据资料然后用Staden程序包(1986，核酸研究，14:217-231)版本97-0处理。pZero-1衍生物的各个序列组装成连续重叠群。用XNIP程序(Staden,1986，核酸研究，14:217-231)进行计算机辅助编码区分析。进一步分析用“BLAST搜索程序”(Altschul等，1997，核酸研究，25:3389-3402)对“国家生物技术信息中心”(NCBI,Bethesda,MD,USA)的非冗余数据库进行。
获得的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。对该核苷酸序列的分析显示-879碱基对的开放读框，其被称为sdhC基因，和-1875碱基对的开放读框，其被称为sdhA基因，和-852碱基对的开放读框，其被称为sdhB基因。sdhC基因编码293个氨基酸的多肽，其在SEQID NO:3中示出。sdhA基因编码625个氨基酸的多肽，其在SEQ IDNO:5中示出。sdhB基因编码284个氨基酸的多肽，其在SEQ ID NO:7中示出。
实施例3用于sdhA基因的整合诱变的整合载体的制备用Eikmanns等(微生物学140:1817-1828(1994))的方法分离谷氨酸棒杆菌ATCC13032的染色体DNA。基于实施例2已知的谷氨酸棒杆菌sdhA基因的序列，选择下述寡核苷酸用于聚合酶链反应sdhA-in15′-CGT CAT TGT CAC CGA ACG TA-3′sdhA-in25′-TCG TTG AAG TCA GTC CAG AG-3′所述引物由MWG生物技术公司(Ebersberg，德国)合成，并根据Innis等(PCR方案，方法和应用指南，1990，学术出版社)的标准PCR方法用来自宝灵格曼海姆公司的Pwo聚合酶(德国，产品描述Pwo DNA聚合酶，产品编号1 644 947)进行PCR反应。经聚合酶链反应，该引物扩增一约0.67kb的sdhA基因的内部片段。以此方式扩增的产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳证实。
用Invitrogen公司(Carlsbad,CA,USA；目录号K2700-20)的Zero BluntTM试剂盒将扩增的DNA片段连接进载体pCRBluntⅡ载体(Bemard等，(1983)，分子生物学杂志234:534-541)中。
用连接混合物电穿孔大肠杆菌菌株TOP10(Hanahan等，DNA克隆实用方案，第1卷，IRL出版社，Oxford，华盛顿特区，美国)。通过将转化混合物在补加25mg/l卡那霉素的LB琼脂(Sambrook等，分子克隆实验手册，第2版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约)上铺板而选择携带质粒的细胞。用来自Qiagen的QIAprep SpinMiniprep试剂盒从转化子分离质粒DNA，并用限制酶EcoRⅠ限制随后琼脂糖凝胶电泳(0.8％)证实。质粒命名为pCRBluntsdhAint，并示于
图1。
实施例4 sdhA基因整合诱变入菌株DSM5715中用Tauch等的电穿孔法(FEMS微生物学通信，123:343-347(1994))，将实施例3中被称为pCRBluntsdhAint的载体电穿孔进谷氨酸棒杆菌DSM5715中。菌株DSM5715的描述见EP-B-0435132。载体pCRBluntsdhAint在DSM5715中不能自行复制，且仅当其已整合入DSM5715的染色体中时存留在细胞中。将电穿孔物铺板于已补加15mg/l卡那霉素的LB琼脂(Sambrook等，分子克隆实验手册，2ndEd，冷泉港实验室出版，冷泉港，N.Y.1989)上，选择具有整合进染色体中的pCRBluntsdhAint的克隆。
为检测整合，用宝灵格曼海姆有限公司的“用于滤膜杂交的DIG系统用户指南”(曼海姆，德国，1993)中的方法，用来自宝灵格的Dig杂交试剂盒标记sdhAint片段。用Eikmanns等(微生物学140:1817-1828(1994))的方法分离潜在的整合子的染色体DNA，并分别用SphⅠ和HindⅢ限制酶酶切。得到的片段用琼脂糖凝胶电泳分离，并用来自宝灵格的Dig杂交试剂盒在68℃杂交。实施例3的质粒pCRBluntsdhAint已插入DSM5715的染色体的染色体sdhA基因中。该菌株命名为DSM5715∷pCRBluntsdhAint。
实施例5用菌株DSM5715∷pCRBluntsdhAint生产L-谷氨酸实施例4中制备的谷氨酸棒杆菌菌株DSM5715∷pCRBluntsdhAint在适于生产谷氨酸的营养培养基中培养，并确定培养物上清中的谷氨酸含量。
为此，首先在33℃在具有合适抗生素的琼脂板(具有卡那霉素(25mg/l)的脑心琼脂)上培养菌株24小时。从这些琼脂板培养物开始，接种预培养物(10ml培养基于100ml锥形瓶)。用于预培养的培养基是完全培养基CgⅢ。
培养基CgⅢNaCl 2.5g/lBacto-肽胨10g/l
Bacto-酵母膏 10g/l葡萄糖(单独高压灭菌)2％(w/v)pH值调节为pH7.4。
向此培养基中加入卡那霉素(25mg/l)。在摇床上于33℃以240rpm振荡培养预培养物16小时。从此预培养物接种主培养物，从而主培养物的起始OD(测量波长660nm)是0.1。培养基MM用作主培养物。
培养基MM:
CSL(玉米浆) 5g/lMOPS(吗啉代丙磺酸) 20g/l乙酸钠(过滤灭菌) 20g/l(NH4)2SO425g/lKH2PO40.1g/lMgSO4·7H2O 1.0g/lCaCl2·2H2O 10mg/lFeSO4·7H2O 10mg/lMnSO4·H2O 5.0mg/l生物素(过滤灭菌) 0.3mg/l硫胺素HCl(过滤灭菌) 0.2mg/l亮氨酸(过滤灭菌) 0.1g/lCaCO325g/l
用氨水将CSL,MOPS和盐溶液调至pH7并高压灭菌。然后加入无菌的底物和维生素溶液，并加入干态高压灭菌的CaCO3。
以在具有档板的100ml锥形瓶中的10ml体积进行培养，加入卡那霉素(25mg/l)。在33℃和80％大气湿度下进行培养。
24小时后，用Biomek(Beckman仪器有限公司，慕尼黑)确定在660nm测量波长的OD。用Eppendorf-BioTronik公司的氨基酸分析仪(汉堡，德国)经离子交换层析和用茚三酮检测柱后衍生化而确定形成的谷氨酸量。
所得结果示于表1。
表1
本发明包括如下附图
图1质粒pCRBluntsdhAint图。
图中所采用的缩写和符号有如下含义，所述碱基对数字是大约值。
Km卡那霉素抗性基因Zeocin:Zeocin抗性基因HindⅢ限制酶HindⅢ的酶切位点SphⅠ限制酶SphⅠ的酶切位点EcoRⅠ限制酶EcoRⅠ的酶切位点sdhAint:sdhA基因的内部片段ColEl ori大肠杆菌的质粒编码的复制起点序列表<110>德古萨-于尔斯股份公司<120>编码基因sdhA,sdhB和sdhC的新核苷酸序列<130>990170 BT<140><141><160>7<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>4080<212>DNA<213>谷氨酸棒杆菌<220><221>基因<222>(288)..(1169)<223>sdhC<220><221>基因<222>(1330)..(3207)<223>sdhA<220><221>基因<222>(3102)..(3956)<223>sdhB<400>1gtgcccggcg tggtcgggcc acatccgccc cgggaacttt ttaggcacct acggtgcaac 60tgttgggata attgtgtcac ctgcgcaaag ttgctccctg gatcggaagg ttgggctgtc 120taaacttttt ggttgatacc aaacggggtt agaaactgtt cggatcggta tcctgtgagg 180aagctcacct tggttttaga atgttgaaaa ggcctcacgt ttccgcaggt agagcacact 240caattaaatg agcgtcaaac gacaataaag taaggctatc ctaataagtg gggttttatg 300tctctaaaca gccagttggg ggtcatgggg gagcgccccg tgactggtta atgccccgat 360ctgggacgta cagtaacaac gacactggag gtgccatgac tgttagaaat cccgaccgtg 420aggcaatccg tcacggaaaa attacgacgg aggcgctgcg tgagcgtccc gcatacccga 480cctgggcaat gaagctgacc atggccatca ctggcctaat gtttggtggc ttcgttcttg 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权利要求
1.来自棒状细菌的分离的多核苷酸，其含有选自如下一组的多核苷酸序列a)与编码含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多肽的多核苷酸至少70％相同的多核苷酸，b)与编码含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的多肽的多核苷酸至少70％相同的多核苷酸，c)与编码含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的多肽的多核苷酸至少70％相同的多核苷酸，d)编码含有与SEQ ID NO:3的氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，e)编码含有与SEQ ID NO:5的氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，f)编码含有与SEQ ID NO:7的氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，g)与a),b),c),d),e)或f)的多核苷酸互补的多核苷酸，以及h)含有a),b),c),d),e)或f)的多核苷酸序列的至少15个连续核苷酸的多核苷酸。
2.权利要求1的多核苷酸，其中多核苷酸是能在棒状细菌中复制的优选地是重组的DNA。
3.权利要求1的多核苷酸，其中该多核苷酸是RNA。
4.权利要求2的多核苷酸，含有(ⅰ)SEQ ID NO:1的核苷酸序列，或(ⅱ)在遗传密码简并范围内相应于(ⅰ)序列的至少一个序列，或(ⅲ)与互补于(ⅰ)或(ⅱ)序列的序列杂交的至少一个序列，和任选地，(ⅳ)(ⅰ)中有功能的中性有义突变。
5.权利要求2的多核苷酸序列，其编码含有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的多肽。
6.含义权利要求1的特别是1h)的多核苷酸序列的载体。
7.含义权利要求6的载体的棒状细菌。
8.发酵生产L-氨基酸的方法，其特征在于进行下述步骤(a)发酵产生L-氨基酸的棒状细菌，该细菌中选自编码琥珀酸脱氢酶及其亚基A、B和C的基因的至少一个基因是弱化的，(b)在培养基或细菌细胞中积累L-氨基酸，及(c)分离L-氨基酸。
9.权利要求8的方法，特征在于所用细菌中所需的L-氨基酸生物合成途径的其它基因是额外扩增的。
10.权利要求8的方法，其特征在于所用细菌中降低L-氨基酸生成的代谢途径至少被部分抑制。
11.权利要求8的方法，其特征在于使用经质粒载体转化的菌株，且此质粒载体携带编码琥珀酸脱氢酶的基因的核苷酸序列。
12.权利要求8-11任一项的方法，其特征在于使用产生L-赖氨酸的棒状细菌。
13.权利要求9的方法，其特征在于编码二氢-2,6-吡啶二羧酸合酶的dapA基因同时过表达。
14.权利要求9的方法，其特征在于编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶的gap基因同时过表达。
15.权利要求9的方法，其特征在于编码丙酮酸羧化酶的pyc基因同时过表达。
16.权利要求9的方法，其特征在于编码苹果酸醌氧化还原酶的mqo基因同时过表达。
17.权利要求9的方法，其特征在于编码赖氨酸输出蛋白的lysE基因同时过表达。
18.权利要求10的方法，其特征在于编码葡萄糖-6-磷酸异构酶的pgi基因同时弱化。
19.权利要求10的方法，其特征在于编码烯醇丙酮酸磷酸羧激酶的pck基因同时弱化。
全文摘要
分离的多核苷酸,含有选自如下的多核苷酸序列:a)与编码含SEQID NO:3或SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7的氨基酸序列的多肽的多核苷酸至少70%相同的多核苷酸,b)编码含与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7的序列至少70%相同的氨基酸序列的多肽的多核苷酸,c)与a)或b)的多核苷酸互补的多核苷酸,和d)含a)或b)序列的至少15个连续核苷酸的多核苷酸。还提供了经弱化编码琥珀酸脱氢酶亚基A、B或C的sdhA,sdhB和sdhC基因发酵生产L－氨基酸的方法。
文档编号C12N9/02GK1312374SQ0013608
公开日2001年9月12日 申请日期2000年12月8日 优先权日1999年12月10日
发明者贝蒂娜·默克尔, 瓦尔特·普费弗勒, 阿希姆·马克思 申请人:德古萨－于尔斯股份公司