中短片段脱氧核糖核酸芯片及其制备方法

专利名称：中短片段脱氧核糖核酸芯片及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种生物学芯片领域，尤其涉及一种中短片段脱氧核糖核酸芯 片。本发明还涉及制备所述中短片段脱氧核糖核酸芯片的方法。
背景技术：
20世纪90年代中期，美国Affymetrix公司等发明的高密度DNA芯片(DNA chip),即又称基因芯片(Gene Chip),它是寡聚核苷酸(Oligonucleotide) 探针的高密度阵列，是在一基底上原位合成小片段DNA芯片，参见美国第5， 445， 934号专利，这一类DNA芯片以玻璃或硅片为基底，将约l平方厘米的基底划分为 成千上万个方格，然后覆盖一层光敏基团。在选定的方格内，进行光照后去掉 光敏感基团对此点的保护，然后加上带有相同光敏基因的核苷酸进行原位合成； 重复以上操作，即可任意定位合成所需的寡聚核苷酸系列直至制成整个芯片。 参见美国第5， 571639号专利，核苷酸阵列的制作也可利用计算机的参与来完成。 由此可见，上述专利所公开的技术方案，其优点是可合成高密度的寡聚核苷酸 (小片段DNA,或称DNA探针)阵列，例如，己达到40万种阵列芯片，可以最大 程度地体现平行处理的原则，因此，它获得的信息也很丰富。但是它也有不足 之处，主要就是小片段DNA芯片的探针核苷酸对只有25个，探测一个基因的灵敏
度相对较低，可能产生假阴性。
中国发明专利说明书CN1109111C (公告日2003年5月21日)公开了探针长度 为1 0 K 2 0 0 K核苷酸对的大片段脱氧核糖核酸芯片的制备方法。该专利 的出现很好的克服了寡核苷酸小片段DNA探针灵敏度低的缺陷，但由于探针长度很长，导致相对来说，存在特异性较差的特点，可能产生假阳性。

发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种灵敏度和特异性相对都高的DNA探针 芯片。为此，本发明还提供制备所述中短片段脱氧核糖核酸芯片的方法。
为解决上述技术问题，本发明提供一种中短片段脱氧核糖核酸芯片，由中 短片段脱氧核糖核酸序列点样在经处理的固相支持物表面组成，所述中短片段 脱氧核糖核酸序列的片段长度为100 200bp。
本发明制备中短片段脱氧核糖核酸芯片的方法，其包括如下步骤a、通过 RefSeq数据库获得目前已知所有基因的序列，根据这些序列设计相应的PCR引 物，并保证读码框的正确度，即翻译出的多肽序列是相应完整蛋白的一部分；b、 根据基因不同的功能分类，依次合成某一类别中的所有引物序列，然后通过PCR 扩增获得探针序列，并克隆至原核质粒载体中；c、制备包含某一个或数个类别 所有探针的小芯片，所述芯片可以推向市场进行销售；d、等到扩增完成的基因 数达到一万以上的时候，即可制备一张全基因芯片，并随着获得的片段增加而 使芯片上包含的探针数不断增多。
本发明由于提供了中短片段脱氧核糖核酸芯片，同时所述中短片段脱氧核 糖核酸能通过PCR过程来制备，同时提高了灵敏度和特异性，同时增加了中短片 段脱氧核糖核酸选择的灵活性，并且在进行这类芯片生产制造过程中同时可获 得较多的副产品，例如这些探针可用于表达多肽，用于制备相应的抗体；可作 为探针用于原位杂交；扩增这些短片段产物的PCR引物可用于定量PCR的反应来 检测表达谱芯片结果，这些都是以往的DNA芯片所没有的优质特征。


图l是本发明中短片段脱氧核糖核酸芯片制备过程以及探针应用的流程图。具休实施方式下面结合附图对本发明作进一步详细的说明。如图l所示为本发明的中短片段脱氧核糖核酸芯片制备过程的流程图，包括如下步骤设计引物，设计得到的PCR引物可用于定量PCR;从构建好的cDNA文 库中通过设计好的PCR引物预扩增中短片段PCR产物，预扩增后的片段克隆至原 核质粒载体中，并用测序方法进行验证，看是否是目的片段；验证之后可以在同等条件下进行正式PCR扩增；得到的PCR产物可以用于芯片制造，同时也可以应用于原位杂交等。克隆在质粒载体中的片段可以亚克隆至表达载体中，进行 多肽原核表达。本发明所采用的中短片段脱氧核糖核酸由抽提自人类、小鼠、及大鼠的血液中通过PCR反应获得。实施例一 两种不同芯片平台灵敏度的比较我们比较两种不同长度探针，A芯片探针长度25个核苷酸，B芯片60个核苷 酸。下表计算的是四份样品在不同平台中的检出率。两种不同芯片平台的检出率<table>table see original document page 6</column></row><table>从结果中我们可以看出，A平台(探针短)的检出率低，B平台(探针长) 的检出率高。我们使用RT-qPCR来验证不同平台的灵敏度。 一般认为信号强度与探针的长 短有关，探针在一定范围之内，随着探针长度的增加，信号值也会增加，而超 过一定的长度以后，信号值的增加就不明显了。 (Lockhart D丄Dong H， ByrneMC， et al. Expression monitoring by hybridization to high-density oligonucleotide arrays. Nat Biotechnol. 1996 14(13) : <table>table see original document page 7</column></row><table>以上两种芯片均为原位合成寡核苷酸芯片，再延长探针长度在技术上比较难完成。所以我们决定用PCR方法扩增。另外，探针长度越长，检测的特异性相对就越低，也就是说如果探针长度 比较长，而耙基因的序列和干扰序列之间同源性又比较高的话，通过杂交获得 的结果是耙序列和干扰序列共同产生的信号。现在使用的cDNA芯片由于探针长 度比较长(O. 5-lkb)就存在这个问题(A Comparison of cDNA， Oligonucleotide, and Affymetrix GeneChip Gene Expression Microarray Platforms J Biomol Tech.15(4) :276-84 )。实施例二 cDNA文库构建用MRC的TRIzol试剂盒，常规方法提取RNA。使用QIAGEN公司01igotex mRNA Spin-Column kit在获得高质量的mRNA后，用StmtaScript RT反转录酶 linker-primer引导下合成cDNA第一链，DNA聚合酶合成cDNA第二链；然后补平cDNA中缺口，连接EcoR I接头，EcoR I末端磷酸化X， ho I消化，凝胶装柱收集样 品组分；cDNA样品加工后cDNA与Uni-ZAP XR载体连接，制备宿主菌使用Gigapack III Gold Packaging Extract体外包装，检测滴度，体外切割，扩增cDNA文库、对 建立的cDNA文库进行鉴定。 实施例三PC財广增设计寡核苷酸引物，然后从cDNA文库中PCR扩增目的基因。在冰浴中，按以 下次序将各成分加入一无菌O. 5ml离心管中。10XPCR buffer 5u 1dNTP mix (2mM) 4ii 1引物l (10pM) 2ul引物2 (10pM) 2u 1Taq酶 (2U/ul) 1 w 1腿模板(50ng-1 u g/ P 1) 1 u 1加ddH20至 50 u 1上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩增。 一般在94'C预变性5min， 进入循环扩增阶段94°C 40s — 60°C 30s — 72°C 30s，循环30-35次，最后 在72。C保温3min。结束反应，PCR产物放置于4。C待电泳检测或-20。C长期保存。实施例四克隆测序l.感受态细胞的大量制备将细菌转移到一个无菌聚丙烯管中，在冰上放置10分钟，使培养物冷却至0 °C;于4X:以4000转/分离心10分钟，以回收细胞；倒出培养液，将管倒置1分 钟以使最后残留的痕量培养液流尽；以10ml用冰预冷的0.1mol/L CaC12重悬每 份沉淀；于4"C以4000转/分离心10分钟，以回收细胞；倒出培养液，将管倒置1分钟以使最后残留的痕量培养液流尽；每50ml初始培养物用2ml用冰预冷的 0. lmol/L CaC12重悬每份细胞沉淀。2. 体外连接将PCR产物l. 5ul (约50ng)与pGEM-T载体分子，T4DNA连接酶4 。C冰箱中连接 过夜。3. 感受态细胞的转化感受态细胞悬液中加入5ul的连接产物;将管放到42"C的水浴锅中放置90秒 移到冰中，使细胞冷却1一2分钟；每管加800ul LB培养基，37。C摇床上，温 育45分钟；4000转/min离心lmin，然后吸掉800ul的表层液体，加入Xgal50ul， 加入IPTG5ul;将200ul已转化的感受态细胞转移到含氨苄的琼脂培养基上；平 板置于室温至液体被吸收,倒置平皿，于37i:培养，12 — 16小时后出现菌落。菌 落PCR，测序。4. 兰白斑筛选菌落，PCR验证,3700测序实施例五多肽原核表达1. 制备pET载体用限制性酶消化，去磷酸化，或使用LIC载体；胶纯化(或使用LIC载体)。2. 制备插入DNA限制性消化实施例四制备的质粒或制备LIC粘端；胶纯化。3. 将插入片段克隆到pET载体上插入片段与pET载体连接或退火；转化非表达型宿主菌(例如NovaBlue); 筛选阳性克隆；菌落PCR，制备质粒DNA，通过测序确定阅读框，或进行体外转 录/翻译。4. 转化表达宿主菌转化带有T7 RNA聚合酶基因的菌株(IDE3溶原菌lysogen)或以1CE6感染非 DE3宿主菌。5. 诱导/优化表达目的多肽检测质粒稳定性(选择性操作)；确定细胞及亚细胞组分，表达时间和温度 条件；分析蛋白溶解性及活性；用SDS-PAGE、 Western印迹、定量分析，确定目 的多肽。6. 放大试验纯化目的多肽放大培养；制备粗提物；亲和纯化；切去融合标签并去除蛋白酶。 实施例六原位杂交1. 载玻片和盖玻片预处理1) 用于检测RNA的载玻片的处理用O. lmol/L HCL洗载玻片20分钟，再用无水乙醇洗数次使其千燥;在3XSSC、 0.02%FicoLL400、 0. 02%聚乙稀吡咯烷酮(PVP)溶液中，65。C处理2小时；固定在 乙醇/乙酸(3:l V/V)20分钟，180。C烘烤2小时。2) 用于检测DNA的载玻片的处理。以TESPA (three-amino-propyl-triethoxy-silane)涂载玻片。3) 对于盖玻片于O. lmol/L HCL中浸泡20分钟，用无水乙醇洗，千燥后用 二甲基氯化硅硅化，180。C烤2小时。2. 组织细胞固定1) 用含有0.02y。EDTA的PBS洗涤细胞，于O. 1%胰蛋白酶消化，收获细胞计数， 涂载玻片上。2) 若检测RNA,固定于4W多聚甲醛pH7.0，在4。C下放60分钟，PBS洗5分钟， 系列乙醇脱水干燥，-2(TC保存。3) 若检测DNA，固定在4%多聚甲醛16 24小时，0. lmol/L Tris-HCL pH7. 4 洗2X5分钟，浸泡在下述溶液中2 X 5分钟0. 25%(v/v)Tritonx-100; 0. 25%(v/v)Nonidet P40; 0. lmol/L Tris-HCL pH7. 4;再用O. lmol/L Tris-HCL pH7.4洗2X5分钟。4) 在100tig/ml蛋白酶K， 50腿ol/LTris-HCLra8.0, 5腿ol/L EDTA溶液中， 37。C处理10分钟，再用含有甘氨酸的O. lmol/L Tris-HCL PH7.4洗2X5分钟。5) 在2(m(v/v)乙酸中40。C处理15分钟，0. lmol/L Tris-HCL PH7.4洗2X5分钟。3.地高辛标记的DNA探针原位杂交1) 将140ng/mL地高辛标记的探针加到杂交缓冲液中，每张滴加50 u L杂交缓 冲液(2XSSC、 5% (W/V)磷酸葡聚糖、50%去离子甲酰胺)，用盖玻片盖住，四 周封以树胶。2) 将目的DNA和DNA探针放入9(TC，进行变性10分钟，双链打开，42°C，在 潮湿环境中杂交16小时。3) 去除盖玻片，按下列条件洗涤2XSSC室温10分钟一2XSSC室温10分钟 —0. 2XSSC室温10分钟一0. 2XSSC 42°C 20分钟。4) 再按以下方法处理在缓冲液I (0. lmol/L Tris-HCL pH7. 5、 0. 5mol/L Nacl) 中洗30分钟;含有20%羊血清的缓冲液I中洗30分钟;滴加1:5000标有碱性磷酸酶 或辣根过氧化物酶的地高辛抗体，在装有缓冲液I的湿盒中温育20分钟;在缓冲 液I中洗2X20分钟；在缓冲液I1(0. lmol/L Tris-HCL pH9. 5、 0. lmol/L Nacl、 5mmol/L MgC12)中洗60分钟;加入下述溶液缓冲液II、 0. 33mg/mL四唑氮兰、 0. 17mg/mL 5-bromo-4-Chlora-3-indoly' phosphate;将切片浸于20mmo1/1 Tris—HCL pH7. 5， 5mmol/L EDTA终止反应。5)用底物显色、复染、脱水、封片，按免疫组化常规法进行。
权利要求
1. 一种中短片段脱氧核糖核酸芯片，由中短片段DNA序列点样在经处理的固相支持物表面组成，其特征在于所述中短片段脱氧核糖核酸序列的片段长度为100～200bp。
2、 如权利要求l所述的中短片段脱氧核糖核酸芯片，其特征在于所述中短片段脱氧核糖核酸序列的片段长度为120 160bp。
3、 如权利要求1或2所述的中短片段脱氧核糖核酸芯片，其特征在于所述中短片段脱氧核糖核酸用于制备基因表达谱芯片。
4、 如权利要求1或2所述的中短片段脱氧核糖核酸芯片，其特征在于所述 中短片段脱氧核糖核酸经标记以后作为原位杂交的探针。
5、 如权利要求1或2所述的中短片段脱氧核糖核酸芯片，其特征在于扩增所述中短片段脱氧核糖核酸的引物用于基因表达谱芯片定量PCR的验证。
6、 如权利要求1或2所述的中短片段脱氧核糖核酸芯片，其特征在于所述中短片段脱氧核糖核酸具有正确的读框，用于表达多肽。
7、 如权利要求1或2所述的中短片段脱氧核糖核酸芯片，其特征在于所述中短片段脱氧核糖核酸表达产生的多肽用于抗体的制备。
8、 如权利要求1或2所述的中短片段脱氧核糖核酸芯片，其特征在于所述中短片段脱氧核糖核酸片段来自于人类、小鼠、和大鼠。
9、 制备中短片段脱氧核糖核酸芯片的方法，其特征在于，包括如下步骤 a、 通过RefSeq数据库获得目前已知所有基因的序列，根据这些序列设计相 应的PCR引物，并保证读码框的正确度，即翻译出的多肽序列是相应完整蛋白的 一部分；b、 根据基因不同的功能分类，依次合成某一类别中的所有引物序列，然后通过PCR扩增获得探针序列，并克隆至原核质粒载体中；C、制备包含某一个或数个类别所有探针的芯片，所述芯片可以推向市场进行销售；d、等到扩增完成的基因数达到一万以上的时候，即可制备一张全基因芯片， 并随着获得的片段增加而使芯片上包含的探针数不断增多。
全文摘要
本发明公开了一种中短片段脱氧核糖核酸芯片及其制备方法。本发明的DNA芯片通过点样方式制备，其每一个探针DNA长度为100bp～200bp核苷酸对。本发明的灵敏度和特异性相比同类芯片更高并能够对中短片段的寡核苷酸探针进行其它多用途利用。
文档编号C12Q1/68GK101245370SQ20071003748
公开日2008年8月20日 申请日期2007年2月13日 优先权日2007年2月13日
发明者孟宪欣, 翼 张, 肖华胜, 韩峻松 申请人:上海生物芯片有限公司